外源褪黑素對鎘脅迫下棉苗生長及光合特征的影響

黃沛域，盧玉姍，張廣興，牛繼夢，孫曉雪，袁欣彤，賈雨杉，平文超，孫紅春，張永江，劉連濤*

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/ 河北農(nóng)業(yè)大學作物生長調(diào)控實驗室，河北 保定 071000；2. 滄州市農(nóng)林科學院/ 河北省農(nóng)作物耐鹽堿評價與遺傳改良重點實驗室，河北滄州 061001）

鎘（Cadmium,Cd）是自然界中廣泛存在的一種重金屬微量元素，它不參與生物有機體的結(jié)構(gòu)組成和代謝活動，對動植物都是非必需的劇毒重金屬元素[1]。 Cd 在土壤- 植物系統(tǒng)中的遷移性較為活躍，易被根系吸收，并轉(zhuǎn)移到地上部，積累到生殖器官；它不僅嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且可以通過食物鏈進入人體并具有可積累性，達到一定劑量會影響人體健康[2]。近年來，隨著化肥、農(nóng)藥施用和污水灌溉等活動，土壤Cd 污染日益嚴重，全國Cd 的點位超標率達到7.0%，成為影響我國農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的主要重金屬污染物[2]。 土壤中Cd 富集，將導致這些土壤不適合耕種， 尤其是不適合種植小麥、水稻等農(nóng)作物。 受Cd 污染的耕地荒廢，不利于我國糧食安全。 因此，對Cd 污染耕地的治理和修復意義重大。

植物修復，是通過利用植物對Cd 吸收積累能力強的特性來清除土壤中的Cd， 達到凈化土壤的效果，是Cd 污染治理和修復的重要方法。 棉花的主要產(chǎn)物為纖維， 其產(chǎn)品不進入人類的食物鏈，且纖維和籽棉中Cd 的積累量很低，因此棉花成為Cd污染土壤修復的先鋒作物[3-5]。 但是，棉苗對Cd 脅迫的抗性較差，難以成苗，成為其應用的主要限制因素[6-7]。 為此，緩解Cd 脅迫對棉苗發(fā)育的抑制作用成為重要研究方向。

褪黑素（melatonin,MT）又稱松果體素，化學名稱為N- 乙?；?5- 甲氧基色胺（C13H16N2O2），是一種與生長素具有類似結(jié)構(gòu)的植物激素[8]，在植物中普遍存在，且其調(diào)節(jié)植物抗逆性的功能已經(jīng)得到廣泛證實[9-11]。 MT 可有效緩解逆境帶來的氧化損傷，提高植物抗逆能力，在緩解鹽、高溫、低溫、重金屬以及病蟲害等逆境脅迫方面都有一定的效果[12-16]。MT 作為抗氧化劑，既能在植物體內(nèi)合成，也能通過外源施加達到增強植物抵抗逆境脅迫能力的目的[14]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為作物補充MT，可提高其抗逆能力，促進其在逆境下的生長發(fā)育，具有極大的應用前景[12-13]。 在采用MT 處理棉苗抵抗逆境方面已有研究，例如，用MT 浸種和噴施幼苗能夠促進棉花在鹽脅迫和干旱脅迫下的種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育[17]。

因此，以農(nóng)大棉601 為材料，通過葉片噴施不同濃度MT 的方式探究MT 對Cd 脅迫下棉苗的形態(tài)和光合生理指標的影響，明確緩解Cd 脅迫下棉苗的光合性狀、根系發(fā)育等特征，以及適宜的MT 噴施濃度， 為Cd 污染地區(qū)棉花栽培提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年3－6 月，在河北農(nóng)業(yè)大學作物生長調(diào)控實驗室開展，以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉農(nóng)大棉601為研究材料。 挑選色澤、 形態(tài)一致的飽滿種子，用75%（體積分數(shù)）的酒精表面消毒5 min，用蒸餾水反復多次清洗至無酒精殘留；將種子擺入鋪有干凈毛巾的白色磁盤中， 再覆蓋1 層白色濕潤毛巾，并放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（25 ℃，相對濕度70%，光照時間12 h）。待種子萌發(fā)后，選擇120 粒萌發(fā)一致的種子播種到培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石的培養(yǎng)缽中，澆灌營養(yǎng)液，待幼苗長出3 片真葉時轉(zhuǎn)移至水培缽中（每缽1 株）開展水培試驗。

