“金花”菌對四種茶葉下腳料中茶多糖含量及抗氧化活性的影響

高 琛，羅 智，劉榮杰，馬 玲，戴 栩，周曉紅

湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院/黑茶“金花”湖南省重點實驗室，湖南 益陽 413000

茶作為世界上最受歡迎的天然植物飲料之一，因富含茶多酚、茶氨酸、茶多糖等多種生理活性成分而具有眾多有保健功效進而被消費者日漸青睞。茶多糖是茶的功能成分中一種重要的生理活性物質(zhì)，已被大量文獻報道具有抗氧化、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血壓、抗輻射、抗凝血和抗疲勞等功效[1-4]。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是一種茯磚茶發(fā)花過程中的優(yōu)勢微生物，因其色澤金黃而俗稱“金花”?，F(xiàn)有研究表明，冠突散囊菌在生長過程中利用茶葉的營養(yǎng)成分作為生長基質(zhì)，同時產(chǎn)生各種微生物胞外酶作用于茶葉中的一些大分子物質(zhì)，如纖維素、果膠質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)等導(dǎo)致其分解、轉(zhuǎn)化和降解成其他物質(zhì)，從而改善茶葉品質(zhì)[5-6]。近年來，大量相關(guān)研究證明冠突散囊菌所發(fā)酵的茶葉或其他代謝產(chǎn)物具有抑菌、抗輻射、降脂、降糖、抗氧化、增強免疫及減肥等保健作用[7-10]。

由于茶多糖和冠突散囊菌突出的保健功效成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點，已有較多研究報道綠茶、紅茶、烏龍茶中茶多糖的含量與抗氧化活性以及散茶發(fā)花后化學(xué)成分的變化[11-14]。但針對茶葉下腳料發(fā)花后茶多糖含量及其抗氧化活性的研究目前比較少見。本試驗利用“金花”發(fā)酵液分別將黑茶、綠茶、紅茶和茉莉花茶的下腳料制作成“金花”散茶，提取其中的多糖并對其抗氧化活性進行檢測，旨在為提高茶葉下腳料的綜合利用及開發(fā)新的“金花”散茶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用四種常規(guī)茶的下腳料為原料，其中黑毛茶下腳料來自益陽龍嶺黑茶有限公司、茉莉花茶下腳料來自橫縣星光茶廠、紅茶和綠茶的下腳料來自益陽仁和茶業(yè)有限公司。冠突散囊菌發(fā)酵液菌種由黑茶金花湖南省重點實驗室提供。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、抗壞血酸均為分析純，來自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DPPH試劑為優(yōu)級純，來自合肥博美生物科技有限公司。

SHZ-B雙功能水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇億通電子有限公司；DT5-2B低速臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；TP-214電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；XY-200多功能粉碎機，浙江永康市松青五金廠；BKQ-Z30I立式壓力蒸汽滅菌鍋，山東博科。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備與茶多糖的提取

參考文獻方法制備“金花”散茶[15]：稱取原茶200 g加入200 mL水混合均勻，置于500 mL培養(yǎng)瓶中，在121℃高壓蒸汽鍋中滅菌20 min，冷卻至室溫后迅速轉(zhuǎn)移到已開啟紫外燈并保持了15 min后的無菌室中，于無菌操作臺采用酒精燈二次手部滅菌后進行接種操作。接種后的茶于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)瓶中的茶長出“金花”并不再轉(zhuǎn)色后取出，于60℃烘箱下烘干8 h待用。

參考CHEN的研究提取茶多糖[16]：取適量干茶粉碎，過60目篩后于50 mL離心管中準確稱量1.00 g茶粉。加入25.0 mL無水乙醇并搖勻。水浴振蕩30 min，以4000 r/min離心5 min，在50℃干燥后保留沉淀物，加入30.0 mL蒸餾水，在70℃水浴30 min，以4000 r/min再次離心，保留上清液，并重復(fù)兩次。將三次離心后保留的上清液混合至100 mL備用。

1.2.2 茶多糖的測定

按苯酚-硫酸法測定茶多糖含量[17]。準確稱量105℃下烘干1 h后的無水葡萄糖標準品0.1000 g，少量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，制成葡萄糖標準使用溶液。準確移取葡萄糖標準使用溶液配成溶液濃度為0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的葡萄糖標準溶液。移取1.00 mL系列標準溶液，加入2.00 mL 5%苯酚溶液和4.00 mL濃硫酸，靜置20 min后于490 nm比色測定?？瞻讓φ諡檎麴s水。橫坐標為葡萄糖質(zhì)量含量、吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

式中：m1為查得的含量，單位為μg；m2為稱取的樣品質(zhì)量；V1為樣品定容體積，單位為mL；V2為測定液的體積，單位為mL；0.9為換算系數(shù)。

1.2.3 DPPH自由基清除率測定

參考文獻方法測定DPPH自由基清除率、羥基自由基和總還原力等[18-19]。準確稱量DPPH試劑35.0 mg，用無水乙醇溶解后定容到100 mL的容量瓶中。移取1.00 mL上述溶液定容至50.0 mL的容量瓶中，搖勻后得到濃度為0.0178 mmol/L的DPPH溶液，該溶液在冰箱冷藏的條件下可長期使用。取樣品溶液2.00 mL加入2.00 mL DPPH 溶液迅速混勻后避光反應(yīng)30 min，于517 nm下測定。以無水乙醇調(diào)零后測定其吸光值。A0為空白樣吸光度；A1為樣品吸光度。

1.2.4 羥基自由基的清除率測定

準確取2.00 mL樣液，加2.00 mL濃度為6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，再加6 mmol/L等體積的過氧化氫溶液，混勻。再加2.00 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液，于37℃水浴中反應(yīng)25 min。以去離子水為參比，在510 nm波長處測定吸光度Ai。試驗同時進行空白對照和樣品對照組測定。

