基于Box-Behnken響應面法優(yōu)化生乳湯水提取工藝研究*

譚建偉，張 睿，李蘭蘭，朱玉蓉，代 偉，楊 濤，虎亞光

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

產后缺乳是指婦女產后乳汁量甚少或全無，不能滿足嬰兒喂養(yǎng)需求，是臨床常見疾病，發(fā)病率為20%～30%[1]。母乳是嬰幼兒最理想的天然食品，母乳喂養(yǎng)可促進嬰幼兒生長發(fā)育，降低母嬰患病風險，改善母嬰健康狀況[2]。目前我國產后4個月純母乳喂養(yǎng)率為16%～34.4%，遠低于WHO要求的80%。據統(tǒng)計，產后1個月及以后母乳喂養(yǎng)失敗因乳量不足約占34.39%[3]，防治產后缺乳對提高母乳喂養(yǎng)率具有重要意義。

中醫(yī)認為導致產后乳汁不足或全無的主要病機為乳汁生化不足或乳絡不暢，常見病因有氣血虛弱、肝郁氣滯及痰濕壅阻等[4-6]，治療產后缺乳以扶正、理血為主，常用中藥為當歸、王不留行、黃芪、川芎及漏蘆[7]。生乳湯主要組成為炙黃芪、漏蘆、當歸、桔梗、通草、炒王不留行、炙甘草、黨參等，諸藥合用具有益氣養(yǎng)血、通絡、疏肝解郁的功效[8-12]。經臨床應用發(fā)現(xiàn)，生乳湯可有效治療產后缺乳，緩解產婦泌乳不足的問題。但目前尚未建立生乳湯的提取優(yōu)化方案及質量控制方法。因此，本研究優(yōu)化組方提取方法，最大限度提取其有效成分。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器Thermo Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；SQP型電子分析天平（德國賽多利斯儀器有限公司）；TWCL-T型調溫磁力加熱器（上海予申儀器有限公司）；EMS-30型恒溫水浴鍋（上海喬月電子有限公司）；CQ50型超聲波清洗機（上海喬躍電子有限公司）；202A-00型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 材料 生地黃（批號：191127）、桔梗（批號：200201）、通草（批號：200405）、炙甘草（批號：200818）、炙黃芪（批號：200705）均購自甘肅康樂藥業(yè)有限責任公司；漏蘆（批號：19061105）、炒王不留行（批號：20010202）均購自蘭州安泰堂中藥飲片有限公司；黨參（批號：200801）購自甘肅和潤醫(yī)藥集團有限公司。上述中藥材由甘肅省中醫(yī)院主任中藥師李喜香鑒定均為正品。槲皮素標準品（批號：Q111273，純度≥98.5%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘草酸標準品（批號：A0810AS，純度≥98%）購自美侖生物有限公司；色譜純乙腈（批號：JA107230）購自Merck Millipore公司；色譜純甲醇（批號：1147507）購自Merck Millipore公司；其余試劑為分析純；實驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 槲皮素和甘草酸含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）；流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=3.2），采用梯度洗脫程序：0～5 min，30%乙腈；5～7 min，30%乙腈→50%乙腈；7～9 min，50%乙腈→30%乙腈；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；紫外檢測波長為256 nm；進樣量為20 μL。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素標準品5.44 mg、甘草酸標準品25.15 mg，加甲醇溶解稀釋至10 mL，制成每毫升含有槲皮素0.544 mg、甘草酸2.515 mg的混合對照品溶液。混合對照品紫外全波長掃描見圖1。

圖1 紫外全波長掃描圖

2.1.2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，采用水煎法進行提取，提取液烘干得到干浸膏。精密稱取200 mg干浸膏，加入5 mL鹽酸-甲醇溶液（體積比為1∶4）充分溶解，超聲處理15 min后，60℃水浴1 h。取100 μL上清液，甲醇稀釋至1 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2.3 陰性對照品溶液的制備 分別稱取除炙黃芪、甘草外的生乳湯組方中其他藥材，經水煎提取后，按照“2.1.2.2”項方法制備缺少槲皮素、甘草酸的陰性對照品溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL，依次按照“2.1.1”項色譜條件進樣測定，記錄液相色譜圖。陰性對照品在相應色譜峰處無干擾吸收峰，槲皮素、甘草酸的理論塔板數(shù)均大于3 000，對應色譜峰的分離度均大于1.5。（見圖2）

圖2 HPLC圖

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.2.1”項下的混合對照品溶液1 mL，用甲醇稀釋至不同濃度梯度，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液20 μL，按照“2.1.1”項色譜條件進樣分析，以濃度為橫坐標（X），對應的高效液相色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行回歸分析，結果表明槲皮素在0.27～43.52 μg，甘草酸在1.01～201.20 μg范圍內線性關系良好。

