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      生物活性肽功能及其在釀酒中的研究進(jìn)展

      2022-11-09 14:16:43黃婉秋
      釀酒科技 2022年1期
      關(guān)鍵詞:酒糟黃酒釀造

      沈 陽(yáng),黃婉秋,羅 寒

      (貴州茅臺(tái)酒股份有限公司,貴州 仁懷 564500)

      肽(peptide)是α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物,它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物,是一類(lèi)不同于蛋白質(zhì),但具有蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能的小分子物質(zhì)。根據(jù)其氨基酸數(shù)量,可以分為小肽和多肽。生物活性肽(bioactive peptide,BP)則是一類(lèi)具有特殊生理調(diào)節(jié)功能的介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的低分子聚合物,是由天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線形、環(huán)形結(jié)構(gòu)的肽類(lèi)總稱(chēng)。不同的多肽其功能和生物活性各有不同,目前對(duì)其研究的主要生理功能有抗氧化、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、促進(jìn)脂肪代謝、提高機(jī)體免疫力等。

      隨著時(shí)代的發(fā)展,人們對(duì)健康的關(guān)注度越來(lái)越高,酒作為人們喜愛(ài)的飲品,研究其所含有的保健養(yǎng)生功能性物質(zhì)也逐漸成為熱點(diǎn)。近年來(lái),有不少研究者從酒中分離出具有生物活性功能的肽類(lèi)物質(zhì),為健康飲酒,喝健康酒提供了科學(xué)指導(dǎo)。此外,在釀酒生產(chǎn)過(guò)程中,制酒的酒醅、釀酒產(chǎn)生的副產(chǎn)物酒糟以及釀造環(huán)境微生物中,也都有生物活性肽的存在。這些具有生物活性的肽類(lèi)物質(zhì),對(duì)于釀酒的生產(chǎn)、風(fēng)味和品質(zhì)有著至關(guān)重要的影響,對(duì)于釀酒的健康發(fā)展也有著重要的研究?jī)r(jià)值。

      1 多肽的生物活性與功能

      1.1 抗氧化活性肽

      抗氧化肽具有清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化以及與金屬離子螯合等能力,具有抗氧化作用,對(duì)保護(hù)人體組織和器官免受自由基危害具有特定作用,通過(guò)抑制細(xì)胞氧化,來(lái)維持人體抗氧化防御系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡,其抗氧化活性取決于它們提供氫的能力和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

      1.2 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽

      血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(Angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptides,ACEIPs),是一類(lèi)能夠調(diào)節(jié)血壓的生物活性肽的總稱(chēng),又稱(chēng)為抗高血壓肽??垢哐獕弘哪軌蜃璧K血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)催化水解血管緊張素Ang I 成為血管緊張素Ang II,同時(shí)阻礙催化水解緩激肽(Bradykinin,BK)成為失活片段,從而起到降低血壓的作用。相比于化學(xué)藥物,使用天然具有降血壓作用的生物活性肽來(lái)降血壓,安全性更高。

      1.3 抗菌肽

      如今抗生素的濫用引發(fā)許多安全問(wèn)題,細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)以及大量的藥物殘留迫使人們研究出安全無(wú)副作用的抗菌劑??咕膶?duì)細(xì)菌的廣譜高效殺菌活性,對(duì)部分病毒、真菌等的殺滅作用,以及其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn),為抗菌新藥的研發(fā)提供了方向,在醫(yī)學(xué)上具有良好的應(yīng)用前景。

      1.4 免疫調(diào)節(jié)肽

      免疫調(diào)節(jié)肽是具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性肽,它能夠增強(qiáng)人體的免疫功能,其包括寡肽、多肽和一些蛋白酶水解的混合肽。免疫調(diào)節(jié)肽可以作為一種新型食品原料,能夠有效減少和調(diào)節(jié)與膳食相關(guān)的慢性疾病,提高機(jī)體免疫力。

      1.5 多肽疫苗

      多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測(cè)的某段抗原表位的氨基酸序列,通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗,例如乙型肝炎(乙肝)病毒(Hepatitis B Virus,HBV)多肽疫苗、人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)多肽疫苗、人類(lèi)乳頭瘤病毒(HPV)治療性多肽疫苗等。多肽疫苗的優(yōu)勢(shì)在于安全、反應(yīng)原性低等,是新一代疫苗研究的熱點(diǎn)之一,隨著技術(shù)手段的不斷進(jìn)步,越來(lái)越多的多肽疫苗被研發(fā)出來(lái),并逐步開(kāi)展臨床前研究,在不久的將來(lái)造福人類(lèi)。

