韋悠，謝芝勛，鄧顯文，李小鳳，謝志勤，范晴，張艷芳，黃嬌玲，王盛

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

0 引言

【研究意義】血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)AdV-4）感染會(huì)導(dǎo)致以高發(fā)病率和高死亡率為特征的心包積液-肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）。該病毒自2015年起在我國山東、河南、湖北、湖南、廣西、廣東等家禽養(yǎng)殖大?。▍^(qū)）爆發(fā)，導(dǎo)致3～6周齡雛雞14%～80%的死亡率（Guan et al.，2018；張蕾等，2020）。因此，F(xiàn)AdV-4診斷技術(shù)的研究近年已成為熱點(diǎn)。開展FAdV-4的Fiber-2蛋白截短表達(dá)及單克隆抗體制備研究對(duì)建立快速靈敏的病毒檢測方法具有重要的研究意義。【前人研究進(jìn)展】Fiber-2為FAdV-4病毒粒子外殼表面往外伸出的“天線”狀蛋白，為病毒與宿主細(xì)胞首要互作蛋白，具有特異性的抗原決定簇，可作為FAdV診斷的靶蛋白（Marek et al.，2012；Kulanayake and Tikoo，2021；Sohaimi and Hair-Bejo，2021）。研究表明，F(xiàn)iber-2蛋白與宿主蛋白KPNA3/4互作會(huì)顯著影響病毒對(duì)宿主的感染及致病力（段文麗，2018；謝泉，2021）；決定FAdV-4致病性之一的重要因素是Fiber-2蛋白，F(xiàn)iber-2發(fā)生變化可引起病毒致病性的改變（Zhang et al.，2018）。Gupta等（2017）、Wang等（2018）通過動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)AdV-4病毒顆粒結(jié)構(gòu)蛋白中Fiber-2免疫原性最佳，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體抵御腺病毒的感染，免疫蛋白50μg/羽時(shí)可達(dá)100%攻毒保護(hù)率。程增青等（2020）、劉建勛等（2020）利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Fiber-2蛋白，通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可給予雞只100%的保護(hù)。可見，F(xiàn)iber-2可作為FAdV-4亞單位疫苗及檢測試劑盒首選蛋白。王萍（2018）用FAdV-4以全病毒免疫小鼠后，以Fiber-2原核表達(dá)產(chǎn)物為篩選抗原研發(fā)單克隆抗體。劉娜（2018）亦用Fiber-2和Hexon蛋白篩選單克隆抗體并研制膠體金試紙。He等（2018）建立了以Fiber-2重組蛋白為基礎(chǔ)的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法，可準(zhǔn)確、靈敏鑒定FAdV-4和監(jiān)測其分子流行病學(xué)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】優(yōu)化密碼子并截取Fiber-2蛋白抗原性集中的N端1～267 aa片段進(jìn)行表達(dá)，可有效提高翻譯效率及抗原性，目前未見相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】按照大腸桿菌密碼子偏好性，對(duì)FAdV-4編碼的Fiber-2蛋白序列進(jìn)行優(yōu)化，并截取抗原性集中的N端1～267 aa片段，構(gòu)建其蛋白顆粒作為免疫原制備單克隆抗體，將獲得重組蛋白及特異性佳的單克隆抗體用于病毒檢測試劑盒研發(fā)，為建立快速靈敏的病毒檢測方法提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Sp2/0細(xì)胞、LMH細(xì)胞、FAdV-4陽性雞血清、pET-32a（+）載體、禽流感病毒（AIV）、雞新城疫病毒（NDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）和減蛋綜合征病毒（EDS）由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；BALB/c小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞和Trans8K DNA Marker購自全式金公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ、HindⅢ、DNA Ligation Kit（Mighty Mix）購自TaKaRa；高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液、苯甲基黃酰氟（PMSF）、溶菌酶、蛋白電泳預(yù)制膠（4%～15%）、彩虹180、245廣譜蛋白Marker和考馬斯亮藍(lán)染色液購自Solarbio公司；E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit、E.Z.N.A.?Plasmid Mini KitⅡ試劑盒購自O(shè)mega公司；堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記山羊抗雞IgG（H+L）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；弗氏不完全佐劑、弗氏佐劑、秋水仙素、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基和PEG4000購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Abcam公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Seracare公司；小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因選取及引物設(shè)計(jì)用Thermo GeneArt在線工具GeneArt?GeneOptimizer?對(duì)FAdV-4-GX2019-010（MW439040）的Fiber-2基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由深圳華大基因科技有限公司合成序列。利用DNAStar 7.1中Protean對(duì)Fiber-2蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，綜合考慮抗原性、親水性及表面可及性，從Fiber-2基因序列1～801 bp進(jìn)行截取，對(duì)應(yīng)編碼氨基酸序列為1～267 aa。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Fiber-2基因引物，引物序列為F：5′-CCCGA TATCATGCTGCGTGCACCGAA-3′；R：5′-CCCAAG CTTTTAGGTCACCGCCAGGGTAT-3′，下劃線處分別為EcoRⅤ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 基因片段擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建以優(yōu)化后合成Fiber-2基因片段作為模板，利用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase進(jìn)行高保真擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：98℃5 min；98℃10 s，55℃5 s，72℃60 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，將其連接至pGEX-20T載體從而獲得重組載體，并利用EcoRⅤ和HindⅢ內(nèi)切酶對(duì)其和pET-32a（+）空載體進(jìn)行雙酶切，將酶切后的目的片段與pET-32a（+）連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。培養(yǎng)12 h后，挑選白色、單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行雙酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)及可溶性鑒定挑取含測序?qū)Ρ刃蛄姓_的pET-32a（+）-Fiber-2重組質(zhì)粒陽性菌，經(jīng)含氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)，待OD600nm約0.8時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取誘導(dǎo)后的菌泥加入含1%PMSF的細(xì)胞裂解液和5×蛋白上樣緩沖液煮沸10 min、冰浴10 min、超聲裂解4 s后，用蛋白電泳預(yù)制膠（4%～15%）進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，檢測重組蛋白表達(dá)情況。