表1 線性關系考察結果

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2.2”項下的供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣6次，測定槲皮素和甘草酸峰面積值，結果峰面積RSD分別為1.90%、1.72%。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在配制后0、2、4、6、8、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣6次，測定槲皮素和甘草酸峰面積值，結果峰面積RSD分別為2.08%、1.75%。表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批次干浸膏，按照“2.1.2.2”項制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣6次，測定槲皮素和甘草酸峰面積值，結果峰面積RSD分別為1.79%、1.63%。表明該測定方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的干浸膏6份，分別加入干浸膏中槲皮素、甘草酸含量的80%、100%、120%的對照品溶液，按“2.1.2.2”項制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定槲皮素和甘草酸的含量，以測定量（測得量-樣品中的量）與加入量的比值計算回收率。結果槲皮素和甘草酸的平均回收率分別為101.50%、101.17%，RSD分別為1.81%、1.94%，表明該方法準確度良好。（見表2）

表2 加樣回收率試驗結果 （n=6）

2.2 單因素試驗考察 前期預試驗考察不同提取條件下，組方內多個化合物的含量變化，考察發(fā)現(xiàn)不同液料比、提取時間及提取次數(shù)對槲皮素提取效果的影響較大，因此，選擇槲皮素作為指標性成分進行單因素試驗，從而獲取各因素適宜的提取區(qū)間。

2.2.1 液料比對槲皮素含量的影響 按處方比例稱取藥材，在提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次的條件下，考察液料比為8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1對槲皮素含量的影響，平行重復3次。按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，采用“2.1.1”項下色譜條件測定槲皮素含量。結果隨著液料比的增加，槲皮素含量也逐漸增加，當液料比為20∶1時，達到最大槲皮素含量。液料比繼續(xù)增加至24∶1時，槲皮素含量有所下降，因此，選擇液料比為16∶1、20∶1、24∶1進行Box-behnken試驗。（見圖3A）

2.2.2 提取時間對槲皮素含量的影響 按處方比例稱取藥材，在液料比為16∶1，提取次數(shù)為2次的條件下，考察提取時間0.5、1.0、2.0 h對槲皮素含量的影響，平行重復3次。按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，采用“2.1.1”項下色譜條件測定槲皮素含量。結果槲皮素含量隨時間延長而提高，最高點在提取時間為1 h時，之后槲皮素含量隨時間延長而降低。該結果可能與長時間高溫提取環(huán)境下，槲皮素的化學結構穩(wěn)定性降低有關。因此，選擇提取時間為0.5、1.0、1.5 h進行Boxbehnken試驗。（見圖3B）

2.2.3 提取次數(shù)對槲皮素含量的影響 按處方比例稱取藥材，在液料比為16∶1，提取時間為1 h的條件下，考察提取1、2、3次生乳湯對槲皮素含量的影響，平行重復3次。按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，采用“2.1.1”項下色譜條件測定槲皮素含量。結果提取次數(shù)增加至2次時，槲皮素含量亦隨之增加，當提取次數(shù)達到3次時，結果提示槲皮素的含量并未持續(xù)增加，可能與槲皮素化學穩(wěn)定性差、易被氧化降解有關[13]。因此，選擇提取次數(shù)1、2、3次進行Box-behnken試驗。（見圖3C）

圖3 液料比（A）、提取時間（B）及提取次數(shù)（C）對槲皮素含量的影響

2.3 Box-Behnken響應面試驗考察

2.3.1 方案設計 根據單因素試驗結果，選擇液料比（A）、提取時間（B）及提取次數(shù)（C）為影響因素，以槲皮素、甘草酸提取率的綜合評分為指標，綜合評分=槲皮素提取率/槲皮素最高提取率×0.714×100+甘草酸提取率/甘草酸最高提取率×0.286×100[生乳湯組方中含炙黃芪15 g，甘草6 g，按照藥材質量比重計算加權比例，槲皮素為0.714（15/21），甘草酸為0.286（6/21）]，采用Box-Behnken響應面法對數(shù)據進行分析和評價，優(yōu)化生乳湯的工藝條件。設計因素與水平見表3，Box-Behnken結果見表4。

