李雨霖，倪婕，薛璐瑜，楊冬梅，余煉*，劉小玲

（1.廣西大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣西南寧 530004）（2.桂林師范高等?？茖W(xué)校，廣西桂林 541199）

對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的代表性產(chǎn)業(yè)之一，2019 年產(chǎn)量為487.141 t[1]，養(yǎng)殖總產(chǎn)量可占全球?qū)ξr養(yǎng)殖總產(chǎn)量的26%[2]。目前以無(wú)外骨骼冷凍形式生產(chǎn)的產(chǎn)品需求量逐漸增加，而在該加工過(guò)程中大約會(huì)有40%～50%的蝦頭、蝦尾、蝦殼等產(chǎn)生[3]，其中蝦頭含有較為豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甲殼素等多種營(yíng)養(yǎng)成分。這些副產(chǎn)物通常被丟棄導(dǎo)致資源浪費(fèi)，少部分進(jìn)行了工業(yè)處理，如從副產(chǎn)物中提取甲殼素，但所使用的化學(xué)試劑易造成環(huán)境污染且生產(chǎn)過(guò)程流失了大量蛋白質(zhì)資源。綜上，有必要對(duì)蝦頭中蛋白質(zhì)的提取降解技術(shù)進(jìn)行研究。

現(xiàn)有研究表明可以通過(guò)發(fā)酵、酶解、超臨界二氧化碳萃取[4]等方式對(duì)蝦頭中的蛋白質(zhì)進(jìn)行回收利用[5]。微生物可以在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分泌大量的蛋白酶及各種內(nèi)肽酶從而降解蛋白質(zhì)，生成易被動(dòng)植物消化吸收的多肽和游離氨基酸，且微生物發(fā)酵后多肽和游離氨基酸的產(chǎn)量可能高于酶水解[6]。用其制作氨基酸液體肥料，可提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。梁田[7]、王爽[8]的研究表明蛋白在降解中伴隨脫氨基的過(guò)程，部分轉(zhuǎn)化為氨氣從發(fā)酵培養(yǎng)基中釋放出來(lái)，產(chǎn)生大量不愉快氣體，既造成了原料中氮元素的浪費(fèi)[8]，也是發(fā)酵過(guò)程中惡臭形成的原因之一。這一問(wèn)題在一定程度上限制了微生物發(fā)酵方式的進(jìn)一步應(yīng)用，而目前對(duì)于該問(wèn)題解決的相關(guān)報(bào)道較少。

目前，芽孢桿菌[9]、酵母菌[10]等微生物被證實(shí)具有一定降解氨態(tài)氮的能力，在降低水體氨態(tài)氮含量方面有良好的前景[11]。解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens是芽孢桿菌屬，其可從土壤、植物、畜禽和水生動(dòng)物的腸道中被分離培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)來(lái)源廣泛、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、非致病性，常用于谷物和豆類、酒的發(fā)酵劑、加工或農(nóng)業(yè)方面的抗菌劑等[12]，在益生菌添加劑等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。本團(tuán)隊(duì)從北海紅樹(shù)林中分離了一株B.amyloliquefaciensYA289，前期實(shí)驗(yàn)表明其蛋白酶活性較強(qiáng)，具有良好降解蝦頭蛋白質(zhì)的能力，且發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氨態(tài)氮含量較低，氨臭味不明顯。因此本文以氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮含量為指標(biāo)，采用B.amyloliquefaciensYA289 對(duì)蝦頭蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為促進(jìn)蝦頭副產(chǎn)物資源的再利用提供一定理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蝦頭：南美白對(duì)蝦蝦頭由廣西北海正午有限公司提供。

菌株：本研究所使用菌株YA289 由本團(tuán)隊(duì)分離自廣西北海紅樹(shù)林生長(zhǎng)區(qū)，經(jīng)16S rRNA測(cè)序鑒定YA289與Bacillus amyloliquefaciensDSM 7 具有99.86%的同源性，初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