將誘導(dǎo)后的菌泥用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，加入溶菌酶和PMSF混勻后，冰上超聲裂解至溶液澄清，12000 r/min離心4 min，收集上清和沉淀，沉淀加入PBS重懸。分別取上清和重懸后的沉淀各100 μL，加入25μL 5×蛋白上樣緩沖液后，煮沸10 min，冰浴10 min，13000 r/min離心2 min，用蛋白電泳預(yù)制膠（4%～15%）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察重組蛋白是否在上清或沉淀中表達(dá)。

1.2.4 重組蛋白純化將含pET-32a（+）-Fiber-2的陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后12000 r/min離心10 min收集菌體，加入細(xì)菌裂解液（含PMSF和溶菌酶），漩渦振蕩混勻，冰上超聲裂解至菌液變清后，12000 r/min，4℃離心15 min，收集沉淀。將沉淀充分溶解于Binding Buffer中，加到預(yù)處理的Ni-Agarose Resin層析柱中結(jié)合20 min，依次按含25、50、75、100、125、150、175和200 mmol/L咪唑的Elution Buffer梯度沖洗柱子，然后對(duì)洗脫液用蛋白電泳預(yù)制膠（4%～15%）進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測并拍照觀察純化結(jié)果。

1.2.5 Western blotting鑒定將pET-32a（+）空載體和pET-32a（+）-Fiber-2表達(dá)蛋白用蛋白電泳預(yù)制膠（4%～15%）進(jìn)行SDS-PAGE電泳（80 V，90 min）。不需染色直接進(jìn)行半干轉(zhuǎn)?。篜DVF膜在甲醇中激活10 s，將濾紙2張、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜和蛋白膠放于轉(zhuǎn)膜液中浸泡10 min，從下到上按濾紙-PVDF膜-蛋白膠-濾紙整齊放置，設(shè)定程序：25 V，30 min，將重組蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用20 mL 5%脫脂奶37℃封閉4 h，用含Tween的Tris-HCl緩沖液（TBST）洗滌1次后加入2 mL 1∶200稀釋FAdV-4陽性雞血清，4℃過夜孵育。用1×TBST洗滌4次，加入2 mL 1∶500稀釋的AP標(biāo)記山羊抗雞IgG（H+L），37℃孵育1 h。然后用TBST洗滌4次，加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑蘭（BCIP/NBT）顯色液，室溫避光顯色30 min后觀察結(jié)果。

