何坤，吳華東，張士林，劉錚錚，阮記明，孫藝文，李福貴

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045）

0 引言

【研究意義】黃鱔（Monopterus albus）又名鱔魚，隸屬于合鰓魚科（Synbranchidae）黃鱔屬（Monopterus），具有很高的營養(yǎng)與經(jīng)濟價值，是我國重要的名特優(yōu)淡水經(jīng)濟魚類品種之一。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計，2020年我國黃鱔總產(chǎn)量多達(dá)30.7萬t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2021）。黃鱔存在天然的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致其繁育親本及苗種資源稀缺，嚴(yán)重阻礙了黃鱔產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。目前，已有學(xué)者鑒定了黃鱔Sox9（劉利等，2001）、F64（蔣驕云等，2012）、piwill（陳梅，2021）、Dmrt3（宋穎等，2014）等性別決定或性腺分化相關(guān)的基因并開展其功能研究，但黃鱔性腺發(fā)育及性別分化機制尚未完全闡釋清楚。因此，鑒定與性腺發(fā)育相關(guān)的基因并開展表達(dá)分析，不僅能為黃鱔性腺發(fā)育和性別分化分子機制研究提供基礎(chǔ)資料，還可為開展黃鱔生殖細(xì)胞移植及性別控制育種研究提供參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】nanos基因最先在果蠅（Drosophila melanogaster）中發(fā)現(xiàn)，是一種母源性基因，能編碼高度保守的RNA結(jié)合蛋白（Wang and Lehmann，1991）。Nanos蛋白一般含有2個調(diào)控翻譯的特異鋅指結(jié)構(gòu)（Cys-Cys-His-Cys，CCHC）（Curtis，1997），在動物生殖細(xì)胞的存活、增殖、分化、遷移及全能性維持等方面發(fā)揮重要作用（程琳等，2020）。nanos基因在脊椎動物和非脊椎動物均已得到鑒定，在動物中一般存在1～4個nanos同源基因（de Keuckelaere et al.，2018），但在不同物種中發(fā)揮的功能不同。在果蠅中只有1個nanos基因，對其原始生殖細(xì)胞（Primordial germ cells，PGCs）的形成和遷移具有重要作用（Kobayashi et al.，1996；Wang and Lin，2004）。小鼠（Mus musculus）中含有3個nanos同源基因，其中nanos1基因在小鼠生殖細(xì)胞發(fā)育過程中不表達(dá)，且nanos1基因突變型小鼠發(fā)育正常，表明nanos1基因并非是小鼠性腺發(fā)育的必需基因（Haraguchi et al.，2003）；nanos2基因缺失突變的小鼠無法形成精原細(xì)胞，在雄性生殖細(xì)胞中特異表達(dá)，因此nanos2基因被用作小鼠雄性生殖細(xì)胞的特異分子標(biāo)記；nanos3基因在小鼠精巢和卵巢中均有表達(dá)，敲除后會影響小鼠PGCs遷移，最終導(dǎo)致無法形成生殖細(xì)胞（Tsuda et al.，2003）。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）也含有3個nanos基因，單獨缺失nanos1或nanos2基因時多數(shù)線蟲PGCs尚能正常發(fā)育，但同時缺失nanos1和nanos2基因會導(dǎo)致線蟲不孕；nanos3基因?qū)€蟲雌雄轉(zhuǎn)換具有調(diào)節(jié)作用（Kraemer et al，1999）。斑馬魚（Danio rerio）雖然也含有3個nanos3基因，但與小鼠、線蟲等動物的作用機制不同，其中nanos1基因在早期卵母細(xì)胞中表達(dá)（Draper et al.，2007）；nanos2基因在生殖干細(xì)胞中表達(dá)；nanos3基因在PGCs和生殖干細(xì)胞中均呈特異性表達(dá)，介導(dǎo)斑馬魚PGCs的形成和遷移，同時對斑馬魚卵母細(xì)胞的產(chǎn)生與維持起關(guān)鍵作用（Doerks et al.，2002；Saito et al.，2006；Beer and Draper，2013）。此外，在青鳉（Oryzias latipe）（Kurokawa et al.，2010；Guan et al.，2013）、鯉（Cyprinus carpio）（Kawakami et al.，2011）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）（Saito et al.，2011）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）（Li et al.，2015）、團頭魴（Megalobrama amblycephala）（朱林等，2019）、、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Zhou et al.，2019）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）（Zhang et al，2022）等十幾種魚類中也鑒定出nanos3基因并開展其功能研究。由于nanos3基因具有特異的生殖細(xì)胞表達(dá)特征，通過其3′非編碼區(qū)（3′-UTR）與熒光蛋白結(jié)合，實現(xiàn)PGCs的可視化分子標(biāo)記，為魚類PGCs移植提供了便利條件?！颈狙芯壳腥朦c】作為低等脊椎動物模型代表，黃鱔在幼體階段時性腺均單向分化形成卵巢，但在產(chǎn)卵后發(fā)生性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，由雌性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌?，黃鱔天然的性逆轉(zhuǎn)規(guī)律和調(diào)控機制使其成為研究脊椎動物性別分化發(fā)育機制的重要動物模型（Cheng et al.，2003；范淼等，2021），而具有較高的研究價值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆黃鱔nanos3基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)、組織表達(dá)特征及性腺中細(xì)胞定位分析，明確nanos3基因在黃鱔卵巢發(fā)育和維持過程中的重要作用，為黃鱔PGCs可視化分子標(biāo)記、生殖細(xì)胞移植及性腺發(fā)育分化機制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從贛江支流中收集野生黃鱔個體156尾（體重40～250 g），雌雄比例約3∶1，養(yǎng)殖于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)實踐教學(xué)基地的300 L藍(lán)色養(yǎng)殖桶內(nèi)，恢復(fù)攝食后每天正常投喂2次水蚯蚓，養(yǎng)殖1周后進(jìn)行采樣。以0.05%的MS-222將雌、雄各5尾黃鱔（表1）麻醉后，解剖采集其心臟、腎臟、脾臟、腦、卵巢/精巢、肌肉（背部白?。⒏闻K、腸道（后腸）和血液等組織樣品，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫鹘M織樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