ISP2固體培養(yǎng)基（g/L）：麥芽粉2，酵母粉2，葡萄糖2，瓊脂15。

LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取清洗并瀝干水的蝦頭與水1:8（m/V）勻漿，在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硫酸銅、苯酚，成都金山化學(xué)試劑有限公司；尿素、乳糖、果糖、牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蔗糖、葡萄糖、淀粉、酒石酸鉀鈉、硫酸銨、乙酰丙酮、亞硝基鐵氰化鈉、結(jié)晶乙酸鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸三鈉、次氯酸鈉、冰乙酸、甲醛，成都市科隆化學(xué)品有限公司；瓊脂、麥芽粉、酵母粉，德國(guó)BioFrox 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS-600L 電子天平，北京賽多科利斯天平有限公司；SUNRISE 酶標(biāo)儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；DGH-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺(tái)，蘇州蘇凈安泰公司；GI80TW 高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門(mén)）儀器有限公司；LRH-70 生化培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司；ZWY-2102C 振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；CR21N 高速冷凍離心機(jī)，日立公司；PHS-3BW pH 計(jì)，上海般特儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與菌懸液的制備

將B.amyloliquefaciensYA289 接種于ISP2培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。挑取1環(huán)活化好的菌體接種于裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在200 r/min、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h，取菌液離心（4 000 r/min，10 min）收集沉淀，并于0.9wt%的無(wú)菌生理鹽水中重懸，并調(diào)整其OD600nm在0.7 左右。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

以接種量5wt%、初始pH 值8、發(fā)酵溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、發(fā)酵時(shí)間48 h 為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種重要成分及其濃度進(jìn)行篩選優(yōu)化。設(shè)置不同碳源成分（淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖，添加質(zhì)量濃度均為5 g/L）、不同葡萄糖質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20 g/L）、不同氮源成分（硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素，添加質(zhì)量濃度均為5 g/L）、不同氯化鈉質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20 g/L），每組設(shè)3 個(gè)平行，待發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液離心（10 000 r/min，5 min），測(cè)定發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度，結(jié)果取平均值（下同）。

1.3.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果（即在基礎(chǔ)蝦頭發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5 g/L 葡萄糖及5 g/L NaCl）作為發(fā)酵條件優(yōu)化的培養(yǎng)基。設(shè)置不同接種量（1wt%、3wt%、5wt%、7wt%、9wt%），不同發(fā)酵初始pH 值（2、4、6、8、10），不同料液比[1:2、1:4、1:6、1:8、1:10（g/100 mL）]，不同發(fā)酵時(shí)間（24、48、72、96、120 h），不同發(fā)酵溫度（28、31、34、37、40 ℃），不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220 r/min），根據(jù)發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取接種量、pH 值、料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉(zhuǎn)速這6 個(gè)因素的高（1）和低（-1）兩個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)發(fā)酵上清液中多肽質(zhì)量濃度顯著影響的因素。試驗(yàn)因素及水平編碼如表1 所示。

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇PB 試驗(yàn)篩選得到的4 個(gè)顯著因子，以多肽質(zhì)量濃度為響應(yīng)值進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，參考各顯著因子的正負(fù)效應(yīng)值確定試驗(yàn)的方向和步長(zhǎng)。以最大響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的工藝參數(shù)為Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3 所示。

1.3.5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在PB 試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)確定的4 因素3 水平的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表4。其他影響因素的條件為接種量5%，轉(zhuǎn)速180 r/min。

1.3.6 氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度的測(cè)定

參照GB 5009.235-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》，采用比色法測(cè)定發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度。

1.3.7 多肽質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考李偉民[13]的方法，取1 mL發(fā)酵上清液以1:1（V/V）的比例與10%三氯乙酸混勻，靜置10 min，5 000 r/min 離心15 min，取1 mL 上清液和4 mL 雙縮脲試劑，混勻，室溫下靜置30 min，在540 nm 測(cè)定吸光值，以蒸餾水作空白。