1.2.6 動(dòng)物免疫及細(xì)胞融合選擇9～11周齡的BALB/c小白鼠，將純化后的蛋白（約5 mg/mL）與完全弗氏佐劑等體積混合乳化，按30～40μg/只分多點(diǎn)皮下注射。間隔2周使用不完全弗氏佐劑乳化蛋白后進(jìn)行第2、第3次免疫，按30～40μg/只進(jìn)行腹腔注射。第3次免疫后2周采小鼠血清測效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)達(dá)1∶5000以上時(shí)可用于融合試驗(yàn)。融合前3 d注射無佐劑蛋白200μg/只作超強(qiáng)免疫。無菌取小鼠脾臟碾碎后用篩網(wǎng)過濾獲得細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后與狀態(tài)良好的Sp2/0細(xì)胞按5∶1比例混合，在40℃的50%聚乙二醇4000（PEG4000）作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.7 雜交瘤細(xì)胞篩選用含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷的HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)融合細(xì)胞。待融合后5～6 d觀察標(biāo)記有單細(xì)胞群落的細(xì)胞培養(yǎng)孔，在融合后12～14 d收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用200μL/孔FAdV-4病毒液（105TCID50/mL）作為包被底物、空白骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照、免疫小鼠血清作為陽性對(duì)照建立ELISA，對(duì)融合細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。將OD450nm值為陽性的孔用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行3次單細(xì)胞亞克隆。亞克隆的細(xì)胞在培養(yǎng)10 d后均取細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行ELISA檢測。選取生長狀態(tài)穩(wěn)定、分泌抗體效價(jià)高且穩(wěn)定的細(xì)胞株進(jìn)行保存。

1.2.8 單克隆抗體生物學(xué)特性分析抗體分泌穩(wěn)定性的分析：在液氮冷凍保存雜交瘤細(xì)胞后6個(gè)月復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代，在傳至5、10和15代時(shí)收獲細(xì)胞上清液測定ELISA OD450nm值，用于評(píng)估細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性。腹水抗體效價(jià)檢測：對(duì)BALB/c小白鼠腹腔注射滅菌石蠟油（0.5 mL/只），7 d后收集培養(yǎng)的陽性雜交瘤細(xì)胞，用PBS稀釋至106個(gè)/mL后注射入小鼠腹腔（0.5 mL/只），待小白鼠的腹腔明顯增大時(shí)，用注射器收獲腹水，然后測定腹水ELISA OD450nm值檢測效價(jià)。采用秋水仙素裂解法檢查染色體數(shù)目：將培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞加入秋水仙素（終濃度0.04 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心取細(xì)胞泥加入預(yù)熱37℃的KCl溶液（0.075 mol/L）在37℃作用20 min后，加入固定液（含3/4甲醇及1/4冰醋酸）固定，將固定后的細(xì)胞滴在冰預(yù)后的載玻片上火焰固定，自然干燥，用姬姆薩染色后，油鏡觀察，進(jìn)行50個(gè)細(xì)胞/樣品的染色體計(jì)數(shù)，判斷其穩(wěn)定性。單克隆抗體亞型鑒定：取5株陽性雜交瘤克隆株的培養(yǎng)上清液，按照小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒的步驟判斷其重鏈和輕鏈的抗體亞型。

1.2.9 單克隆抗體特異性檢測將AIV、NDV、IBV、EDS和FAdV病毒作為包被抗原（0.1μg/孔），雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液1000倍稀釋作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 5000倍稀釋作為二抗進(jìn)行ELISA OD450nm值測定，用于評(píng)估其特異性，同時(shí)設(shè)PBS為陰性對(duì)照、pET-32a（+）-Fiber-2為陽性對(duì)照。

