胡玉玲，張 魯，曾申明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

人工授精（artificial insemination，AI）技術(shù)在動物育種中有至關(guān)重要的作用，是改善生產(chǎn)性狀和提高遺傳進(jìn)程的重要手段之一，在一定時間內(nèi)成功保持精子活力是AI的一項重要技術(shù)，能提高AI的效率。根據(jù)精液保存時的溫度將精液保存分為冷凍保存、低溫保存和常溫保存。氧化應(yīng)激是影響精液保存的重要因素。馬精子主要依靠氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）而不是糖酵解產(chǎn)生能量，這種情況下精子線粒體的活性更高并易產(chǎn)生更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），導(dǎo)致馬精子比其他動物更容易受到氧化損傷。了解ROS的產(chǎn)生、功能及損傷機(jī)制，有利于為馬精液保存提供理論依據(jù)。

1 精液中ROS的產(chǎn)生

ROS是生物有氧代謝的中間產(chǎn)物及電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的副產(chǎn)物，哺乳動物體內(nèi)主要的ROS有超氧化物（O）、過氧化氫（HO）和羥基自由基（-OH）等。精液中ROS的主要來源是線粒體和白細(xì)胞，在線粒體呼吸鏈上，氧氣逐步吸收4個電子，被還原成高反應(yīng)自由基作為中間產(chǎn)物，最后還原成水，期間電子極易發(fā)生泄漏而形成大量氧自由基，因此OXPHOS活躍的精子產(chǎn)生的ROS較多。據(jù)估計，在線粒體呼吸過程中，有1%～2%的電子從呼吸鏈釋放而形成超氧化物。ATP是維持精子內(nèi)環(huán)境和功能的重要物質(zhì)，精子內(nèi)部ATP通過OXPHOS和糖酵解兩種方式產(chǎn)生，前者依賴于精子中段的線粒體，后者主要發(fā)生在精子頭部和纖維鞘。相比之下，OXPHOS能比糖酵解更快產(chǎn)生高水平ATP并促進(jìn)精子活力，同時也伴隨呼吸鏈上大量ROS的產(chǎn)生。大部分哺乳動物如人、小鼠等，主要通過糖酵解產(chǎn)生能量。以前的研究者普遍認(rèn)為精子的代謝方式均為糖酵解，直到2010年發(fā)現(xiàn)馬精子活力與線粒體膜電位有關(guān)，隨后Z.Gibb等發(fā)現(xiàn)受線粒體抑制劑的影響，馬精子的活力、運動速度及ATP的產(chǎn)生量都顯著降低，而已知進(jìn)行糖酵解的人類精子幾乎不受到線粒體抑制劑的影響，首次證明馬精子依賴于OXPHOS產(chǎn)生能量。因此，相比其他動物，馬精子保存過程也更容易受到ROS的損傷。

精液中ROS的另一大來源是白細(xì)胞，主要發(fā)生在防御感染和炎癥反應(yīng)中，其產(chǎn)生ROS的機(jī)制與精子相同，但是生理上白細(xì)胞釋放大量超氧化物的目的是殺滅病原體。正常情況下精漿抗氧化劑足以保護(hù)精子免受白細(xì)胞產(chǎn)生的ROS的影響，但是在稀釋過程中精液通過離心和洗滌去除精清后，ROS的有害作用就變得更為明顯。另外發(fā)現(xiàn)死亡精子也是精液保存中ROS的來源之一，精子死亡后氨基酸氧化酶活性增加并產(chǎn)生大量HO，產(chǎn)生的HO攻擊精子造成氧化損傷。

2 ROS對精子功能的影響

2.1 ROS促進(jìn)精子的功能

2.1.1 精子成熟 精子成熟過程中，組蛋白逐漸被魚精蛋白取代，并形成分子間及分子內(nèi)二硫鍵，從而將精子DNA封裝到一個很小的體積中。ROS有助于二硫鍵的形成，影響精子蛋白質(zhì)巰基氧化，并有助于魚精蛋白和鞭毛蛋白的半胱氨酸殘基之間形成巰基橋，引起染色質(zhì)凝聚和獲得漸進(jìn)性的運動能力，確保染色體的穩(wěn)定性并保護(hù)DNA不受損害。研究表明，魚精蛋白2缺陷小鼠的精子抗氧化能力喪失，附睪精子在成熟過程中引發(fā)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的破壞級聯(lián)反應(yīng)