1.3.8 氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考梁劍光[14]的方法，取發(fā)酵上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后加顯色劑混勻，置于37 ℃孵育20 min 顯色，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，在637 nm 測(cè)定其吸光值，以蒸餾水作空白。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用 Minitab 17、IBM SPSS Statistics 26 和Origin 2021，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1.1 碳源的優(yōu)化

碳源不僅能提供微生物生長(zhǎng)所需的能量，還可以提供菌體合成目的產(chǎn)物所需的原料，減少對(duì)氨基酸的消耗[15]。由圖1 可知，以無(wú)外加碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組，分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖后，發(fā)酵上清液的氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度都有不同程度的增加，其中以添加葡萄糖或果糖后增幅較明顯，說(shuō)明對(duì)于B.amyloliquefaciensYA289 而言，葡萄糖或果糖優(yōu)先于氨基酸被作為碳源利用，這可能是由于葡萄糖或果糖較有利于促進(jìn)B.amyloliquefaciensYA289 分泌蛋白酶，并進(jìn)而分解蝦頭中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的多肽與氨基酸。孫力軍等[16]和Chen 等[17]的研究也表明葡萄糖對(duì)解淀粉芽孢桿菌抗菌脂肽的合成有明顯的促進(jìn)作用。另外，圖1 顯示添加蔗糖和乳糖后與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（p＞0.05），而添加淀粉后氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度都相較對(duì)照組有所下降；添加果糖、葡萄糖及乳糖時(shí)氨態(tài)氮產(chǎn)量較高，而添加蔗糖和淀粉時(shí)氨態(tài)氮產(chǎn)量則較低。宋君等[18]的研究也表明在外加蔗糖時(shí)Bacillus pumilusBP-171有較好的降解無(wú)機(jī)氮的效果，與本研究結(jié)果符合。這可能是由于不同碳源的空間結(jié)構(gòu)和分子量不同，使其被利用的難易程度有差異，所以不同碳源下菌株的生長(zhǎng)狀況和脫氮能力也不同。因此在培養(yǎng)基中添加葡萄糖以獲得更高的氨基酸和多肽產(chǎn)量，同時(shí)相對(duì)果糖有更低的氨態(tài)氮損失。

圖1 碳源對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of carbon source on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.1.2 葡萄糖添加量

由圖2 可知，隨著葡萄糖添加量的增加，氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在5 g/L 和10 g/L 時(shí)，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度都達(dá)到最高且氨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低，其中多肽質(zhì)量濃度在5 g/L 時(shí)有最大值，這與LEI 等[19]用Bacillus licheniformisSWJS33 發(fā)酵豆粕的研究結(jié)果一致，可能的原因是適當(dāng)?shù)钠咸烟翘砑恿坑欣谖⑸锷L(zhǎng)和產(chǎn)酶，添加過(guò)多會(huì)加速菌體的呼吸作用，過(guò)度消耗培養(yǎng)基中的溶氧，導(dǎo)致其自身生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受到抑制。因此，選擇5 g/L 的葡萄糖添加量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 葡萄糖添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effects of glucose addition amount on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.1.3 氮源的優(yōu)化

由圖3 可知，以不外加氮源的基礎(chǔ)蝦頭發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組，當(dāng)外加不同氮源后氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度都有不同程度的增加，這可能是由于碳氮比變化造成的影響[20]。添加尿素和酵母粉后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度升高，但與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（p＞0.05），而添加其他氮源后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度均低于對(duì)照組。外加硫酸銨發(fā)酵后多肽質(zhì)量濃度最高，其次為尿素，其他外加氮源多肽質(zhì)量濃度反而出現(xiàn)下降。MAO 等[21]以蝦頭作為Bacillus licheniformisOPL-007發(fā)酵唯一氮源的試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株可以直接從蝦頭中獲得氮，滿足自身生長(zhǎng)需求和脫蛋白作用。綜上，推測(cè)以蝦頭作為氮源已滿足B.amyloliquefaciensYA289 基本的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶需要，再添加其他氮源還會(huì)導(dǎo)致資源浪費(fèi)，因此培養(yǎng)基中以不外加氮源為適宜。