      2 釀酒與多肽的關(guān)系

      有研究者對(duì)釀造生產(chǎn)中的肽類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了研究,以探索酒類(lèi)的功能性物質(zhì)及酒糟等副產(chǎn)物中高附加值的功能性成分。釀造過(guò)程中產(chǎn)生的肽類(lèi)物質(zhì),主要由釀酒原料以及釀造用曲生成。用于釀造酒的糧食(例如高粱、玉米等)中除了含有大量的淀粉外,還含有較豐富的蛋白質(zhì)。在傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵釀造過(guò)程中,由于微生物的作用,會(huì)使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生很多多肽物質(zhì)。在白酒蒸餾過(guò)程中,大分子肽的沸點(diǎn)很高,很難蒸餾出來(lái),而小分子多肽(分子質(zhì)量<1000 U)則可能會(huì)溶解在乙醇-水體系中被蒸餾出來(lái)。釀造用曲中含有的大量微生物如酵母、霉菌和細(xì)菌等,這些菌體在釀造過(guò)程中的自溶也會(huì)產(chǎn)生大量的肽類(lèi)物質(zhì)。在釀酒過(guò)程中曲的添加量以及加工工藝等因素,對(duì)發(fā)酵樣品中多肽物質(zhì)的產(chǎn)生也有一定影響。

      2.1 白酒中的多肽

      近年來(lái),有不少研究者從白酒中提取出多肽,并對(duì)其生物活性進(jìn)行了研究。鄧霞玲等采用HPLC-QTOF高分辨質(zhì)譜儀從濃香型白酒(53%vol)、清香型白酒(53 %vol)、醬香型白酒(53 %vol)3 種白酒樣品中檢測(cè)到13 種環(huán)二肽化合物,并經(jīng)過(guò)液相色譜儀與四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LC-QTOF)分析后,得到了各環(huán)二肽的結(jié)構(gòu)式。霍嘉穎等通過(guò)濃縮并結(jié)合液-液萃取從芝麻香型白酒原漿酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)65%)中分離純化出一種三肽,并通過(guò)高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-Q-TOFMS)進(jìn)行鑒定,確定其序列為Arg-Asn-His(RNH),質(zhì)量濃度為18.78 μg/L±0.34 μg/L;研究還發(fā)現(xiàn)RNH 通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶(過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)的活力及細(xì)胞內(nèi)還原性化合物谷胱甘肽濃度,來(lái)提高細(xì)胞的抗氧化能力,且其抗氧化能力呈濃度依賴(lài)性增加。吳繼紅等采用直接濃縮的方法從古井濃香型白酒和國(guó)井芝麻香型白酒中分離發(fā)現(xiàn)多肽,以液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-ESI-QTOFMS)和合成標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行鑒定,得到其氨基酸序列為Pro-His-Pro(PHP);實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抑制ACE 活性?;艏畏f等在清香型草原王白酒中分離鑒定出了3 條多肽,采用液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-ESIQTOF-MS)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了鑒定,分別為L(zhǎng)ys-Val-Val-Ala(KVVA),Val-Cys-Trp-Asn(VCWN)和Trp-ILe-Lys-Lys(WIKK),并發(fā)現(xiàn)這3 條多肽都具有一定的ACE 抑制活性,且呈濃度依賴(lài)性增加,但它們之間ACE抑制活性的差異明顯,研究者認(rèn)為這種差異主要跟該多肽序列中是否存在疏水性氨基酸以及氨基酸所在的位置有關(guān)。

      徐巖等在白酒中發(fā)現(xiàn)了由七肽和脂肪酸以?xún)?nèi)酯鍵結(jié)合形成的環(huán)狀脂肽類(lèi)化合物,并通過(guò)頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)和核磁共振(NMR)等方法發(fā)現(xiàn)其與白酒中風(fēng)味化合物之間存在著獨(dú)特的相互作用關(guān)系,對(duì)白酒風(fēng)味有重要作用。進(jìn)一步的研究表明,該環(huán)狀脂肽類(lèi)化合物為地衣素(Lichenysin),由利用高粱原料合成,在固態(tài)蒸餾過(guò)程中帶入白酒。此外,研究者還從中發(fā)現(xiàn)了其他脂肽類(lèi)化合物,包括豐原素(fengycin),枯草素(surfactin),芽孢菌霉素(bacillomycin)。這些脂肽類(lèi)化合物都具有類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