2.1.2 精子獲能 精子射出后，要在雌性生殖道內(nèi)經(jīng)歷超活化、獲能、頂體反應(yīng)、精卵識別等才能完成受精，任一環(huán)節(jié)不可缺少。精子獲能需要ROS來完成蛋白磷酸化，如果這種磷酸化被抑制，精子獲能就不會發(fā)生，會失去對各種生理性和非生理性激動劑的反應(yīng)能力。精子內(nèi)ROS是獲能啟動因子之一，可以通過增加腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）水平、在細(xì)胞內(nèi)啟動細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路兩種方式促進(jìn)獲能。人類精子產(chǎn)生的ROS通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的升高并隨后激活依賴于蛋白激酶A（PKA）的酪氨酸激酶來刺激酪氨酸磷酸化。研究表明，ROS的產(chǎn)生對酪氨酸磷酸化有積極影響，抑制ROS產(chǎn)生會導(dǎo)致磷酸化酪蛋白含量顯著降低，同時頂體反應(yīng)和精卵融合能力變差。

2.1.3 頂體反應(yīng) 頂體反應(yīng)通過ROS誘導(dǎo)的酪氨酸蛋白磷酸化介導(dǎo)Ca流入，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP和PKA升高，從而使精子能夠穿透卵母細(xì)胞膜并與卵母細(xì)胞融合。已經(jīng)觀察到ROS通過各種手段促進(jìn)精子透明帶的作用，包括3個質(zhì)膜相關(guān)蛋白的磷酸化，進(jìn)而催化脂肪酸的釋放，誘導(dǎo)頂體膜和質(zhì)膜融合。

2.2 ROS的病理作用

盡管ROS有促進(jìn)精子成熟等生理功能，但ROS產(chǎn)生和抗氧化機(jī)制的任何不平衡都會導(dǎo)致精子發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。而由于精子細(xì)胞質(zhì)有限，抗氧化劑活性低，且不飽和脂肪酸含量高，因此精子特別容易受到氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。

2.2.1 脂質(zhì)過氧化 為了成功受精，精子必須穿透透明帶并與卵母細(xì)胞融合，大多數(shù)的多不飽和脂肪酸（PUFA）在調(diào)節(jié)精子的膜流動性中起主要作用，然而大量的雙鍵容易被ROS氧化，因此精子極易受到氧化損傷。當(dāng)精液中的ROS含量很高時會攻擊PUFA引起一系列脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其中近60%脂肪酸流失，降低精子膜的流動性，使精子運動能力下降，并增加對離子的非特異性滲透及使膜結(jié)合的受體和酶失活而影響功能，使其不能與卵子融合，同時產(chǎn)生毒性醛，與硫醇基團(tuán)形成加合物，破壞精子蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)構(gòu)。

2.2.2 DNA損傷 精子發(fā)生過程中染色質(zhì)濃縮發(fā)生錯誤會引起DNA受到氧化攻擊，導(dǎo)致DNA損傷，ROS誘導(dǎo)的DNA損傷包括單鏈或雙鏈斷裂、堿基修飾和表觀遺傳學(xué)的改變及線粒體DNA損傷等，且線粒體DNA由于缺乏蛋白質(zhì)的保護(hù)，比核DNA更容易受到攻擊。ROS攻擊DNA上的鳥嘌呤堿基，使其氧化生成8-羥脫氧鳥苷（8OHdG）加合物，這種堿基修飾濃度較高時能持續(xù)到第一次有絲分裂的S期，并影響后期胚胎的發(fā)育。

2.2.3 精子凋亡 在精子的內(nèi)在凋亡級聯(lián)過程中觀察到的最早事件之一是線粒體ROS的生成突然增加，并伴隨精子活力的喪失。R.J.Aitken等證明，由脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的親電子醛作用于精子的線粒體，以劑量和時間依賴性方式刺激線粒體超氧化物的產(chǎn)生，造成線粒體電子泄露，并降低琥珀酸脫氫酶活性和阻礙固有凋亡級聯(lián)的后續(xù)活化，最終引起線粒體膜電位的喪失、DNA鏈的斷裂和細(xì)胞死亡。若凋亡精子進(jìn)入卵子就可能誘發(fā)突變，從而影響胎兒的發(fā)育和健康。

3 抗氧化劑在馬精液保存中的研究進(jìn)展

正常條件下，馬精液中存在著穩(wěn)定的ROS清除系統(tǒng)，通常稱為抗氧化劑，包括酶類和非酶類物質(zhì)，在清除ROS時這些成分相互協(xié)調(diào)、共同參與。在精液保存過程中，去除精清后向稀釋液中加入各種抗氧化劑，包括維生素、氨基酸等，以達(dá)到抗氧化的目的。

3.1 馬精液自身的抗氧化系統(tǒng)