表3 Box-Behnken設計因素水平

表4 Box-Behnken響應面設計及結果

2.3.2 模型擬合及分析 采用Design Expert 12.0軟件對試驗數(shù)據進行擬合分析，得到多元回歸方程如下：Y=91.29-3.84A-0.003 9B+5.61C-6.09AB-0.4101AC+9.03BC-17.86A2-11.83B2-9.75C2。對擬合模型進行方差分析，結果見表5。實驗設計的3個因素對生乳湯中槲皮素和甘草酸提取率綜合評分的影響排序為C＞A＞B。擬合模型的P=0.035 6＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，表明該響應面模型的擬合性較好，實驗預測誤差較小。由表5可知，二次項中A2和B2均呈顯著性影響（P＜0.05），其余一次項與二次項因素對生乳湯中槲皮素和甘草酸提取率的影響差異無統(tǒng)計學意義，該擬合模型提示，考察因素與響應值之間未呈現(xiàn)簡單的線性關系。多元回歸方程失擬項P=0.157 7＞0.05，提示模型失擬不顯著，模型具有較好的可信度，建立該擬合模型能夠有效地進行生乳湯提取工藝的優(yōu)化分析及預測。

表5 二次回歸模型方差分析

2.3.3 響應面分析 通過Design Expert 12.0軟件繪制各指標與響應值交互項的響應面圖，可直觀評價各因素對生乳湯中槲皮素和甘草酸提取率的影響。結果顯示，隨著各因素的增加槲皮素和甘草酸提取率均呈現(xiàn)先增加后逐漸減少的趨勢。因素C提取次數(shù)的曲面較陡峭，提示提取次數(shù)對槲皮素和甘草酸提取率影響較明顯，這與二次回歸模型中的方差分析結果一致。（見圖4～6）2.3.4驗證試驗 根據模型擬合方程，預測分析得到的最優(yōu)提取方案為液料比為19.434:1，提取時間為1.089 h，提取次數(shù)為2.373次。考慮到實際提取時的可操作性，故將生乳湯的提取方案修正為液料比為20∶1，提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次。為驗證該擬合模型預測的準確性，按照修正后的方案提取生乳湯中槲皮素和甘草酸，重復進行3次試驗，并測定提取液中槲皮素和甘草酸含量。結果顯示，槲皮素和甘草酸的平均提取率分別為7.15%、4.10%，RSD分別為0.85%、1.27%，提示前期建立的響應面擬合模型預測性準確，選取的生乳湯優(yōu)化提取工藝具有良好的可行性及重復性。

圖4 液料比與提取時間的交互作用響應面及等高線圖

圖5 液料比與提取次數(shù)的交互作用響應面及等高線圖

圖6 提取時間與提取次數(shù)的交互作用響應面及等高線圖

3 討 論

3.1 色譜條件優(yōu)化 本研究采用HPLC法對生乳湯中炙黃芪、甘草的有效成分槲皮素和甘草酸進行含量測定。在200～400 nm范圍內對混合對照品溶液進行紫外光全波長掃描，結果提示混合對照品溶液在256 nm處有最大紫外吸收，故選擇該波長測定生乳湯中槲皮素和甘草酸含量。以乙腈-水作流動相時，槲皮素和甘草酸峰形拖尾嚴重，分離度較差，換用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液后，槲皮素和甘草酸樣品色譜峰無拖尾，分離度較好，可有效優(yōu)化槲皮素和甘草酸峰形。本試驗通過梯度洗脫方式，既能保證槲皮素和甘草酸有較好的分離度，又可縮短樣品檢測的保留時間，提高高效液相色譜法的檢測效率。

3.2 評價指標 槲皮素黃酮類化合物，可通過調控GSH水平，提高機體的抗氧化能力，亦可作用于白細胞并通過細胞信號通路中的蛋白激酶和磷酸酶，發(fā)揮抗炎及免疫調節(jié)的作用[14]。黃芪、甘草、漏蘆及桔梗中均含有槲皮素[14-17]，以槲皮素為評價指標可以體現(xiàn)多味藥材有效成分的提取率。甘草的化學成分主要有三萜皂苷類（如甘草酸、甘草次酸等）、黃酮類（如甘草苷、甘草苷元等）[18]，具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、免疫調節(jié)等作用，其中皂苷類化合物是甘草中重要的成分之一。網絡藥理學研究表明，甘草可調節(jié)催乳素信號通路，參與乳房發(fā)育、乳蛋白合成及維持乳汁分泌[19-20]。故本研究以槲皮素和甘草酸作為定量指標，評價生乳湯的水提取工藝[21-23]。3.3 提取工藝優(yōu)化 本研究在單因素試驗的基礎上，采用非線性擬合的Box-Behnken響應面法對多個因素進行擬合分析，充分考慮液料比、提取時間及提取次數(shù)對槲皮素和甘草酸提取率的影響，建立擬合模型對生乳湯的提取工藝進行了優(yōu)化，有效提高了提取工藝的準確性。驗證結果表明，本提取工藝簡便、快捷，結果穩(wěn)定、可靠，為生乳湯的廣泛應用與開發(fā)提供了理論和實驗依據，也為含有同類成分的中藥制劑提供定量檢測參考。