式中：Ai為樣品吸光值；Aj為樣品對照組（樣品與空白溶劑混合液）吸光值；Ac為空白對照（水楊酸與溶劑混合液）吸光值。

1.2.5 總還原力測定

總還原力測定采用相當于抗壞血酸的量來衡量?？箟难針饲渲茫号渲瞥鰸舛确謩e為0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的標準樣品，準確移取1.00 mL不同濃度待測液試管中，加入2.50 mL（pH6.6、0.2 mol/L）磷酸緩沖溶液，再加入2.50 mL的10 g/L的K3Fe(CN)6溶液，在50℃水浴振蕩鍋中反應(yīng)20 min，冷卻后再加2.50 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，于離心機中以3000 r/min離心5 min；吸取1.50 mL上清反應(yīng)液至試管中，再加入1.0 g/L的FeCl3溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）0.50 mL。于暗處靜置反應(yīng)10 min，用去離子水校零。在700 nm波長處測定樣品吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同“金花”散茶中茶多糖含量

由圖1可知，受發(fā)花過程的影響，茶多糖含量增加最顯著的是茉莉花茶的下腳料，制成的“金花”茉莉花茶茶多糖含量從39.99 mg/g升至78.21 mg/g，獲得了95%的提升；黑茶、綠茶在接種冠突散囊菌后獲得的“金花”散茶茶多糖含量也獲得了明顯提升，分別提升43%和65%；提升程度最小的是紅茶，提升23%。

圖1 茶葉中茶多糖含量Figure 1 Tea polysaccharides content in tea leaves

2.2 DPPH自由基清除能力

從不同茶葉中提取的茶多糖對DPPH自由基清除能力結(jié)果如圖2所示。隨著茶多糖溶液濃度的增加，對DPPH自由基清除能力增強，當濃度為10.0 mg /mL時，黑毛茶、“金花”黑茶、綠茶、“金花”綠茶、茉莉花茶、“金花”茉莉花茶、紅茶、“金花”紅茶對應(yīng)的茶多糖對DPPH 自由基清除率分別為88.30%、94.15%、84.57%、89.36%、81.38%、83.51%、82.98% 和89.36%。相對于接種冠突散囊菌前的茶，從接種冠突散囊菌獲得的“金花”散茶中提取的茶多糖對DPPH自由基清除能力都有增強。由圖2的數(shù)據(jù)計算出DPPH自由基清除率為50%時所需不同茶葉茶多糖提取液濃度即其IC50值如圖3所示。

圖2 不同茶葉的DPPH清除率Figure 2 DPPH scavenging rate of different tea leaves

圖3 不同茶葉的IC50值Figure 3 IC50 value of different tea leaves

2.3 羥基自由基清除能力

由圖4可知，黑毛茶、“金花”黑茶、綠茶、“金花”綠茶、茉莉花茶、“金花”茉莉花茶、紅茶、“金花”紅茶對應(yīng)的茶多糖對羥基自由基清除率分別為66.56%、66.00%、63.84%、70.38%、60.69%、76.58%、70.82%和45.29%。黑毛茶接種冠突散囊菌前后對羥基自由基清除率無明顯變化；綠茶、茉莉花茶接種“金花”菌后對羥基自由基清除能力得到提高，分別提高6%和16%；紅茶接種冠突散囊菌后對羥基自由基清除率有明顯下降。

圖4 不同茶羥基自由基清除率Figure 4 Scavenging rate of different tea hydroxyl radicals

2.4 總還原能力

由圖5可知，8種茶每克的提取液總還原能力相當于濃度為58.5 ～ 79.5 mg/L的抗壞血酸，黑毛茶、“金花”黑茶、綠茶、“金花”綠茶、茉莉花茶、“金花”茉莉花茶、紅茶、“金花”紅茶總還原能力分別相當于抗壞血酸的量為 63.21 mg/L、72.49 mg/L、75.47 mg/L、74.61 mg/L、79.51 mg/L、75.33 mg/L、58.50 mg/L 和61.34 mg/L。茉莉花茶總還原能力最強，紅茶總還原能力最弱。

圖5 不同茶葉的總還原能力Figure 5 Total reducing capacity of different tea leaves

3 討論與結(jié)論

本試驗研究以黑茶、綠茶、茉莉花茶和紅茶的下腳料為原料，接種“金花”菌后制備對應(yīng)的“金花”散茶，對比接種前后茶多糖含量以及抗氧化活性強弱變化，結(jié)合各項實驗數(shù)據(jù)獲得如圖6所示的綜合分析圖。接種“金花”菌后茶葉中茶多糖含量都得到提升，其可能的原因是接種“金花”菌后冠突散囊菌在快速生長階段分泌的胞外酶將茶葉中木質(zhì)纖維素等分解為多糖類物質(zhì)，使得多糖含量整體出現(xiàn)上升[15]，同時冠突散囊菌子囊孢子中含的多糖物質(zhì)也會使多糖含量出現(xiàn)上升[20]。四種茶發(fā)花前后的茶多糖抗氧化活性存在多樣性與差異性，與文獻報道的茶多糖抗氧化活性與茶種類、茶多糖結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)、多酚含量有關(guān)相符[17]。受冠突散囊菌的影響，四種不同下腳料茶茶多糖含量提升率和抗氧化活性的多樣性及差異性產(chǎn)生的原因還需要進一步通過深入研究不同茶茶多糖的組成及結(jié)構(gòu)等方面的差異，從而了解其產(chǎn)生差異的機制機理。

圖6 不同茶的綜合分析Figure 6 Comprehensive analysis of different tea products