馬附睪中就含有豐富的抗氧化酶，對不同品種的馬匹附睪成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）的含量并沒有差異，其含量從附睪頭部到附睪尾部保持恒定，證實了附睪中抗氧化保護(hù)的重要性。精子在射精后進(jìn)入雌性生殖道的瞬間，氧分壓發(fā)生變化，并且接觸到白細(xì)胞，從而加劇精子的氧化應(yīng)激。為了抵消這種壓力，精漿中含有豐富的抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和過氧化氫酶（CAT）。在這些酶的作用下，精液中產(chǎn)生的ROS被還原成水，以減少對精子的損傷。此外，還含有少量的維生素C、尿酸、酪氨酸等，這些小分子物質(zhì)也能夠清除精漿中的自由基。

3.2 馬精液稀釋液中抗氧化劑的研究進(jìn)展

3.2.1 酶類 在稀釋液中添加適量的抗氧化酶能增強馬精子的抗氧化能力，常添加的抗氧化酶主要是CAT、SOD和GPX，這三種酶也是精漿中的主要內(nèi)源性抗氧化劑。在精液填充劑中添加等濃度的SOD、CAT和GPX能抑制半胱天冬酶-3的激活，并改善馬精子在5℃條件下貯存72 h期間的活力和運動能力，但并不能防止ROS對DNA造成的損傷。單獨添加SOD能提高馬凍精解凍后的質(zhì)量并減少細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的活化。但也有人發(fā)現(xiàn)稀釋液中添加抗氧化酶對解凍后的馬精子并沒有顯著改善，猜測可能精子內(nèi)有足夠的抗氧化物質(zhì)保證精子免受ROS的毒害。

3.2.2 維生素類 維生素包含的種類很多，但在精液保存上應(yīng)用最多的是抗壞血酸（維生素C）和生育酚（維生素E）。在低溫保存的馬精液中添加維生素C衍生物能夠減少質(zhì)膜的氧化損傷，提高精子的運動能力；添加維生素E能夠減少脂質(zhì)過氧化，提高精子活力并增強精液的受精能力。同時，在日糧中添加維生素E也能改善種馬的精液質(zhì)量。

3.2.3 氨基酸類 氨基酸本身在精液中具有較高的濃度，在精液保存中常添加的外源性氨基酸主要是半胱氨酸（Cys），作為谷胱甘肽（GSH）的前體，可通過介導(dǎo)合成GSH發(fā)揮功能，向稀釋液中添加Cys能夠預(yù)防氧化應(yīng)激對精子的損害，提升精子的存活率，降低4-羥基壬烯醛的比例，抑制脂質(zhì)過氧化。另外，在種馬精液冷凍稀釋劑中添加谷氨酰胺、脯氨酸能顯著改善解凍后精子的活力和運動能力。

3.2.4 其他 馬精子以O(shè)XPHOS為主要代謝方式產(chǎn)生能量，比其他動物的精子更容易受到ROS的攻擊，因此可通過改變代謝途徑抑制ROS的產(chǎn)生。有人提出若將馬精子的能量代謝方式從以O(shè)XPHOS為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴墙徒鉃橹鳎湍苡行У匾种凭觾?nèi)ROS的產(chǎn)生，從而提高精子存活率。羅格列酮是一種具有非基因組活性的抗糖尿病藥物，能夠激活5′-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）并促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）的表達(dá)，增強組織對葡萄糖的攝取和利用。研究表明，它能提高馬精子對葡萄糖的利用，使線粒體代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒馔緩?，增加ATP的產(chǎn)生、提高精子的活力并減少ROS的產(chǎn)生。

4 小結(jié)

適量的ROS對于精子的生理功能不可或缺，能夠促進(jìn)精子的成熟、獲能和頂體反應(yīng)等，有利于精子和卵細(xì)胞的融合。正常生理條件下精子處于氧化平衡狀態(tài)，精液中的抗氧化系統(tǒng)將ROS維持在較低水平。當(dāng)這種平衡被打破，大量ROS產(chǎn)生造成氧化應(yīng)激，對精子造成結(jié)構(gòu)和功能上的損傷，使精子喪失與卵融合的能力。在馬精液保存過程中需要加入各種外源性抗氧化物以降低精子的氧化損傷，延長精液的保存時間。但是各種抗氧化劑的保護(hù)效果并不相同，不同抗氧化劑相互協(xié)同或發(fā)生頡頏。總的來說，未來可利用馬精子不同于其他動物精子的代謝方式尋找新型抗氧化劑，或根據(jù)ROS的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)探索常規(guī)抗氧化劑。