兩株P(guān)GPR菌株的花生定殖及對根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

李穎 龍長梅 蔣標(biāo) 韓麗珍

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽550025）

植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指生活在植物根際、對其生長有益的微生物菌群。相比傳統(tǒng)化肥施用造成的環(huán)境污染和隱患，利用PGPR制備的微生物菌劑具有更強的環(huán)境友好性及對土壤肥力的持續(xù)性改善作用，已愈加受到大家的關(guān)注［1］，因此深入探討PGPR對植物的促生機制有利于合理拓展其應(yīng)用范圍。目前已有芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）、固氮菌屬（Azotobacter sp.）等多個種屬的PGPR菌株被報道，它們通常具有溶磷、固氮、產(chǎn)生植物激素、分泌鐵載體等多種促生特性，可以促進(jìn)多種作物的生長［2］。然而，并非具促生特性的PGPR菌株均可對多種植物發(fā)揮有益作用，其在宿主植物根際的有效定殖對于發(fā)展穩(wěn)定的PGPR-宿主植物相互關(guān)系是關(guān)鍵的步驟，根際定殖的能力是田間應(yīng)用PGPR菌株必須考慮的因素［3］。然而也有報道一些分離自根際的菌株可以促進(jìn)植物生長，但并不能有效地在根際或植物組織中定殖［4］。因而，為了更好地理解PGPR的生態(tài)學(xué)功能、解析其對植物的根本促生效應(yīng)，對于該菌株進(jìn)入土壤后如何與植物互作，包括根際或根部組織的定殖及對本土根際生態(tài)影響的研究非常必要。

對于定殖的研究主要采用抗生素標(biāo)記、熒光標(biāo)記或掃描電鏡觀察的方法?？股貥?biāo)記法利用逐步提升抗生素濃度的誘變手段，或?qū)肟股鼗颢@得對其較高抗性的突變株，通過對數(shù)量的監(jiān)測可以較好地反應(yīng)菌株的定殖情況［5］；Pathania等［6］發(fā)現(xiàn)利福平標(biāo)記Bacillus sp. MT7菌株在番茄根尖的定殖數(shù)量更高。利用綠色熒光蛋白標(biāo)記則可以在熒光顯微鏡下直觀地觀察到菌株的定殖部位，Zhai等［7］的研究表明GFP標(biāo)記的沼澤紅假單胞菌GJ-22菌株能定殖于煙草和水稻的根部和葉面。而利用掃描電鏡也已成功觀察到假單胞菌屬菌株在葡萄根部的定殖［8］。聯(lián)合掃描電鏡、GFP標(biāo)記及抗生素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行PGPR菌株定殖規(guī)律的研究，可以更清晰地揭示促生菌長期穩(wěn)定定殖的能力。

土壤微生物群落多樣性與其生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)，在維持土壤肥力和生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用，也是提高土壤生產(chǎn)力和可持續(xù)性的基礎(chǔ)［9］。當(dāng)PGPR引入根際土壤時，可能會影響根際土壤微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)，參與植物與土壤的相互作用，從而影響植物的生長和產(chǎn)量［10］，因此通過分析PGPR對土壤微生物群落多樣性的影響也可以反映PGPR與植物的互作關(guān)系及其在植物促生中發(fā)揮的作用［11］。