表1 供試黃鱔的生長數(shù)據(jù)Table 1 Growth data of tested M.albus

1.2 黃鱔組織總RNA提取

采用TRIGene法（GenStar）提取黃鱔各組織總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計（NanoDrop 2000）檢測其質(zhì)量及濃度合格后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃鱔nanos3基因全長cDNA序列克隆

在GenBank中檢索已知物種的nanos3基因序列，通過ClustalX 2比對分析獲得保守區(qū)，然后使用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0設(shè)計擴增引物（表2）。以黃鱔卵巢組織總RNA為模板，利用StarSciptⅡ試劑盒（GenStar）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系10.0μL：2×TaqPCR StarMix 5.0μL，cDNA模板0.8μL，上、下引物各0.4 μL，DEPC水3.4μL。擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行34個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

根據(jù)獲得的黃鱔nanos3基因中間片段序列，設(shè)計RACE擴增引物（表2），然后按照Invitrogen Race Manual說明進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)柱式DNA純化試劑盒（GenStar）純化回收后，連接至pMD18-T載體，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定呈陽性的克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)SeqMan拼接即得到黃鱔nanos3基因全長cDNA序列（李創(chuàng)舉等，2016）。

表2 黃鱔nanos3基因克隆、表達(dá)檢測及原位雜交分析有關(guān)引物序列信息Table 2 Cloning，expression and in situ hybridization analysis of nanos3 gene in M.albus

1.4 黃鱔nanos3基因生物信息學(xué)分析

基于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行nanos3基因序列比對分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用SeqBulider進(jìn)行開放閱讀框（ORF）查找及氨基酸序列推導(dǎo)；運用GeneDoc 3.2進(jìn)行氨基酸序列多重比對分析，并以MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Bootstrap設(shè)為1000次）；同時參照張俊杰等（2021）的方法分別進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)（ProtParam）、二級結(jié)構(gòu)（SOMPA）、三級結(jié)構(gòu)（SWISS-MODEL）、信號肽（SignalP）、跨膜結(jié)構(gòu)域（TMHMM）及磷酸位點（Net-Phos）等預(yù)測分析。