1.2.1 0 單克隆抗體間接免疫熒光將LMH細(xì)胞在48孔板培養(yǎng)至80%～90%，接種FAdV-4病毒（105TCID50/mL）0.2 mL/孔，同時(shí)設(shè)立未感染的LMH細(xì)胞作為陰性對(duì)照。37℃吸附1 h后用PBS清洗2次，用細(xì)胞維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～30 h。棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的甲醛（含3% H2O2）固定細(xì)胞后，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清稀釋1000倍為一抗作用1 h，再用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）稀釋2000倍為二抗作用1 h，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子優(yōu)化及目的基因選取結(jié)果

對(duì)FAdV-4的Fiber-2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化（圖1），使其更符合大腸桿菌原核表達(dá)的密碼子偏好性。按照Fiber-2蛋白的理化特性選取圖示區(qū)域?yàn)槟康钠?，大小約801 bp（圖2）。

2.2 基因片段擴(kuò)增及重組表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)優(yōu)化后的Fiber-2基因截短片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得單一條帶約801 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3）。pET-32a（+）-Fiber-2重組表達(dá)質(zhì)粒用EcoRⅤ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用1.5%水平瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2條條帶，分別與pET-32a（+）載體和Fiber-2基因截短片段的長度符合（圖4），表明插入pET-32a（+）載體的目的片段正確，即成功構(gòu)建pET-32a（+）-Fiber-2重組表達(dá)質(zhì)粒。

2.3 重組蛋白表達(dá)和可溶性鑒定結(jié)果

對(duì)含pET-32a（+）-Fiber-2重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，以含pET-32a（+）空載體菌株為對(duì)照，含pET-32a（+）-Fiber-2重組表達(dá)質(zhì)粒的陽性菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生一條特異性的蛋白條帶，大小約67 kD，與預(yù)期結(jié)果相符（圖5）。將誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行超聲裂解，取全菌液、裂解后上清液和裂解后沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fiber-2截短重組蛋白主要存在于裂解破碎菌體后的沉淀中，大部分以包涵體形式表達(dá)（圖6）。

2.4 重組蛋白純化結(jié)果

將Fiber-2截短重組蛋白使用Ni-Agarose Resin層析柱通過包涵體純化方式純化后，大部分雜蛋白被去掉，得到了較純的蛋白條帶（圖7）。

2.5 Western blotting鑒定結(jié)果

FAdV-4陽性血清與表達(dá)蛋白大約在67 kD處發(fā)生反應(yīng)，而空載體對(duì)照此處無特異性條帶，表明Fiber-2截短重組蛋白正確表達(dá)。

2.6 單克隆抗體生物學(xué)特性分析結(jié)果

抗體分泌穩(wěn)定性分析結(jié)果（表1）顯示，雜交瘤細(xì)胞凍存6個(gè)月后連續(xù)傳15代，從ELISA檢測結(jié)果來看，5株細(xì)胞抗體分泌均達(dá)1∶1600～1∶6400，穩(wěn)定性良好。腹水抗體效價(jià)檢測結(jié)果（表1）顯示，5株雜交瘤細(xì)胞均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高效價(jià)抗體，效價(jià)達(dá)1∶320000～1∶1280000。染色體數(shù)目形態(tài)及數(shù)目檢查結(jié)果（表2）顯示，5個(gè)瘤株均能觀察到形態(tài)清晰，狀態(tài)較一致的染色體，染色體數(shù)目為94～110條，且標(biāo)準(zhǔn)差（SD）為2.6～4.2，符合雜交瘤細(xì)胞特性。單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果顯示，2C2、4F6和10B5雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體重鏈為IgG2b亞型，輕鏈為Kappa鏈；5A5和6G10雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體重鏈為IgG1亞型，輕鏈為Kappa鏈。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)液上清及腹水抗體效價(jià)檢測Table 1 Antibody titers detection of cell culture supernatant and ascites

表2 5株雜交瘤細(xì)胞的染色體形態(tài)及數(shù)目鑒定結(jié)果Table 2 Identification results on chromosomes of 5 MAb cell lines