花生是世界范圍內(nèi)種植的5種主要油料作物之一，我國花生的種植面積位居世界第二［12］。作為重要的經(jīng)濟作物和油料作物，利用環(huán)境友好型的微生物菌劑提高花生產(chǎn)量是有效且可行的辦法。項目組在前期研究中分離篩選到2株具有多重促生特性的PGPR菌株，即耐酪氨酸束村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens）P9和吡咯伯克霍爾德氏 菌（Burkholderia pyrrocinia）P10［13-14］；其 單 接種或混合菌液的接種均可以明顯促進(jìn)花生幼苗的生長，根際土壤的細(xì)菌總數(shù)及固氮、溶磷等功能菌群數(shù)明顯增多，土壤酶活性提高，植株及土壤的營養(yǎng)指標(biāo)有所提升［15］；但2個菌株進(jìn)入土壤后如何發(fā)揮對花生的促生影響尚未有更深入的解析。本研究擬通過GFP標(biāo)記、利福平標(biāo)記法聯(lián)合掃描電鏡以探討2個PGPR菌株在花生幼苗不同組織中的定殖規(guī)律，通過分析菌株接種對花生根際土壤細(xì)菌多樣性的影響，從菌株本身的定殖及影響微生物群落結(jié)構(gòu)的角度、綜合解析P9和P10菌株施加到土壤后對花生發(fā)揮的促生機理，并為下一步研制微生物菌劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

耐酪氨酸束村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens）P9和吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）P10為本項目組前期分離篩選的PGPR菌株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號分別為CCTCCAA 2020052和CCTCCM 2019172。攜帶GFP基因及氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pHT315-GFP由貴州省農(nóng)科院劉作易教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 GFP標(biāo)記菌株的獲得及花生根部定殖部位的觀察 將過夜活化的P9、P10菌液轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（寶生物，大連）制備P9和P10感受態(tài)細(xì)胞；以質(zhì)粒提取試劑盒（天根，北京）提取pHT315-GFP質(zhì)粒；在感受態(tài)細(xì)胞中加入適量質(zhì)?；靹蚝蟆⒁詿峒しㄟM(jìn)行轉(zhuǎn)化，并涂布于含Amp的LB平板上培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于DMIL熒光顯微鏡下（LEICA，德國）觀察標(biāo)記菌株的發(fā)光情況；根據(jù)GFP基因序列設(shè)計引 物 對（GFP-F：5'-TTGCTTCGGCTCGTATGTT-3'，GFP-D ：5'-GTGTTCAATGCTTTGCGAGAT-3'），利用菌落PCR及測序進(jìn)一步驗證，其中PCR擴增條件為：94℃ 4 min ；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，34 cycles；72℃ 3 min。

花生種子經(jīng)20%過氧化氫20 min消毒、無菌水沖洗后，放置于裝有濕潤濾紙的無菌平皿中，28℃條件下3 d萌發(fā)后，幼苗移栽到含200 mL 1/2 MS培養(yǎng)液的組培瓶中28℃培育，待長至2-3 cm高度后，加入50 mL GFP標(biāo)記菌株的活化菌液，以等量無菌水作對照。3 d后取花生的根部徒手切成1 cm左右的小段、以0.05%龍膽紫染色2 min、蒸餾水清洗制片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 2株P(guān)GPR菌株的利福平抗性標(biāo)記及遺傳穩(wěn)定性分析 將過夜活化的P9、P10菌液轉(zhuǎn)接至含10 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中、30℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，逐步提高培養(yǎng)液中利福平的濃度對菌株進(jìn)行馴化，獲得可在含300 μg/mL利福平的LB培養(yǎng)基中生長良好的抗性菌株P(guān)9r、P10r。將抗性菌株在LB斜面上連續(xù)傳代20次后，挑取單菌落于含300 μg/mL利福平的LB平板上培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)、爬片法制片后經(jīng)Regulus 8100掃描電鏡（HITACHI，日本）觀察細(xì)胞形態(tài)。將2株原始菌株及馴化獲得的利福平抗性菌株活化后，分別轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基及含300 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中、定時測定菌體濃度并繪制生長曲線；P10菌株通過測定OD600值表征菌體生長量，而P9菌株由于在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時呈小菌絲球狀懸浮于其中、采用平板稀釋涂布法進(jìn)行活菌計數(shù)以表征菌體濃度。

1.2.3 利福平抗性菌株的促生特性分析 以鉬藍(lán)比色法測定培養(yǎng)液的可溶磷含量［16］、以Salkowski法測定IAA含量［17］、以CAS法測定鐵載體相對含量、以2，4-二硝基苯肼法測定粗酶液中α-酮丁酸含量進(jìn)行ACC脫氨酶活性的測定［18］，對利福平抗性的P9r和P10r進(jìn)行溶磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體及分泌ACC脫氨酶活性等促生特性的測定。