1.2 鎘脅迫與外源MT 處理

以75 μmol·L－1的CdCl2溶液進行Cd 脅迫處理。在幼苗轉(zhuǎn)入水培后用完全培養(yǎng)液培育4 d（每2 d 更換1 次營養(yǎng)液），于第5 天起每晚21：30 噴施外源MT（以葉片上MT 不滴落為準）。 設計如下處理，CK1（空白對照）：0 μmol·L－1CdCl2＋0 μmol·L－1MT，CK2（鎘脅迫對照）：75 μmol·L－1CdCl2＋0 μmol·L－1MT，MT10：75 μmol·L－1CdCl2＋10 μmol·L－1MT，MT25：75 μmol·L－1CdCl2＋25 μmol·L－1MT，MT50：75 μmol·L－1CdCl2＋50 μmol·L－1MT，MT100：75 μmol·L－1CdCl2＋100 μmol·L－1MT 和MT200：75 μmol·L－1CdCl2＋200 μmol·L－1MT；每個處理4 個水培缽。

1.3 株高和葉面積測定

在處理后的3 d、6 d、9 d，用直尺測量每個處理的4 株棉苗的株高和葉面積。株高是從棉花子葉節(jié)到生長點的長度。 葉面積采用長寬乘積法計算，系數(shù)采用0.73。

1.4 葉綠素測定

在處理第3 天、第6 天、第9 天用SPAD 葉綠素測量儀（Konica-Minolta 公司，日本）測定各處理的主莖倒3 葉，避開葉脈隨機測定6 個點，取平均值，獲得該植株葉片葉綠素含量（SPAD 值）。

1.5 光合參數(shù)的測定

參照李合生等[18]的方法使用便攜式光合測定儀Li-6400（LI-COR 公司，美國）于處理第6 天、第9 天9：00－1l：00 采用紅藍光源葉室（光量子通量密度為600 μmol·m－2·s－1，CO2濃度為400 μmol·mol－1）測定以下參數(shù)：葉片凈光合速率（net photosynthetic rate,Pn）、氣孔導度（stomatal conductance,Gs）和蒸騰速率（transpiration rate,Tr）。

1.6 根系長度、根表面積測定

處理后第10 天用剪刀把棉株橫切，用水將根系沖洗干凈，擦干。參照張娜等[19]的方法掃描根系，用根系分析軟件WinRHIZO 測算根系長度和表面積。

1.7 棉苗干物質(zhì)質(zhì)量的測定

處理后第10 天，參照Tan 等[20]的方法測定棉苗的干物質(zhì)質(zhì)量。 將棉株放入100 ℃烘箱中30 min，然后在80 ℃左右烘干至質(zhì)量恒定， 用分析天平測定其干物質(zhì)質(zhì)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 進行數(shù)據(jù)整理，采用Graphpad prism 9 進行圖形繪制。 用SPSS 22.0 進行方差分析，采用新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MT 對鎘脅迫下棉苗生長形態(tài)的影響

棉苗的葉面積和株高是判斷棉花發(fā)育優(yōu)劣的直觀表型指標（圖1）。由圖2 可知，在處理后的第3天、第6 天、第9 天，CK2處理的葉面積較CK1分別顯著下降29.86%、38.63%、39.99%， 說明隨著Cd脅迫時間延長，Cd 對棉苗的脅迫效應增強。不同濃度MT 對Cd 脅迫下幼苗株高和葉面積的促進效果表現(xiàn)出先升高再下降的趨勢 （圖1～3）。 其中：MT50處理對Cd 脅迫的緩解作用最大，棉花株高較CK2高12.8%， 葉面積較CK2高20.89%；MT200處理與CK2處理的葉面積和株高沒有顯著差異 （圖3），沒有表現(xiàn)出促進效應。

