UPLC-MS/MS法研究聯(lián)苯雙酯對(duì)葛根素大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)的影響*

張國(guó)哲，張 周，何姝穎

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005）

葛根素是葛根解酒保肝的主要活性成分之一[1-3]，還可用于防治心腦血管疾病[4]、急性肝腎損傷[5]，并對(duì)高血壓[6]、骨質(zhì)疏松癥[7]、炎癥、高脂血癥和糖尿病有治療作用[8]。聯(lián)苯雙酯是由五味子素C合成的保肝化合物[9]，對(duì)氯仿、乙醇及其他化學(xué)試劑引起的化學(xué)性肝損傷顯示出明顯的保護(hù)作用[10-12]，廣泛用于治療慢性肝炎[13-14]。但聯(lián)苯雙酯口服生物利用度僅為10%～30%，故由于水溶性差和口服生物利用度低而限制了其臨床應(yīng)用[15]。單體成分給藥經(jīng)常出現(xiàn)耐藥性、毒副作用等問(wèn)題，且聯(lián)苯雙酯停藥后存在谷丙轉(zhuǎn)氨酶回升問(wèn)題，通常稱為“反跳”現(xiàn)象[16]。因此，考慮是否可以通過(guò)藥物的聯(lián)合使用解決上述的問(wèn)題。有報(bào)道稱聯(lián)苯雙酯與某些藥物聯(lián)合使用可以降低這些藥物的血藥濃度，并且聯(lián)苯雙酯與某些藥物聯(lián)合使用可以降低藥物性肝損傷的發(fā)生率，同時(shí)也可以增強(qiáng)治療效果[17-19]。藥物的聯(lián)合使用過(guò)程中，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的考察是必要的。本研究考察了聯(lián)苯雙酯對(duì)大鼠口服葛根素藥代動(dòng)力學(xué)的影響，旨在為兩種保肝藥物的聯(lián)合使用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。葛根素和聯(lián)苯雙酯結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 葛根素和聯(lián)苯雙酯結(jié)構(gòu)式

1 材 料

1.1 藥物與試劑 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：G008-180426，純度＞98%）購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：20170708，純度＞98%）購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號(hào)：17060）購(gòu)自北京聯(lián)合制藥有限公司；乙腈（色譜級(jí)）和甲酸（色譜級(jí)）均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；超純水采用Milli-Q水凈化系統(tǒng)制備。

1.2 儀器Waters Xevo TQD三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）；AL104型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB-5200D型超聲波儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16K型低溫離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；MIX-2500混合振蕩器（上海啟前電子科技有限公司）；Milli-Q超純水儀（法國(guó)密理博公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性健康Wistar大鼠12只，體質(zhì)量為250～270 g，7周齡，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0004。飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲食和進(jìn)水，環(huán)境溫度23～27℃，相對(duì)濕度45%～55%。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江蘇職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：XMLL-2021-045。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取葛根素和鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。取一定量葛根素母液用甲醇稀釋制備質(zhì)量濃度為200 μg/mL的葛根素儲(chǔ)備液。隨后將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋制備一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液（4 000、1 000、400、200、100、40 ng/mL）。同時(shí)用甲醇制備100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，并用甲醇稀釋儲(chǔ)備液制備質(zhì)量濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。按照上述相同步驟制備了低、中、高濃度（8、80、720 ng/mL）的葛根素質(zhì)量控制樣品。

2.2 色譜、質(zhì)譜條件 色譜條件：使用Acquity UPLC系統(tǒng)（Waters）進(jìn)行樣品分離。采用HSS T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫如下：0～0.5 min，10%B～15%B；0.5～2 min，15%B～40%B；2～4 min，40%B～80%B；4.1～5 min，80%B～99%B；5.1～7 min，99%B～10%B。流速為0.3 mL/min，柱溫為40℃，樣品室溫度為10℃，進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：使用Waters TQD串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧電離（ESI）源進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的正離子模式測(cè)試樣品，并使用以下母離子＞子離子對(duì)進(jìn)行定量：葛根素（m/z）417.1＞297.0，鹽酸小檗堿（m/z）336.0＞320.0。葛根素和鹽酸小檗堿的錐電壓均為35 V，碰撞能為30 eV，氬氣用作碰撞氣。毛細(xì)管電壓設(shè)定為2.8 kV，源溫度設(shè)定為500℃，氮?dú)饬髁繛?50 L/h。錐孔氣流速為50 L/h。葛根素和鹽酸小檗堿的質(zhì)譜碎片圖見(jiàn)圖2。使用MassLynx4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和儀器控制，并使用TargetLynx進(jìn)行定量分析。

圖2 葛根素（A）和內(nèi)標(biāo)鹽酸小檗堿（B）質(zhì)譜離子碎片圖譜

2.3 大鼠分組及給藥 將12只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為葛根素組和葛根素+聯(lián)苯雙酯組，每組6只。葛根素+聯(lián)苯雙酯組大鼠按葛根素100 mg/kg與聯(lián)苯雙酯30 mg/kg劑量單次灌胃給藥(葛根素和聯(lián)苯雙酯均溶于0.5%羧甲基纖維素鈉制備成混懸液，質(zhì)量濃度分別為10 mg/mL和3 mg/mL)；葛根素組大鼠灌胃給予葛根素（質(zhì)量濃度為10 mg/mL），100 mg/kg。