1.2.4 利福平抗性菌株在土壤及花生不同組織定殖動態(tài)的追蹤 花生種子消毒萌發(fā)后、移栽到含300 g滅菌土壤的育苗盆中常規(guī)培育，一周后澆菌處理。盆栽實驗設(shè)CK、P9r接種組、P10r接種組、混合菌株（P9r+P10r）接種組，每個處理3個重復(fù)，每盆用灌根法接種75 mL菌液（濃度為108CFU/mL），混合接種組為P9r和P10r的等量混合菌液，CK組澆等量無菌水。分別于灌根后的第0、1、3、5、7、9、11、15、20、25、30天時采集土壤及植株的根、莖進(jìn)行菌落數(shù)測定；其中根、莖樣本經(jīng)1%次氯酸鈉消毒30 s、75%酒精30 s、無菌水洗滌后進(jìn)行后續(xù)測定。另外，接種3 d時，切取根莖材料經(jīng)掃描電鏡觀察菌株定殖；澆菌30 d后對花生的生長指標(biāo)及葉綠素含量進(jìn)行測定。

1.2.5 非滅菌土壤條件下2株P(guān)GPR對花生根際土壤細(xì)菌多樣性的影響 盆栽實驗設(shè)CK組、P9接種組、P10接種組、混合菌株（P9+P10）接種組，每組6個重復(fù)，取活化菌液灌根接種于種植花生幼苗的未滅菌土壤中，常規(guī)條件下培育30 d后、以抖根法采集根際土壤進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析（北京諾禾致源生物信息科技有限公司）。經(jīng)PowerSoil? DNA Isolate Kit（Mobio，USA）提取根際土壤DNA、PCR擴增細(xì)菌16S rRNA全長基因，利用PacBio平臺進(jìn)行雙端測序。Raw data經(jīng)校正、SSR過濾、去除嵌合體獲得Clean Reads。以97%的一致性進(jìn)行OTUs聚類，利用Mothur方法與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行物種注釋分析，使用MUSCLE軟件進(jìn)行快速多序列比對。結(jié)合R語言相關(guān)軟件繪制物種多樣性以及群落結(jié)構(gòu)組分圖和熱圖。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，獨立樣本t檢驗和Pearson相關(guān)性分析；并采用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)并制圖。

2 結(jié)果

2.1 2株P(guān)GPR菌株的GFP標(biāo)記及GFP標(biāo)記菌株在花生根部的定殖

為了明確2個PGPR菌株是否可以在花生根部定殖，首先進(jìn)行了GFP標(biāo)記菌株的構(gòu)建。將pHT-315-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到P9和P10菌株后，可看到2個菌株在熒光顯微鏡下均發(fā)出穩(wěn)定的綠色熒光。利用GFP-F/D引物對進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的菌落PCR擴增、電泳后可見轉(zhuǎn)化的P9和P10菌株均擴增出約600 bp大小的片段、與預(yù)計目標(biāo)產(chǎn)物（603 bp）大小相符（圖1），測序結(jié)果證實為GFP標(biāo)記菌株。

圖1 GFP轉(zhuǎn)化菌株陽性轉(zhuǎn)化子的PCR產(chǎn)物驗證Fig.1 PCR verification of positive transformants of GFP-labeled strains

取菌液作用3 d的花生根部進(jìn)行觀察，與CK組相比，可見P9、P10接菌處理花生的根尖及分生區(qū)中均有帶綠色熒光標(biāo)記的大量菌株定殖（圖2）。

圖2 兩株GFP標(biāo)記的PGPR菌株在花生根尖的分布Fig.2 Distribution of two GFP-labeled PGPR strains on the root tips of peanut