      2.2 酒醅、酒糟中多肽簡(jiǎn)介

      為研究白酒中多肽的來(lái)源,孫金沅、姜云松等采用超濾、半制備型高效液相色譜等方法對(duì)古井貢酒酒醅水溶性提取物中的多肽進(jìn)行分離純化,并利用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)所得多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,發(fā)現(xiàn)了氨基酸序列分別為L(zhǎng)ys-Gly-Pro(KGP)和Val-Pro-Asp(VPD)的2 種多肽,2 種多肽均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的ABTS(2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除能力和氧化自由基吸收能力。此外,2 種多肽也表現(xiàn)出了ACE 抑制活性,KGP 與VPD 的半抑制濃度IC(50)分別為2.91 mmol/L 和2.11 mmol/L。其作用機(jī)制體現(xiàn)在可以顯著降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxidative species,ROS)含量,提高過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)3種酶的活力以及還原型谷胱甘肽(GSH)的含量,同時(shí)也能夠通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平,如丙二醛(MDA)的含量來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,并且兩種多肽的抗氧化能力隨著濃度的上升基本呈現(xiàn)一定的增強(qiáng)趨勢(shì)。該研究為白酒中多肽類(lèi)功能物質(zhì)的溯源提供了一定的理論基礎(chǔ)。

      釀酒生產(chǎn)過(guò)程中,糧谷類(lèi)作物通過(guò)加入酒曲、糖化酶等發(fā)酵劑,經(jīng)蒸煮、糖化發(fā)酵、蒸餾等工序后產(chǎn)生的副產(chǎn)物酒糟,其成分包括未能發(fā)酵完全的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、有機(jī)酸、氨基酸、維生素、脂肪、酒用風(fēng)味物質(zhì)、酚類(lèi)化合物、含氮化合物、雜環(huán)類(lèi)化合物等,其中蛋白質(zhì)含量較高,但大部分沒(méi)有得到充分利用,從中提取蛋白、多肽或者氨基酸,可以成為制備其他生物材料的原材料。深入研究酒糟中附加值更高的功能性成分物質(zhì),對(duì)于拓寬酒糟的應(yīng)用范圍具有重要意義。魏冬等以白酒酒糟為研究對(duì)象,采用超濾、反相高效液相色譜法(reverse phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)分離制備酒糟中的水溶性多肽組分,并利用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)共分離鑒定出30 種多肽,包括6 種ACE抑制肽AAPK、KAGP、TVPK、YE、VPGK、TPF,2 種抗氧化肽VPSGK、LH 和1 種抑制紫外線引起紅斑的功能短肽HP,表明白酒酒糟含有多種生物活性肽,該研究證明了利用酒糟提取功能性多肽的可行性,為白酒酒糟深加工或高附加值利用提供理論基礎(chǔ)。

      2.3 黃酒中的多肽簡(jiǎn)介

      在中國(guó)黃酒中已有很多活性肽的報(bào)道,其作為黃酒里一種重要的功能性成分,不僅具有抗氧化功能,還可以降血壓、降膽固醇。孟中法等對(duì)黃酒中游離氨基酸以及經(jīng)過(guò)水解后的氨基酸進(jìn)行測(cè)定,用水解后氨基酸含量減去游離氨基酸含量,粗略對(duì)黃酒中的肽含量進(jìn)行估算,發(fā)現(xiàn)黃酒中肽含量可以達(dá)到13 mg/mL。馮瑞雪等通過(guò)大孔樹(shù)脂吸附、凝膠色譜等方法多級(jí)分離純化黃酒中活性肽組分,并探究各級(jí)分離肽組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫調(diào)節(jié)作用的影響。研究結(jié)果表明,黃酒多肽能顯著抑制脂多糖LPS 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 分泌NO,對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞炎癥有著保護(hù)作用,促使巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫作用,可見(jiàn)酒中的一些多肽物質(zhì)有著提高人體免疫功能的作用。

      王正元對(duì)黃酒中的多肽物質(zhì)進(jìn)行了深入研究,將黃酒中的肽類(lèi)物質(zhì)大體分為極性不同的四部分,鑒定出具有相對(duì)較高的膽固醇溶解抑制率和自由基清除率的峰p6 的氨基酸序列為四肽CGSP(Cys-Gly-Ser-Pro)。曹龍輝對(duì)廣東客家黃酒中提取出來(lái)的抗氧化肽進(jìn)行了研究,利用凝膠過(guò)濾層析從大孔樹(shù)脂純化物中分離出了4 個(gè)組分,并對(duì)各組分的抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)組分1 對(duì)ABTS自由基和DPPH 自由基的清除率分別為67.45 % ± 0.17 %和56.47 % ± 0.46 %,該實(shí)驗(yàn)從多肽的功能方面反映了廣東客家黃酒的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)還對(duì)大孔樹(shù)脂分離純化抗氧化肽的條件進(jìn)行了進(jìn)一步的改良優(yōu)化,確定了其分離純化最佳的工藝條件,為多肽的提取工藝提供了借鑒。孟如杰通過(guò)對(duì)黃酒中抗氧化活性多肽的氨基酸組成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了它們都具有富含精氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸等氨基酸的特點(diǎn)。戴軍等通過(guò)基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)聯(lián)用儀,鑒定出了黃酒中含有4 種具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的肽。張蓉真等在福建老酒中,也分離純化出具有很強(qiáng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的肽。