圖1 處理后第9 天各處理棉苗生長情況

圖2 各處理棉苗葉面積的比較

圖3 各處理棉苗株高的比較

2.2 外源MT 對鎘脅迫下棉苗干物質(zhì)質(zhì)量的影響

Cd 脅迫處理（CK2）的棉苗干物質(zhì)質(zhì)量顯著降低（圖4），較CK1降低了51.15%，嚴重影響了幼苗光合產(chǎn)物積累。 噴施MT 表現(xiàn)出對Cd 脅迫的緩解效應，并且緩解效應隨著噴施濃度升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。 其中：50 μmol·L－1MT 的緩解效果較佳， 其干物質(zhì)質(zhì)量較CK2顯著提升了43.31%；MT10、MT25干物質(zhì)質(zhì)量分別較CK2顯著增加了29.13%、35.43%；MT100、MT200干物質(zhì)質(zhì)量與CK2并無顯著差異。

圖4 各處理棉苗干物質(zhì)質(zhì)量的比較

2.3 外源MT 對鎘脅迫下棉苗葉片葉綠素含量（SPAD 值）的影響

如圖5 所示，處理后的第3 天、第6 天、第9 天時，CK1的葉片葉綠素含量顯著高于Cd 脅迫處理（CK2），噴施MT 表現(xiàn)出對Cd 脅迫的緩解效應。 其中，MT50處理的棉苗葉片的葉綠素含量顯著高于CK2， 而第3 天和第9 天MT200處理的棉苗葉片的葉綠素含量則與CK2相比無顯著性差異。 表明Cd脅迫下，適宜濃度的MT 能夠提高棉苗葉片的葉綠素含量，增強棉苗的光合能力，提升棉花的干物質(zhì)質(zhì)量。

圖5 各處理棉苗葉片葉綠素含量（SPAD 值）的比較

2.4 外源MT 對鎘脅迫下棉苗Pn 的影響

如圖6 所示， 處理后第6 天時，CK1的葉片Pn為10.61 mol·m－2·s－1，Cd 脅迫處理（CK2） 的僅為3.40 mol·m－2·s－1， 顯著下降了67.95%（P＜0.05）；處理后第9 天時，CK1的葉片Pn為16.93 mol·m－2·s－1，CK2的Pn為10.37 mol·m－2·s－1，較CK1顯著下降38.75%（P＜0.05）。 在處理后第6 天時， 與CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200處理的Pn分別顯著增加40.88%、66.47%、98.24%、57.65%和60.29%，其中50 μmol·L－1MT 處理最高。 在處理后第9 天時， 與CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200的Pn分別顯著增加了30.47%、35.49%、51.59%、43.78%和31.53%， 其中50 μmol·L－1MT處理表現(xiàn)最佳。說明適宜濃度的MT 處理能夠提升Cd 脅迫下棉苗葉片的Pn。

圖6 各處理棉苗凈光合速率（Pn）的比較

2.5 外源MT 對鎘脅迫下棉苗Gs 的影響

如圖7 所示， 處理后第6 天時，CK2棉苗的Gs較CK1顯著下降51.64%； 第9 天時，CK2的Gs較CK1顯著下降50.36%。 在處理后第6 天，與CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200處理棉苗的Gs分別顯著增加52.61%、72.54%、101.04%、88.6%和46.11%；其中，50 μmol·L－1MT 處理最高。 在處理后第9 天時， 與CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200處理棉苗的Gs分別增加了26.87%、48.02%、62.38%、14.75%和4.15%； 其中，50 μmol·L－1MT 處理最高， 且與MT10、MT100、MT200處理均有顯著性差異（P＜0.05）?？梢?，MT100和MT200處理棉苗的Gs沒有上升反而下降， 尤其是處理后第9天時MT100和MT200處理棉苗的Gs較CK2增長比例較低，且與CK2之間無顯著差異。 說明適宜濃度的MT 處理能夠提高棉苗的Gs， 且具有較強的促進作用。