2.2 利福平抗性菌株的獲得及生長促生特性分析

為了進(jìn)一步分析2株P(guān)GPR菌株在進(jìn)入花生組織后的定殖動態(tài)，對其進(jìn)行了利福平標(biāo)記。在獲得抗300 μg/mL利福平的P9r和P10r菌株后，將抗性菌株在無壓力條件下傳代20代，2個菌株仍可在相同濃度利福平的LB培養(yǎng)基上生長良好，其中P9r菌株呈淡黃色、中央凸起、表面粗糙干燥的放射狀較大菌落，P10r為無色略透明、濕潤、中央突起、邊緣整齊的圓形菌落；掃描電鏡觀察到P9r為長桿狀、菌體略彎曲，P10r呈短桿狀（圖3）；抗性菌株的菌落和鏡下形態(tài)均與原始菌株P(guān)9、P10一致。在含300 μg/mL利福平的LB培養(yǎng)基中，P9r的生長曲線與原始菌株在LB培養(yǎng)基中的生長一致；而P10r在利福平抗性培養(yǎng)基中的最高生長量雖略低于LB培養(yǎng)基中的P10菌株，但其生長趨勢基本相同（圖4）；表明2株利福平抗性菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖3 兩株利福平標(biāo)記PGPR菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Colony morphology and cell morphology of two rifampicin-labeled PGPR strains

圖4 兩株P(guān)GPR菌株和利福平標(biāo)記菌株的生長曲線Fig. 4 Growth curves of two PGPR strains and their rifampicin-labeled strains

馴化獲得的利福平抗性菌株P(guān)9r和P10r均表現(xiàn)出優(yōu)良的溶磷性、產(chǎn)IAA、分泌鐵載體及ACC脫氨酶的能力，且與原始菌株的促生特性基本一致（表1），進(jìn)一步表明馴化獲得的利福平抗性菌株具有遺傳穩(wěn)定的生理特性。

表1 兩株P(guān)GPR菌株和利福平標(biāo)記菌株的促生特性Table 1 Growth-promoting characteristics of two PGPR strains and their rifampicin-labeled strains

2.3 兩株利福平標(biāo)記PGPR菌株在花生根圍土壤及不同組織的定殖

在灌根處理1 d后，P9r、P10r及混合接種組的土壤、花生的根及莖中均監(jiān)測到菌的定殖；且隨著時間推移，接菌處理組呈現(xiàn)出相似的定殖動態(tài)變化，土壤中的活菌呈緩慢下降，至30 d仍可達(dá)104CFU/g數(shù)量級；幼苗的根及莖中的活菌呈逐漸上升至峰值并緩慢下降的趨勢，至30 d時，P9r的活菌 數(shù) 為（1.08×104）CFU/g，P10r為（5.33×104）CFU/g。其中，澆菌20 d后，P9r在根、莖中的定殖達(dá)到最高值，分別為（1.4×105）CFU/g與（1.1×105）CFU/g；P10r在根的定殖峰值為澆菌15 d（2.5×105CFU/g）、而莖的定殖峰值出現(xiàn)在澆菌20 d（1.37×105CFU/g）；混合菌株的定殖動態(tài)變化與P10r相似（圖5），且在同一時間點的活菌計數(shù)時，均表現(xiàn)出P10r數(shù)量高于P9r，表明混合接種狀況下P10r的競爭定殖能力更強。澆菌處理3 d后取幼苗組織進(jìn)行掃描電鏡觀察，與未接種組的幼苗相比，接種P9r、P10r及混合菌液的花生根、莖表面均有與其純培養(yǎng)物相似形態(tài)的菌附著；而且，在混合菌液接種花生的根、莖視野中，也可看到短桿狀P10形態(tài)的菌體多于長桿狀P9形態(tài)的菌體（圖6）。

圖5 兩株利福平標(biāo)記PGPR菌株在花生土壤及根、莖中的定殖動態(tài)Fig.5 Colonization dynamics of two rifampicin-labeled PGPR strains in peanut soils，roots and stems