2.4 血漿樣品的采集與處理 分別于給藥前及給藥后的0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00、36.00、48.00 h，眼眶后靜脈采集全血，4℃下以3 500 r/min離心10 min分離血漿，于-80℃冰箱保存。

取100 μL大鼠血漿和20 μL的內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/mL）加入1.5 mL EP管中，渦旋混合30 s，加入500 μL乙腈沉淀蛋白。渦旋混合2 min，并以10 000 r/min離心10 min。將上清液移至另一EP管中，室溫下用氮?dú)獯蹈?。殘余物用?fù)合溶液[V甲醇∶V水=80∶20]以13 000 r/min離心10 min，取2 μL上清液進(jìn)樣分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系考察 取空白大鼠血漿100 μL，加入20 μL不同濃度的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中葛根素的質(zhì)量濃度分別為800、200、80、40、20、8 ng/mL。按上述“2.4”項(xiàng)下的方法進(jìn)行樣品處理和質(zhì)譜檢測(cè)。采用加權(quán)（1/χ2）最小二乘法用于線性回歸方程計(jì)算。以葛根素與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)（y），以相應(yīng)的葛根素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x,ng/mL），得回歸方程為：y=1.099x+2.985，判定系數(shù)（R2）為0.996 1。表明大鼠血漿葛根素濃度在8～800 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。葛根素的定量下限（LLOQ）為校準(zhǔn)曲線上最低濃度，即8 ng/mL。

3.1.2 專屬性試驗(yàn) 使用大鼠的空白血漿樣品考察內(nèi)源性成分的潛在干擾。量取100 μL空白血漿（不加內(nèi)標(biāo)），按照“2.4”項(xiàng)下處理樣品，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。取100 μL空白血漿并加入內(nèi)標(biāo)和LLOQ濃度的葛根素，按相同處理方法處理并進(jìn)樣分析。取100 μL大鼠口服葛根素后0.25 h血漿樣品，按相同方法處理并進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的專屬性強(qiáng)，內(nèi)源干擾少，在樣品和空白血漿中未觀察到葛根素和內(nèi)標(biāo)的干擾峰。（見(jiàn)圖3）3.1.3精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取100 μL的空白血漿，分別加入低、中、高濃度（8、80、720 ng/mL）的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度5份，按照“2.4”項(xiàng)下血漿樣品處理步驟進(jìn)行處理并分析，連續(xù)3 d。計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示精密度的RSD為6.59%～14.91%，準(zhǔn)確度的RE為-11.25%～12.55%，符合生物樣品分析要求。

圖3 血漿中葛根素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）圖

表1 準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果 （n=5）

3.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 精密量取100 μL的空白血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，制備低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品各5份，進(jìn)樣分析，得到對(duì)應(yīng)的峰面積A1；另取空白血漿100 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，在上清液中分別加入低、中、高3個(gè)濃度的葛根素對(duì)照品溶液20 μL，進(jìn)樣分析，得到對(duì)應(yīng)的峰面積A2；相同分析條件下測(cè)定相應(yīng)的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各5次，得到對(duì)應(yīng)的峰面積為A0，提取回收率計(jì)算公式為A1/A2，基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式為A2/A0。結(jié)果如表2所示，葛根素的提取回收率為85.65%～93.42%。葛根素的基質(zhì)效應(yīng)范圍為108.82%～113.21%。結(jié)果均符合生物樣品分析要求。

表2 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果 （n=5）

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 通過(guò)分析3種不同儲(chǔ)存條件下的QC樣品研究葛根素在大鼠血漿中的穩(wěn)定性，包括3個(gè)凍融循環(huán)，室溫放置24 h和-20℃持續(xù)30 d考察穩(wěn)定性。在3種試驗(yàn)條件RE均在±15%范圍內(nèi)，表明葛根素具有較好的穩(wěn)定性。（見(jiàn)表3）

表3 葛根素在大鼠血漿中的穩(wěn)定性結(jié)果 （n=5）

3.2 葛根素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué) 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過(guò)DAS2.0軟件進(jìn)行評(píng)估，選擇2室模型，權(quán)重1單次給藥，分析主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用t檢驗(yàn)比較兩組間Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-inf、AUC0-t、MRT0-t、CLz/F和Vz/F參數(shù)。葛根素在兩組大鼠體內(nèi)的平均血漿濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖4。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，大鼠口服葛根素聯(lián)合聯(lián)苯雙酯后，葛根素的最大血藥濃度（Cmax）從（101.64±41.82）ng/mL增加到（124.75±51.47）ng/mL（P＞0.05），葛根素的Tmax從（1.46±1.08）h降低至（0.46±0.10）h（P＜0.05）。但是，濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t）從（213.09±61.91）μg·h/L降低到（201.65±53.68）μg·h/L（P＞0.05）。兩組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 兩組大鼠藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 （±s，n=6）