1.5 黃鱔nanos3基因組織表達(dá)特征分析

利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0設(shè)計實時熒光定量PCR擴增引物（表2），以β-actin為內(nèi)參基因，雌性血液組織為參照組織，采用實時熒光定量PCR檢測nanos3基因在雌、雄黃鱔不同組織中的表達(dá)水平。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系10.0μL：SYBR TB Green 5.0μL，ROX 0.2μL，cDNA模板1.0μL，上、下引物各0.4μL，DEPC水3.0μL。在熒光定量PCR儀上（Applied Biosystems Step One plusTM）進(jìn)行擴增，擴增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃15 s，60℃1 min，進(jìn)行40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，用于繪制熔解曲線以判斷擴增產(chǎn)物的正確性。采用2–ΔΔCt法計算nanos3基因在雌、雄黃鱔不同組織中的相對表達(dá)量。

1.6 冰凍切片熒光原位雜交

設(shè)計探針引物（表2）并委托武漢賽維爾生物科技有限公司合成。經(jīng)4% PFA固定過夜的黃鱔精巢和卵巢組織用30%蔗糖進(jìn)行通透處理，OCT（Servicebio）包埋后冰凍切片，切片厚度為精巢7μm、卵巢8μm，利用合成的地高辛標(biāo)記RNA探針進(jìn)行冰凍切片熒光原位雜交（Ye et al.，2017），以抗淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡（Nikon）下觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0進(jìn)行LSD多重比較和單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔nanos3基因cDNA序列及其氨基酸序列分析結(jié)果

獲得的黃鱔nanos3基因cDNA序列全長1289 bp，包括147 bp的5′非編碼區(qū)（5′-UTR）、531 bp的ORF及611 bp的3′非編碼區(qū)（3′-UTR），共編碼176個氨基酸殘基（圖1），提交至GenBank獲得登錄號為OM049822。CD-Search預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在黃鱔Nanos3氨基酸序列第108～162位處存在2個鋅指基序“CCHC”結(jié)構(gòu)域，符合Nanos蛋白的結(jié)構(gòu)域特征。黃鱔Nanos3蛋白二級結(jié)構(gòu)（圖2）中，以無規(guī)則卷曲（紫色字母c）的占比最高（64.20%），其次是α-螺旋（藍(lán)色字母h，占24.43%），延伸鏈（紅色字母e）、β-轉(zhuǎn)角（綠色字母t）的占比分別為6.82%和4.55%；通過SWISS-MODEL預(yù)測黃鱔Nanos3蛋白三級結(jié)構(gòu)，也發(fā)現(xiàn)存在2個明顯的鋅指基序（圖3）。

2.2 黃鱔Nanos3氨基酸序列同源比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

Nanos3氨基酸序列多重比對分析結(jié)果（圖4）表明，黃鱔Nanos3氨基酸序列與其他物種的Nanos3氨基酸序列具有較高的相似性，其中，與大刺鰍（Mastacembelus armatus，XP_026159755.1）的相似性最高，達(dá)67.5%；與射水魚（Toxotes jaculatrix，XP_040892 060.1）、貝氏虹銀漢魚（Melanotaenia boesemani，XP_041837874.1）、黃姑魚（Nibea albiflora，KAG80151 77.1）等鱸形目魚類的相似性分別為57.2%、56.4%和56.0%；與鯉魚（Cyprinus carpio，XP_018975458.2）、團頭魴（Megalobrama amblycephala，AYJ22255.1）、斑 馬 魚（Danio rerio，NP_571953.1）、異 育 銀 鯽（Carassius gibelio，AKP99418.1）等鯉形目魚類的相似性分別為51.2%、50.6%、50.3%和50.3%；與哺乳類動物及兩棲類動物的相似性較低，尤其是與人類（Homo sapiens，NP_001092092.1）、小鼠（BAC8255 8.1）、中國林蛙（Rana temporaria，XP_040197996.1）和粗皮蛙（Glandirana rugosa，BBA26465.1）的相似性較低，分別為33.3%、30.9%、39.3%和30.3%。綜上所述，Nanos3蛋白在進(jìn)化過程中相對保守，黃鱔與鱸形目魚類的相似性更高，其次是鯉形目魚類，與哺乳類和兩棲類等動物的相似性較低，符合傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)結(jié)果。