圖3 氮源對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of Nitrogen source on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.1.4 NaCl 添加量

無(wú)機(jī)鹽可以調(diào)節(jié)滲透壓，提供微生物生長(zhǎng)必須的離子，還可調(diào)節(jié)生理活性作用或作為生理活性物質(zhì)的組成部分[22]，同時(shí)無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響也十分關(guān)鍵。由圖4 可知，發(fā)酵上清液中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度隨NaCl 濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在NaCl 質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度最高，這說(shuō)明該B.amyloliquefaciensYA289 具有一定的耐鹽性。而NaCl 添加量對(duì)多肽和氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度沒(méi)有顯著影響（p＞0.05）。袁艷超[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明B.amyloliquefaciensY1 在添加0.3%的NaCl 時(shí)蛋白酶活力最高，且酶活力也呈先上升后下降的趨勢(shì)，因此，選擇5 g/L 的NaCl 添加量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，該濃度下氨基酸態(tài)氮產(chǎn)量較高且氨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低。

圖4 NaCl 添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of NaCl addition amount on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.2.1 接種量

接種量的大小影響菌體生理狀態(tài)及發(fā)酵的周期和產(chǎn)物的合成[24]。由圖5 可知，隨著接種量增加，氨態(tài)氮質(zhì)量濃度和多肽質(zhì)量濃度均有增加，但沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）；氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度逐漸增加，當(dāng)接種量上升到5%時(shí)氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度最高，接種量繼續(xù)增加后氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度下降，這與宋敏[25]的研究結(jié)果一致，其原因可能是接種量的增加縮短了微生物的延滯期，菌體增多，促使了蛋白酶分泌增加，多肽質(zhì)量濃度和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度都逐漸升高；而接種量過(guò)大菌體大量生長(zhǎng)繁殖，可能導(dǎo)致發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)不足、某些初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物累積增多，從而抑制產(chǎn)酶[26,27]，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度下降。因此，選擇5%的接種量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 接種量對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of inoculum on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.2 pH 值

微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)引起培養(yǎng)環(huán)境pH 值的變化，pH 值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其進(jìn)一步的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，同時(shí)也是影響NH3揮發(fā)的關(guān)鍵因素之一。由圖6 可知，隨著pH 值升高氨基酸態(tài)氮和多肽的質(zhì)量濃度都逐漸增加，在pH 值為6 時(shí)有最大值，隨著pH 值繼續(xù)升高，氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度反而下降，與Wang 等[15]有關(guān)枯草芽孢桿菌的水解度趨勢(shì)一致。氨態(tài)氮質(zhì)量濃度在中性和堿性環(huán)境下較低，這與王濤[11]和宋君[18]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)榧?xì)菌在中性和偏堿性環(huán)境下反硝化酶的活性較強(qiáng)[28]，對(duì)氨態(tài)氮的降解率更高。雖然pH 值為6 時(shí)氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度與pH 值為8 時(shí)有顯著差異，但無(wú)令人不愉快的氣味，綜合氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度選擇pH 值為6進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖6 pH 對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of pH on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.3 料液比