圖6 掃描電鏡觀察兩株利福平標(biāo)記菌株在花生根、莖表面的定殖Fig.6 Colonizaiton of two rifampicin-labeled strains on root and stem surface observed by scanning electron microscope

2.4 兩株P(guān)GPR菌株對花生生長的影響

接菌處理30 d后測定花生幼苗的生長指標(biāo)，結(jié)果表明（表2），與CK相比，無論是利福平抗性的P9、P10及混合接種處理，亦或是原始菌株的接菌處理，均可以顯著提高幼苗的鮮重、株高及根長（P＜0.05）、葉綠素含量也有不同程度提高；而且沒有標(biāo)記的原始菌株對花生的促生作用更為明顯；此外，混合菌株處理組較單一菌株的接種處理對植株有更好的促生影響，呈現(xiàn)出混合菌株一定的協(xié)同增效作用。

表2 兩株利福平標(biāo)記菌株及PGPR菌株對花生生長的影響Table 2 Effects of two rifampicin-labeled and their original PGPR strains on the growth of peanuts

2.5 兩株P(guān)GPR菌株對非滅菌土花生根際細(xì)菌多樣性的影響

2.5.1 花生根際土壤Alpha多樣性和Beta多樣性分析 對花生根際土壤樣本進(jìn)行16S rRNA全長測序分析細(xì)菌群落的多樣性，通過Barcode識別后共獲得71 056條Raw data，過濾后共獲得高質(zhì)量的細(xì)菌有效序列68 690條（96.67%），平均每個樣本5 724條，樣本平均序列長度為1 452 bp。對樣本進(jìn)行Alpha多樣性和Beta多樣性分析，Shannon稀釋曲線顯示曲線趨于平緩，樣本測序量已飽和，足以反映樣本中的絕大多數(shù)物種信息；PCA分析結(jié)果表明，3個接種處理組的細(xì)菌群落相似性更高，且與對照組存在一定程度的差異（圖7）。

圖7 花生根際土壤多樣本的香農(nóng)曲線和PCA分析Fig.7 Multi-samples Shannon curves and principal component analysis（PCA）of bacterial communities in peanut rhizosphere soil

2.5.2 花生根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析 選取相對豐度排名前10的物種，從門水平上分析花生根際土壤組成，前10的物種分別為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidia）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）、Unidentified bacteria、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Candidatus_Pacebacteria， 其中變形菌門及擬桿菌門為花生根際土壤的優(yōu)勢菌群（占細(xì)菌群落的72.95%-75.74%）。相對于CK，3個接種組的變形菌門、硝化螺菌門豐度略有降低，擬桿菌門及厚壁菌門的豐度略微增高（圖8）。

在綱水平上，接菌處理組的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和硝化螺菌綱（Nitrospira）的豐度較CK有所減少，且δ-變形菌綱的豐度顯著降低（P＜0.05），而擬桿菌綱（Bacteroidia）、芽孢桿菌綱（Bacilli）的豐度呈不同程度增加。目水平上的進(jìn)一步分析顯示，接菌處理組的黃單胞菌目（Xanthomonadales）豐度有明顯降低，噬幾丁質(zhì)菌目（Chitinophagales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、鏈霉菌目（Streptomycetales）和浮霉菌目（Planctomycetales）的豐度有不同程度增加?？频乃缴戏治?，黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）的相對豐度值分別比CK組降低了20.80%、5.61%、18.52%；噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）的相對豐度值分別增加了12.10%、6.77%、11.56%，是豐度值變化較大的類群。此外，拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、鏈霉菌科（Streptomycetaceae）的豐度均大于CK組，而鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）的豐度低于后者。