2.7 單克隆抗體特異性檢測結(jié)果

將2C2、4F6、5A5、6G10和10B5雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體與AIV、NDV、IBV、EDS、FAdV病毒進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示5株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體只與FAdV病毒產(chǎn)生良好反應(yīng)，而與其他病毒無交叉反應(yīng)，說明5株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體具有良好的特異性。

2.8 單克隆抗體IFA檢測結(jié)果

以5株雜交瘤細(xì)胞分泌的多克隆抗體作為一抗，與感染FAdV-4的LMH細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測，經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在感染細(xì)胞中均產(chǎn)生明顯的熒光反應(yīng)，均為陽性。

3 討論

與操作復(fù)雜、造價(jià)昂貴、蛋白產(chǎn)量低的真核表達(dá)系統(tǒng)相比，使用基于大腸桿菌的原核表達(dá)來生產(chǎn)

反應(yīng)原蛋白步驟更簡單、可操作性更強(qiáng)，易于檢測試劑盒的商品化（Kaur et al.，2018）。但不同物種有著不同的密碼子偏好性，若目的蛋白中含有大量大腸桿菌低頻或稀有密碼子會(huì)嚴(yán)重降低重組蛋白的表達(dá)水平，甚至?xí)?dǎo)致錯(cuò)配（蔡海鶯等，2013；楊云彭等，2019）。陳云雨等（2021）使用JAVA Condon Adaption Tool對(duì)SARS-CoV-2的Mpro基因進(jìn)行序列優(yōu)化，目的蛋白表達(dá)量提升至15 mg/L。本研究使用Thermo GeneArt在線工具GeneArtTMGeneOptimizer?對(duì)Fiber-2基因的密碼子按照大腸桿菌偏好性進(jìn)行優(yōu)化后，將IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)間由原來的37℃8 h縮短為37℃2 h，且蛋白收獲量相同。

目前國內(nèi)已有Fiber-2蛋白可溶性表達(dá)的報(bào)道，如梅梅等（2019）、張婷（2021）利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Fiber-2蛋白可溶性表達(dá)；郭瑞珍等（2021）通過使用促溶標(biāo)簽的原核表達(dá)載體獲得可溶性Fiber-2蛋白，具有良好的反應(yīng)原性和免疫原性。本研究通過20℃低溫誘導(dǎo)12 h獲得可溶性的Fiber-2截短蛋白，但在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在4℃條件下包涵體蛋白較可溶性蛋白不易降解，便于使用Ni-Agarose Resin層析柱純化，且通過與FAdV-4陽性血清進(jìn)行WB檢測發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白與包涵體蛋白反應(yīng)原性相同，為構(gòu)建易于保存運(yùn)輸?shù)腅LISA試劑盒良好包被底物，本研究采用了包涵體表達(dá)的試驗(yàn)方法。

杜春紅等（2012）研究表明，雜交瘤細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定，同株各細(xì)胞染色體數(shù)量SD＞5.0時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致抗體分泌能力的喪失。本研究獲得的5株雜交瘤細(xì)胞，并用秋水仙素裂解檢測染色體數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目為94～110，SD為2.6～4.2，說明這些雜交瘤細(xì)胞為Sp2/0細(xì)胞（染色體數(shù)目為40）和小鼠脾細(xì)胞（染色體數(shù)目為62～72）的雜合體。在4次亞克隆篩選中雜交瘤細(xì)胞大小均勻一致、形態(tài)渾圓、生長速度穩(wěn)定，細(xì)胞上清陽性率均為100%，在傳至15代后分泌抗體效價(jià)穩(wěn)定未降低；通過IFA試驗(yàn)證實(shí)可與FAdV-4病毒結(jié)合，說明該抗體具有與病毒結(jié)合的構(gòu)象表位，且已知其對(duì)應(yīng)于Fiber-2蛋白N端1～267 aa片段，可用于進(jìn)一步研究蛋白在宿主細(xì)胞中的分布定位和表達(dá)變化及膠體金等病毒檢測試劑盒的研發(fā)。

4 結(jié)論

制備的Fiber-2截短重組蛋白及單克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性和特異性，可用于FAdV-4病毒檢測試劑盒研發(fā)。