料液比的大小會(huì)影響菌種發(fā)酵蝦頭副產(chǎn)物的效果，如圖7 所示，在一定范圍內(nèi)隨著料液比逐漸增大，即蝦頭濃度逐漸減少，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度沒(méi)有顯著性變化（p＞0.05），多肽質(zhì)量濃度先增加后減少，這是因?yàn)榱弦罕冗^(guò)大菌種不能完全發(fā)揮作用，可能會(huì)進(jìn)一步分解生成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵效率降低，而料液比過(guò)小會(huì)導(dǎo)致蝦頭不能被充分分解。在周蓮[29]利用B.amyloliquefaciens3-2 降解羽毛的研究中，一定范圍內(nèi)羽毛含量的增加使羽毛降解率也隨之增加，超過(guò)這個(gè)范圍后羽毛降解率也逐漸降低。氨態(tài)氮質(zhì)量濃度隨著料液比減小而減少，在1:6、1:8 和1:10（g/100 mL）處均無(wú)令人不愉快的氣味，因此綜合氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度選擇料液比1:6（g/100 mL）進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖7 料液比對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of solid-to-liquid ratio on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.4 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間影響微生物的生長(zhǎng)、蛋白酶的分泌和蛋白質(zhì)的降解及氨基酸的消耗[15]。由圖8 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度和多肽質(zhì)量濃度都隨之增加，在48 h 時(shí)達(dá)到最大值，與Moayedi 等[6]和Wang 等[15]的趨勢(shì)一致。產(chǎn)物氨基酸的積累是綜合蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的和微生物生長(zhǎng)所消耗的動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果。發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使菌體開(kāi)始衰亡、產(chǎn)酶減少，同時(shí)由于后期營(yíng)養(yǎng)不足，微生物也會(huì)利用已生成的多肽等物質(zhì)進(jìn)行自身的生長(zhǎng)繁殖[15]。而發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨態(tài)氮質(zhì)量濃度無(wú)顯著影響（p＞0.05），在48 h 處質(zhì)量濃度最低，綜上，選擇48 h 發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.5 發(fā)酵溫度

微生物有自身適宜的生長(zhǎng)溫度，因而發(fā)酵溫度能影響其生長(zhǎng)和代謝過(guò)程。由圖9 可知，當(dāng)溫度上升時(shí)，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度變化無(wú)顯著性差異（p＞0.05），多肽質(zhì)量濃度和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度增加。在Wang 等[15]的研究中，枯草芽孢桿菌的水解度也隨著溫度的升高而升高，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值。綜上，由于34 ℃與37 ℃的氨基酸態(tài)氮和多肽質(zhì)量濃度沒(méi)有顯著差別，但34 ℃時(shí)氨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低，因此選擇34 ℃的發(fā)酵溫度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.1.2.6 發(fā)酵轉(zhuǎn)速

Lei 等[19]的研究表明，溫度和溶氧可以控制細(xì)菌中酶的合成與能量代謝之間的聯(lián)系。由圖10 可知，與Wang 等[30]的研究結(jié)果趨勢(shì)保持一致，隨著轉(zhuǎn)速增加氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度先增加后減少，轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)氨基酸態(tài)氮最高。這是由于隨著轉(zhuǎn)速的增大溶氧量增加，利于菌的生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)速過(guò)高可能會(huì)造成菌體機(jī)械性損傷而影響生長(zhǎng)，甚至改變酶結(jié)構(gòu)[31]。轉(zhuǎn)速的改變對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響不顯著，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)180 r/min 后氨態(tài)氮質(zhì)量濃度顯著增加，因此選擇180 r/min 的發(fā)酵轉(zhuǎn)速進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖10 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對(duì)氨基酸態(tài)氮、多肽和氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的影響Fig.10 Effect of fermentation speed on amino acid nitrogen,polypeptide and ammonia nitrogen content

2.2 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)

對(duì)發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)中的6 個(gè)因素利用Minitab 軟件進(jìn)行顯著性分析，試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。對(duì)表1 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可得到回歸模型方程：

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值（n=12）Table 1 Results of Plackett-Burman experimental design

多肽=10.657-3.221A+0.209B+1.197C-0.886D-0.965E-0.953F，R2=95.57%

說(shuō)明模型擬合良好。由表2 的顯著性分析結(jié)果可知，料液比（A）、pH（C）、溫度（E）、時(shí)間（F）對(duì)多肽質(zhì)量濃度均有顯著性影響（p＜0.05），其中pH 值具有正效應(yīng)，料液比、溫度和時(shí)間具有負(fù)效應(yīng)，選擇這4 個(gè)顯著因子進(jìn)行下一步最陡爬坡試驗(yàn)。