基于Nanos3氨基酸序列相似性，通過MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）顯示，黃鱔先與射水魚、黃姑魚、大刺鰍及貝氏虹銀漢魚聚為一支，再與鯉魚、團頭魴、斑馬魚、異育銀鯽等鯉形目魚類聚類成一大分支；兩棲類動物中粗皮蛙和中國林蛙聚為一支；哺乳類動物人類和小鼠聚為一支?？梢姡S鱔與鱸形目魚類的親緣關(guān)系較近，其次為鯉形目魚類，其進(jìn)化過程符合自然物種進(jìn)化理論。

2.3 黃鱔Nanos3蛋白理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽、磷酸化位點及亞細(xì)胞定位預(yù)測分析結(jié)果

黃鱔Nanos3蛋白的理論等電點（pI）為9.07，為堿性蛋白；化學(xué)分子式為C859H1323N245O255S14，，分子量為19.61 kD。絲氨酸（Ser）在黃鱔Nanos3蛋白序列中的含量最高，占10.23%；其次是脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly），分別占9.09%和7.95%；精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酸（Glu）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、天冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）、天冬酰胺（Asn）、組氨酸（His）、蛋氨酸（Met）含量分別占6.82%、6.82%、6.82%、5.68%、5.11%、5.11%、5.11%、5.11%、4.55%、3.98%、3.98%、2.84%、2.84%和2.84%；谷氨酰胺（Gln）、異亮氨酸（Ile）、色氨酸（Trp）的含量最低，各占1.70%（圖6），其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)為16個、帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)為24個。黃鱔Nanos3蛋白序列無跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽，存在20個磷酸化位點（圖7），包括10個絲氨酸磷酸化位點、8個蘇氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點。黃鱔Nanos3氨基酸序列亞細(xì)胞分型分布在細(xì)胞核內(nèi)的概率高達(dá)87.0%，分布在線粒體及過氧化物酶體中的概率分別為8.7%和4.3%，進(jìn)一步說明黃鱔nanos3基因與其核遺傳信息的傳遞相關(guān)。

2.4 nanos3基因在黃鱔不同組織中的表達(dá)情況

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，nanos3基因在黃鱔肌肉中不表達(dá)，在精巢、腎臟、脾臟、腦、肝臟、腸道、心臟和血液中的相對表達(dá)量較低，但在卵巢中的相對表達(dá)量最高（圖8），極顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量（P＜0.01），呈明顯的組織特異性表達(dá)模式。

2.5 黃鱔nanos3基因在性腺中的定位情況

為進(jìn)一步探究黃鱔nanos3基因在性腺中的表達(dá)特征，通過冰凍切片熒光原位雜交分析黃鱔nanos3基因在精巢和卵巢中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖9）顯示，黃鱔nanos3基因僅在生殖細(xì)胞中表達(dá)，支持細(xì)胞中未見表達(dá)。在精巢中，黃鱔nanos3基因在精原細(xì)胞中表達(dá)（圖9-A），且主要是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，細(xì)胞核中僅有少量表達(dá)（圖9-B和圖9-C）；在卵巢中，黃鱔nanos3基因在I期和II期卵母細(xì)胞及卵原細(xì)胞中大量表達(dá)（圖9-D），且與精巢的表達(dá)模式相似，以細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)為主，在細(xì)胞核中呈微弱表達(dá)（圖9-E和圖9-F）。

3 討論

本研究利用RACE克隆獲得的黃鱔nanos3基因cDNA序列全長為1289 bp，其中ORF為531 bp，共編碼176個氨基酸殘基。黃鱔與其他物種的Nanos3氨基酸序列多重比對分析結(jié)果表明，隸屬于合鰓目的黃鱔與射水魚、黃姑魚、大刺鰍及貝氏虹銀漢魚等鱸形目魚類高度同源，與鯉魚、團頭魴、斑馬魚、異育銀鯽等鯉形目魚類的相似性次之，而與哺乳類動物和兩棲類動物的相似性較低；基于Nanos3氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示，黃鱔先與射水魚、黃姑魚、大刺鰍及貝氏虹銀漢魚聚為一支，再與鯉魚、團頭魴、斑馬魚、異育銀鯽等鯉形目魚類聚類成一大分支，即黃鱔與鱸形目魚類的親緣關(guān)系較近，其次是鯉形目魚類，其進(jìn)化過程符合自然物種進(jìn)化理論（Li et al.，2015；鐘東明等，2020）。