      隨著肽的生理功能不斷被發(fā)現(xiàn),高肽含量的黃酒釀造逐漸成為研究的熱點(diǎn)。蔡君等采用了酶法活性多肽生物發(fā)酵工藝釀造新型生物多肽黃酒,使發(fā)酵后的黃酒肽含量可達(dá)4 g/L 以上,強(qiáng)化了黃酒保健和養(yǎng)生的功能,研究還發(fā)現(xiàn)添加玉米肽不僅可以提高多肽黃酒的釀造效率,而且大大提高了黃酒的品質(zhì)。趙文紅等在黃酒發(fā)酵過(guò)程中,加入水解植物蛋白粉或麩皮酶解液,得到了多肽含量更高的黃酒,其多肽含量高達(dá)13.22 g/L,這種使黃酒中能富含多肽的釀造方法,有著制備工藝簡(jiǎn)單,原料成本低廉的特點(diǎn)。這些釀造工藝的研究為釀酒的健康發(fā)展提供了一定的參考。

      2.4 葡萄酒中的多肽

      在釀造酒中,人們對(duì)葡萄酒保健功能及其營(yíng)養(yǎng)因子的研究較為深入,葡萄酒中的活性小肽是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在早些時(shí)候就已經(jīng)有研究者對(duì)葡萄酒中的多肽物質(zhì)進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)葡萄酒中含有多種多肽物質(zhì)。Pozo 等通過(guò)超濾和低壓液相色譜分離,從白葡萄酒和紅葡萄酒中分離得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性的多肽。有研究者對(duì)葡萄和葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵進(jìn)程中,釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的Gex1基因?qū)€原型GSH的產(chǎn)生起著重要的調(diào)控作用。釀酒酵母能夠代謝并分泌出一部分還原型GSH,或是酵母吸收還原型GSH 前體物質(zhì)來(lái)合成還原型GSH,從而使得釀酒過(guò)程中還原型GSH 含量發(fā)生變化。周元等研究了紅葡萄酒陳釀前后肽的變化,發(fā)現(xiàn)在蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵和陳釀后,紅葡萄酒中肽的分布有明顯的變化,研究者認(rèn)為這些肽來(lái)自酵母和葡萄本身,是紅葡萄酒在蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵和橡木桶陳釀后口感和香氣發(fā)生改變的重要原因。

      3 展望

      多肽具有多種多樣的功能,在醫(yī)學(xué)上具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。自20 世紀(jì)以來(lái),從陸地到海洋,從植物到微生物,研究者們從未停止過(guò)對(duì)多肽的探索。釀造食品中有芳香族類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)、酸類(lèi)等化合物,對(duì)食品的風(fēng)味產(chǎn)生有重要的貢獻(xiàn);也有有機(jī)酸、糖、氨基酸、肽等非揮發(fā)性物質(zhì),對(duì)食品的風(fēng)格特征起著重要作用。在白酒的釀造過(guò)程中,非揮發(fā)性物質(zhì)能夠與揮發(fā)性物質(zhì)相互作用,調(diào)節(jié)揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)性能,改變并協(xié)調(diào)香氣結(jié)構(gòu),從而對(duì)放香強(qiáng)度與香氣持久性產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用??梢钥闯?,酒中的肽類(lèi)物質(zhì)對(duì)于釀酒的品質(zhì)有著直接或間接的影響。在白酒的生產(chǎn)過(guò)程當(dāng)中,我們已經(jīng)知道己酸菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等微生物的代謝對(duì)于白酒的香型和品質(zhì)有著重要的影響。那么,研究白酒釀造過(guò)程中的微生物與多肽類(lèi)物質(zhì)的生成機(jī)制,將有著重要的意義。未來(lái)的研究當(dāng)中,可以針對(duì)釀酒中多肽物質(zhì)的分離、鑒定、生物活性功能,以及生成機(jī)制、溯源分析等方面入手,為釀酒的健康發(fā)展提供理論支持,也為今后釀酒的工藝研發(fā)提供一定參考。此外,還可以對(duì)酒糟中可能存在的高附加值肽類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行挖掘,使得酒糟能夠再利用,從而減少對(duì)環(huán)境的污染,也為其他物質(zhì)中多肽的研究提供科學(xué)的方法和研究思路。

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