在相對豐度排名前30的屬中，溶桿菌屬（Lysobacter）在P9、P10、P9+P10接菌處理組中的相對豐度顯著降低（P＜0.05），無色桿菌屬（Achromobacter）、假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）、Sphingoaurantiacus、unidentified_Acidobacteria的豐度較CK略有降低；而 Flavihumibacter、unidentified_Rhizobiaceae的相對豐度值顯著增加（P＜0.05）；Ramlibacter、微枝形桿菌屬（Microvirga）、Stenotrophobacter、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Dyella、鏈霉菌屬（Streptomyces）、小梨形菌屬（Pirellula）等的豐度較CK有不同程度增加（圖8）。此外，僅在P9處理組中檢測到有束村氏菌科（Tsukamurellaceae）、束村氏菌屬（Tsukamurella）的存在，其相對豐度值為0.0542%，而種水平上也有相應(yīng)的Tsukamurella_tyrosinosolvens存在，與P9菌株為同一個種。

圖8 不同處理組花生根際土壤細(xì)菌群落在門水平和屬水平上的相對豐度Fig. 8 Relative abundances of bacteria communities at phy-lum and genus level in rhizosphere soils of different treated peanuts

3 討論

PGPR可以通過直接與間接作用對植物產(chǎn)生有益影響，而這些作用方式的關(guān)鍵是PGPR在植株的定殖［19］。PGPR菌株的定殖能力是發(fā)揮促生作用重要的影響因素，為競爭根系分泌物中的營養(yǎng)物質(zhì)，PGPR應(yīng)高效定殖于植物，才能更好地發(fā)揮作用［20］。

當(dāng)PGPR施加到土壤中后，是否具有較強的競爭性并能存活是第一個問題。Coy等［21］報道利福平標(biāo)記的芽孢桿菌屬菌株可以定殖在狗牙根根圍土壤中，但在4周后活菌數(shù)下降明顯。Mirzaei等［22］認(rèn)為菌株的有效定殖不僅是指其可以在植物根際生存，而且還應(yīng)該可以在新生根中生長和繁殖。有報道進(jìn)入土壤中的解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）UCMB5113菌株被觀察到黏附于擬南芥根部［23］；熒光假單胞菌（P. fluorescens）Ps006和B. amyloliquefaciens Bs006可以定殖和進(jìn)入香蕉根表面，且根部有Bs006細(xì)菌細(xì)胞團的形成［24］。細(xì)菌細(xì)胞必須要首先進(jìn)入植物組織增殖，方能發(fā)揮對植株的有益影響。伯克霍爾德氏菌屬PsJN菌株首先定植于葡萄根表面、進(jìn)入內(nèi)生根并蔓延至葡萄花序莖及花梗，然后通過木質(zhì)部維管束蔓延至未成熟的漿果［25］；Paenibacillus jamilae QHZ11 可以進(jìn)入馬鈴薯芽的分生組織、維管束及根尖分區(qū)［26］。

本文對2株P(guān)GPR菌株在土壤、花生根莖中的定殖進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的P9和P10菌株均可以定殖在花生幼苗的根尖部、聚集在根毛處并進(jìn)入根分生區(qū)的細(xì)胞間隙；而利福平標(biāo)記菌株的定殖動態(tài)顯示2個菌株還可在莖中穩(wěn)定地定殖，也證實2個PGPR菌株具有由根遷移至莖組織中的能力。由于束村氏菌屬是一類稀有放線菌，對其生態(tài)學(xué)功能的研究報道極少；僅有Marín等［27］研究發(fā)現(xiàn)束村氏菌屬C-924能定殖在玉米根際土壤。這是首次發(fā)現(xiàn)束村氏菌屬、耐酪氨酸束村氏菌可以定殖于植物內(nèi)部并發(fā)揮促生作用。另外，研究顯示P9和P10兩菌株的定殖能力存在一定差異；對混合菌株接種土壤及植株中抗性菌落的分析表明同一時間點的P9r菌落數(shù)均低于P10r，單菌株接種的結(jié)果也顯示出P10r在15 d達(dá)到最高值后的定殖菌落數(shù)下降較緩慢，但P9r在20 d定殖至最高后下降相對較快，也說明P9在花生中的定殖能力略弱于P10。而且，對利福平標(biāo)記菌株生長曲線及溶磷、產(chǎn)IAA、分泌鐵載體及ACC脫氨酶活性的測定結(jié)果表明，利福平抗性的馴化過程對2株P(guān)GPR菌株的生長生理特性并無明顯影響。