表2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著性分析Table 2 Significance test of factors for Plackett-Burman test

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

由表3 試驗(yàn)結(jié)果可知，隨著料液比、pH 值、溫度、時(shí)間條件的變化，多肽質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第3 組取得較好結(jié)果，故以其作為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步Box-Behnken 試驗(yàn)。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of steepest climbing

2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)

對(duì)表4 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，可得多肽質(zhì)量濃度（Y）的回歸方程：

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiment

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5 所示，該模型顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著，模型的R2=0.975 7，校正后R2adj=0.951 5，信噪比=20.980 1＞4，以上表明該模型擬合程度較好，誤差較小，可以較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)響應(yīng)值的變化。根據(jù)方差分析結(jié)果的p值可知各因素對(duì)多肽質(zhì)量濃度影響大小的依次順序?yàn)椋篋＞A＞C＞B，即時(shí)間＞料液比＞溫度＞pH 值。

表5 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 5 Analysis results of the regression model

通過(guò)Design-Expert 12 軟件得到料液比、pH 值、溫度、時(shí)間這4個(gè)因子之間的響應(yīng)曲面圖如圖11所示。曲面圖顏色深淺的變化表示多肽質(zhì)量濃度的變化，變化越快則坡度越陡，即試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值影響更顯著，由圖可知，多肽質(zhì)量濃度分別隨pH 值、料液比、溫度和時(shí)間的增加都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在各因素的中心水平有較高值，各因素之間存在明顯的交互作用。綜上所述，根據(jù)建立的模型預(yù)測(cè)，當(dāng)4 個(gè)影響因子分別在A=1:7.6、B=6.10、C=33.55、D=43.76 時(shí)，有最佳響應(yīng)值（16.11 mg/mL）。為了驗(yàn)證該模型預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在考慮實(shí)際操作的條件設(shè)置后，將預(yù)測(cè)的試驗(yàn)條件改為料液比1:8 (g/100 mL)、pH 值6、溫度34 ℃、時(shí)間44 h 進(jìn)行了3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得的多肽質(zhì)量濃度為16.35 mg/mL，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型準(zhǔn)確性良好，優(yōu)化所得的工藝條件參數(shù)可靠。

圖11 各因素交互作用響應(yīng)曲面圖Fig.11 Response surface diagram of interaction of various factors

3 結(jié)論

利用B.amyloliquefaciensYA289 降解廢棄蝦頭中的蛋白質(zhì)相較于成本較高的酶解法，是一種更為環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的方法，可作為未來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蝦副產(chǎn)物資源化利用的方向進(jìn)一步研究。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了Plackett-Burman 試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化了B.amyloliquefaciensYA289 發(fā)酵蝦頭的工藝條件，確定了其最佳的發(fā)酵條件，即在葡萄糖添加量5 g/L，NaCl 添加量5 g/L，料液比1:8（g/100 mL），接種量5%，pH 值6，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度34 ℃，時(shí)間44 h的條件下，蝦頭發(fā)酵上清液中多肽的質(zhì)量濃度為16.35 mg/mL，比優(yōu)化前提高了2.7 倍，其發(fā)酵效果優(yōu)于Sun 等[32]用Bacillus subtilisOKF04 發(fā)酵南極磷蝦得到的多肽質(zhì)量濃度（9.5 mg/mL）。因此發(fā)酵需要綜合選取合適的菌株、培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，才能更有效提升發(fā)酵效果。但是本研究存在采用的三角瓶搖床發(fā)酵存在容量小等不足，后續(xù)研究仍需進(jìn)行放大試驗(yàn)驗(yàn)證確定符合實(shí)際生產(chǎn)的參數(shù)，同時(shí)還可以從現(xiàn)代誘變育種技術(shù)和復(fù)合菌株的角度出發(fā)，進(jìn)一步提高發(fā)酵效果。