圖7 各處理棉苗氣孔導度（Gs）的比較

2.6 外源MT 對鎘脅迫下棉苗Tr 的影響

如圖8 所示，CK2處理棉苗的Tr在處理后第6天時較CK1顯著下降85.99%， 在處理后第9 天時顯著下降57.14%。 處理后第6 天時，與CK2相比，MT10、MT25、MT50、MT100和MT200棉 苗 的Tr分 別 增加79.17%、102.56%、160.22%、122.23%和53.84%；其中，50 μmol·L－1MT 處理最高， 并與CK2、MT10和MT200存在顯著性差異。 在處理后第9 天時，與CK2相 比，MT10、MT25和MT50棉 苗 的Tr分 別 增 加4.69%、21.19%、27.45%， 而MT100和MT200棉苗的Tr分別下降4.59%和15.94%。 可見，隨著MT 濃度逐漸上升，MT100和MT200棉苗的Tr沒有繼續(xù)上升反而下降。說明一定濃度的MT 處理能夠提高棉苗的Tr，且具有較強的促進作用，而高濃度MT 處理則可能會加重Cd 脅迫對棉苗Tr的抑制作用。

圖8 各處理棉苗蒸騰速率（Tr）的比較

2.7 外源MT 對鎘脅迫下棉苗根系的影響

如圖9 所示，在Cd 脅迫下，單株根長與單株根系表面積均明顯降低。 在單株根長方面，CK2較CK1顯著降低46.09%； 在單株根系表面積方面，CK2較CK1顯著降低46.89%。 而噴施一定濃度的MT，表現(xiàn)出對Cd 脅迫的緩解效應，以噴施50 μmol·L－1MT 處理效果較佳， 單株根長較CK2顯著提升33.32%，單株根系表面積較CK2顯著提升43.91%；而噴施高濃度（200 μmol·L－1）MT 處理的棉苗單株根長與單株根系表面積與CK2并無顯著差異。 說明不同濃度MT 處理對Cd 脅迫下棉苗地下部生長指標的促進作用表現(xiàn)出與地上部生長指標相似的變化趨勢，即一定濃度范圍內(nèi)有顯著效果、高濃度（200 μmol·L－1）無顯著效果。

圖9 各處理棉苗根系長度和表面積的比較

3 討論

3.1 褪黑素緩解鎘脅迫對棉苗生長發(fā)育的抑制作用

Cd 作為對生物毒性最強的重金屬污染物之一，嚴重影響植物幼苗的生長發(fā)育[21-23]。 過量的Cd會影響葉綠素合成，抑制光合作用，進而減少光合產(chǎn)物積累，造成植株矮小[7-8]。本研究表明，75 μmol·L－1的Cd 處理顯著降低了棉苗的株高、 葉面積和干物質(zhì)質(zhì)量，表現(xiàn)出顯著的抑制作用，與Cd 脅迫對小麥、玉米等作物的抑制作用程度相近。 MT 作為一種有效的抗氧化劑，其噴施可以提高植株的抗氧化能力，促進相關基因表達，緩解逆境脅迫對植株的傷害。 呂怡穎等[24]發(fā)現(xiàn)外源MT 可緩解Cd 脅迫對煙草的毒害。 根系是響應Cd 脅迫的重要器官，其形態(tài)也受到Cd 脅迫的影響，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化對減少Cd 的吸收具有重要作用。 本研究發(fā)現(xiàn)Cd 脅迫下噴施MT 能夠緩解Cd 對棉苗的傷害，隨著MT 濃度的上升其效力呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，其中50 μmol·L－1的外源MT 能夠有效緩解Cd 脅迫對棉苗株高、葉面積、干物質(zhì)質(zhì)量和根系的抑制，甚至與無脅迫條件下的棉苗相近。 這與李亮等[25]研究得出的緩解Cd 脅迫對紫蘇根系發(fā)育抑制作用的適宜MT 濃度相近。 因此，適宜濃度的MT 能夠在一定程度上緩解Cd 對棉苗生長的抑制作用。