除了可以通過定殖于根際及植物而發(fā)揮直接促生外，PGPR對植物還有間接的促生效應(yīng)，其可以通過改變其微生態(tài)環(huán)境、進(jìn)而為植物提供良好的生存環(huán)境［28］。本研究中，從門的水平上，P9、P10及混合菌株接種組的擬桿菌門豐度略上升而變形菌門的豐度略有下降，這與Paenibacillus mucilaginosus和Sinorhizobium meliloti共接種的苜蓿土壤有相似的變化［29］。在科的水平上，接菌組土壤的噬幾丁質(zhì)菌科和拜葉林克氏菌科的相對豐度增加；噬幾丁質(zhì)菌科的多個種屬具固氮能力且可抑制植物病原菌生長［30］，而具有自生固氮能力的拜葉林克氏菌科對于調(diào)控植物生長可發(fā)揮一定作用［31］。已有報道黃單胞菌屬的菌株大多為植物病原菌、會附著在宿主組織上感染植物使其致?。?2］；而黃單胞菌科的相對豐度在3個接菌處理組的土壤中均低于CK?？傮w上表現(xiàn)出有益菌群的豐度增加而與病原相關(guān)菌群豐度降低的特點。在屬的水平上，F(xiàn)lavihumibacter和unidentified_Rhizobiaceae的豐度顯著增高，已發(fā)現(xiàn)Flavihumibacter的菌株大多從自然環(huán)境中分離［33］；unidentified_Rhizobiaceae通常是與豆類根瘤相關(guān)的共生體，為宿主提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑和其他重要的植物代謝物［34］。

本研究中，3個接菌處理組的芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬的相對豐度均高于未接菌組。芽孢桿菌屬隸屬于厚壁菌門、芽孢桿菌綱、芽孢桿菌目，鏈霉菌屬隸屬于鏈霉菌目、鏈霉菌科，在這幾個分類等級上其相對豐度值均相應(yīng)地高于CK組。厚壁菌門與土壤中的碳循環(huán)緊密相關(guān)，芽孢桿菌屬菌株具有更高的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化率及對植物的促生作用［35］，被認(rèn)為是最重要的生物肥料［36］；厚壁菌門和芽孢桿菌在接種Rhodopseudomonas palustris的甜葉菊土壤中豐度明顯上升［37］。鏈霉菌不僅可以產(chǎn)生豐富多樣的抗生素，近年來也被發(fā)現(xiàn)該屬的菌株具有溶磷、產(chǎn)生鐵載體和IAA等促生特性，具有較強的定殖能力［38］；在枯草芽孢桿菌NCD-2接種鹽脅迫番茄的土壤中表現(xiàn)出鏈霉菌豐度升高的變化［39］。因而，PGPR顯然也可以通過改變土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，減少有害菌群或增加有益菌群，從而改變植物根際土壤微生物環(huán)境促進(jìn)植物生長。

此外，P9菌株接種的土壤中檢測到束村氏菌科（0.0542%）、束村氏菌屬（0.0542%）、耐酪氨酸束村氏 菌（Tsukamurella tyrosinosolvens）（0.0542%）；由于束村氏菌是一類稀有放線菌、很少從植物生長的土壤環(huán)境中分離到［40］，這也間接證實該菌株可以定殖于土壤；而混合菌株接種組的土壤中未檢測到該種群，推測可能是由于P10菌株的定殖優(yōu)勢更高的緣故，這與混合菌株接種的土壤及根莖樣本中P9菌株的活菌數(shù)始終低于P10相一致。

4 結(jié)論

2株根際促生菌耐酪氨酸束村氏菌P9和吡咯伯克霍爾德氏菌P10通過直接定殖及間接影響土壤微生物多樣性而發(fā)揮對花生的促生作用，混合菌株的接種促生效果更優(yōu)。