黃鱔Nanos3蛋白由20種氨基酸組成，分子量為19.61 kD，pI為9.07，亞細(xì)胞定位主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，故推測其可能與核遺傳信息功能相關(guān)，與Doerks等（2002）的研究結(jié)果相似。黃鱔Nanos3蛋白二級結(jié)構(gòu)中以無規(guī)則卷曲占比最高（64.20%），其次是α-螺旋（占24.43%），延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角分別占6.82%和4.55%；其三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)存在2個明顯的鋅指結(jié)構(gòu)域，與其他已知物種的Nanos3蛋白序列結(jié)構(gòu)域相同（Andries et al.，2019）。黃鱔Nanos3蛋白序列無跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽，存在20個磷酸化位點，包括10個絲氨酸磷酸化位點、8個蘇氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點。磷酸化位點對細(xì)胞功能和蛋白調(diào)節(jié)起重要作用，磷酸化位點突變可能會導(dǎo)致蛋白降解，進(jìn)而影響生殖細(xì)胞的發(fā)育過程（Yamaji et al.，2010）。因此，推測黃鱔的性逆轉(zhuǎn)與Nanos3磷酸化位點的突變有關(guān)，但具體機理有待進(jìn)一步探究驗證。

nanos3基因?qū)υ忌臣?xì)胞的遷移具有調(diào)控作用，在卵母細(xì)胞的產(chǎn)生和維持及生殖細(xì)胞發(fā)育分化過程中發(fā)揮重要作用（于萌等，2012）。已有研究證實，nanos3基因在大黃魚（Larimichthys crocea）卵巢中高表達(dá)，在精巢和肝臟中有少量表達(dá)（Han et al.，2018）；nanos3基因同樣在團頭魴卵巢中高表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)（朱林等，2019）；而在粗皮蛙等兩棲類動物中，nanos3基因在精巢中高表達(dá)，在卵巢、腎臟和肺臟中有少量表達(dá)（Kodama et al.，2018）；在羊、人類等哺乳動物中，nanos3基因腦、卵巢、肝臟及睪丸等組織中均有表達(dá)，但以在睪丸中的表達(dá)量相對較高（Grelet et al.，2015；Zhao et al.，2020；Yang et al.，2022）。本研究結(jié)果表明，在雌性黃鱔中，nanos3基因在卵巢中高表達(dá)，在其他組織如肝臟、脾臟、腸道等中有少量表達(dá)；在雄性黃鱔中，nanos3基因在精巢中有少量表達(dá)，而其他組織中幾乎不表達(dá)。由此可知，nanos3基因在不同物種間的表達(dá)模式存在明顯差異，黃鱔nanos3基因的表達(dá)模式介于兩棲類和魚類之間，可能與基因互作關(guān)系有關(guān)（Suzuki et al.，2014）。此外，冰凍切片熒光原位雜交結(jié)果顯示黃鱔nanos3基因在生殖細(xì)胞中大量表達(dá)，而在支持細(xì)胞中不表達(dá)，與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果基本吻合。大鼠和人類的研究結(jié)果也表明，nanos3基因在生殖細(xì)胞中高表達(dá)，在體細(xì)胞中微弱表達(dá)，甚至不表達(dá)（J?rgensen et al.，2012；Kim et al.，2018），進(jìn)一步證實nano3基因是脊椎動物性腺發(fā)育及分化相關(guān)的功能基因。

4 結(jié)論

黃鱔nanos3基因進(jìn)化相對保守，主要在卵巢的生殖細(xì)胞中表達(dá)，且以細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)為主，與核遺傳信息的傳遞相關(guān)，是黃鱔性腺發(fā)育及分化相關(guān)的功能基因。