3.2 褪黑素對鎘脅迫下棉苗葉片中光合作用的調(diào)控

葉片是植株光合作用的重要部位，為植株提供光合產(chǎn)物與能量，保證了植物的正常生長發(fā)育。 Cd脅迫會破壞植株的葉綠體結(jié)構(gòu)， 抑制氣孔開放，使光合作用受到嚴重抑制[26]。 葉綠素是植物進行光合作用的基礎，其含量的變化可反映光合作用效率的高低[27]。 李玲等[28]研究表明，高濃度Cd 會抑制棉花葉綠素的合成和光合作用，進而使棉株的生長受到抑制。而外源MT 能夠促進植物葉片光合相關基因的表達，保護葉片的光合系統(tǒng)[29]。 本研究發(fā)現(xiàn)，75 μmol·L－1的Cd 脅迫對棉苗葉綠素含量、Pn和Gs具有極強的抑制作用； 噴施一定濃度的MT 能緩解Cd 脅迫傷害，隨MT 濃度的升高表現(xiàn)為一定濃度范圍內(nèi)有顯著效果、高濃度無顯著效果，其中50 μmol·L－1的MT 的緩解效應最強， 暗示MT 可能影響光合作用。同時發(fā)現(xiàn)，MT 對Cd 脅迫下葉片的Tr也具有相似的緩解效應， 且也是在50 μmol·L－1時緩解效應最佳。

外源激素對作物生長的調(diào)控一般存在劑量效應。 本研究發(fā)現(xiàn)當外源MT 濃度達到100 μmol·L－1時，其對Cd 抑制棉苗光合作用、氣孔導度和蒸騰速率（圖7、圖8）的緩解效應開始下降。此前對外源MT 緩解鹽脅迫下棉苗生長發(fā)育的研究也得到高濃度緩解效應減弱的結(jié)果， 但是緩解效應最優(yōu)的MT 處理的濃度達到了200 μmol·L－1[30]。 因此，認為外源MT 緩解Cd 抑制棉苗光合作用的效果與其濃度密切相關。

3.3 在鎘污染下棉花生產(chǎn)中施用外源褪黑素的可行性

棉花是Cd 污染農(nóng)田重要的先鋒作物[3-5,31-32]。但Cd 也會對棉苗的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響[6-7,31]。 本研究發(fā)現(xiàn)，采用50 μmol·L－1的MT 能夠促進Cd 脅迫下棉苗的生長和光合作用，且效果顯著。 煙草研究中發(fā)現(xiàn)，100 μmol·L－1的MT 處理能顯著緩解Cd脅迫對幼苗發(fā)育的抑制作用[24]。 可見，對于不同植物，適宜濃度MT 對Cd 抑制植物幼苗生長發(fā)育的緩解效應均可達到顯著水平。 因此， 針對一定Cd污染程度的棉田， 噴施適量MT 促進棉苗發(fā)育、壯苗具有可行性。 日后應進一步在Cd 污染區(qū)開展大田研究， 明確MT 對Cd 污染區(qū)棉花產(chǎn)量的影響效應。

4 結(jié)論

本研究條件下，75 μmol·L－1Cd 脅迫抑制棉苗的光合作用，緩解Cd 抑制作用的適宜MT 濃度為50 μmol·L－1。 噴施50 μmol·L－1的MT 可緩解Cd對棉苗光合作用的抑制，減輕對根系的傷害以及植株干物質(zhì)積累量的下降程度； 噴施小于25 μmol·L－1的MT，緩解Cd 對棉苗光合抑制的效果明顯降低；大于100 μmol·L－1的MT 處理，對棉苗Cd 脅迫的緩解效應也顯著降低。 據(jù)此初步認為， 施用MT 能有效地改善Cd 脅迫條件下棉苗的生長狀況，增強其光合作用能力、根系發(fā)育，從而提高棉花耐鎘性，但具體濃度還有待進行多點、多品種試驗進一步驗證。