表4 兩組大鼠藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 （±s，n=6）

注：與葛根素組比較，aP＜0.05

參數(shù) 葛根素組 葛根素+聯(lián)苯雙酯組AUC0-t（μg·h/L） 213.09±61.91 201.65±53.68 AUC0-inf（μg·h/L） 219.83±64.37 213.43±51.74 MRT0-t（h） 2.22±0.46 1.93±0.24 t1/2（h） 1.60±0.38 2.15±0.99 Tmax（h） 1.46±1.08 0.46±0.10a CLz/F[L/（h·kg）] 508.66±202.54 496.24±139.63 Vz/F（L/kg） 1 198.32±403.31 1 584.36±986.17 Cmax（μg/L） 101.64±41.82 124.75±51.47

圖4 兩組大鼠血漿中的血藥濃度-時(shí)間曲線圖

4 討 論

葛根素為異黃酮成分，文獻(xiàn)報(bào)道主要采用正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)正負(fù)離子模式均進(jìn)行了比較，正離子模式響應(yīng)更高，色譜峰形更好，因此實(shí)驗(yàn)選擇正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。通過(guò)查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)條件摸索，本實(shí)驗(yàn)選擇常用的（m/z）417.1＞297.0作為葛根素定量母子離子對(duì)，因?yàn)榇穗x子對(duì)背景干擾少，而且響應(yīng)較高。本實(shí)驗(yàn)將碰撞能從20～50 eV進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇30 eV。由于葛根中存在大量異黃酮成分，而且大鼠口服葛根素后，會(huì)發(fā)生系列代謝反應(yīng)。因此，試驗(yàn)排除了大豆異黃酮和尼泊爾鳶尾異黃酮內(nèi)標(biāo)，而選擇鹽酸小檗堿為本試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)，即沒(méi)有內(nèi)源及潛在代謝物的干擾，同時(shí)又有較好的質(zhì)譜響應(yīng)。

有研究顯示，某些藥物的聯(lián)合使用也會(huì)影響葛根素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如甘草甜素和黃芪甲苷Ⅳ均可顯著降低葛根素的Tmax、Cmax和AUC0-t，表明甘草甜素、黃芪甲苷Ⅳ與葛根素聯(lián)合用藥時(shí)的藥物相互作用不可忽視[22-23]。也有研究顯示：聯(lián)苯雙酯與某些藥物聯(lián)合使用會(huì)使該藥物的血藥濃度降低，如聯(lián)苯雙酯可以降低他克莫司膠囊（FK506）的血藥濃度；當(dāng)聯(lián)苯雙酯與他林洛爾聯(lián)合使用時(shí)，也會(huì)使他林洛爾的血藥濃度降低；聯(lián)苯雙酯還能降低CYP3A4控制的環(huán)孢霉素的血藥濃度[24-25]。其原因可能是聯(lián)苯雙酯可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞色素P450中的特定酶，從而加速藥物的代謝，降低其血藥濃度，同時(shí)也使藥物半衰期縮短。如聯(lián)苯雙酯可以加速誘導(dǎo)CYP2B1的作用，而CYP2B能催化底物加速代謝，形成易于排泄的藥物代謝物。此外，聯(lián)苯雙酯可以抑制特定細(xì)胞色素酶的活性，影響聯(lián)合使用藥物的代謝，從而降低藥物的血藥濃度。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝炎的發(fā)生與外感六淫、癘氣、七情內(nèi)傷、飲食勞倦失常、瘀血、痰飲有形之邪阻滯等多種因素有關(guān)。使用聯(lián)苯雙酯時(shí)結(jié)合中醫(yī)的辨證施治，發(fā)揮中醫(yī)的優(yōu)勢(shì)配合選用對(duì)證的方劑治療，可以有效提高療效，減輕聯(lián)苯雙酯的停藥“反跳”現(xiàn)象。

本研究結(jié)果表明，聯(lián)苯雙酯雖然可以增加大鼠血漿中葛根素的Cmax并縮短Tmax，說(shuō)明聯(lián)苯雙酯可以在一定程度上促進(jìn)葛根素的吸收。然而，除Tmax有明顯差異以外，葛根素組和葛根素+聯(lián)苯雙酯組之間其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)明顯差異，聯(lián)苯雙酯和葛根素聯(lián)合使用時(shí)的藥物間的相互作用不會(huì)影響葛根素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，臨床兩種藥物可以聯(lián)合用于酒精性肝損傷的預(yù)防和治療。

5 結(jié) 論

本研究建立并驗(yàn)證了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS方法測(cè)定大鼠血漿中葛根素含量，并比較了大鼠灌胃給予葛根素及聯(lián)合灌胃給予葛根素和聯(lián)苯雙酯后大鼠血漿中葛根素的血藥濃度。結(jié)果表明：與葛根素組比較，除了Tmax明顯縮短外，兩組間的其他藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)明顯差異。聯(lián)苯雙酯和葛根素聯(lián)合使用時(shí)的藥物間的相互作用不會(huì)影響葛根素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，臨床可以同時(shí)使用兩種藥物用于酒精性肝損傷的預(yù)防和治療。