液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中藥材中11 種真菌毒素

劉靜，朱葉梅，董勝?gòu)?qiáng)，楊盼盼，廖予琦，楊飚，張建，李瑞

(云南同創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，昆明 650106)

中藥材是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥產(chǎn)品，部分中藥材既可以作為藥物，也可以作為食物、保健品，能夠加工成具有食療功能的膳食。大部分中藥材以干燥塊莖流通，具有藥用、保健價(jià)值，有些為中國(guó)名貴中藥材[1]。中藥材的炮制過(guò)程主要為直接干燥、微波真空干燥、微波后水蒸、真空冷凍或干燥等[2]。若中藥材中水分含量過(guò)高，在儲(chǔ)藏過(guò)程中，中藥材會(huì)滋生霉菌、真菌等。由真菌、細(xì)菌、病毒等引起的中藥材中微生物群落變化，會(huì)給中藥材帶來(lái)病害[3]；同時(shí)，中藥材內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生真菌的次生代謝物真菌毒素[4-5]。真菌毒素主要存在于植物產(chǎn)品及植物性中藥材中[6-7]，另外，真菌毒素還可通過(guò)動(dòng)物攝入，從而污染動(dòng)物源性中藥材[6-9]。真菌毒素不僅會(huì)破壞中藥材的品質(zhì)，降低中藥材的功效，甚至?xí)：θ梭w的健康。目前已確定的真菌毒素約300 多種[10]，依據(jù)毒性程度劃分，毒性較大的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、嘔吐毒素、T-2 等[11-14]。

儀器分析法靈敏度高，可對(duì)毒素進(jìn)行精確定量，是目前真菌毒素檢測(cè)的主要手段[15]，其中常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[16-18]。目前測(cè)定中藥材中真菌毒素的相關(guān)研究主要集中在黃曲霉毒素(B 族、M 族、G 族)、赭曲霉毒素，而T-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬毒素的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。筆者采用不同極性的2 種提取溶劑對(duì)4 種類(lèi)別的11種真菌毒素進(jìn)行提取，用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀正離子和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，建立了中藥材中11 種真菌毒素的檢測(cè)方法，以期為評(píng)價(jià)中藥材的安全性提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：Agilent 1290-6460 型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

分析天平：AB204-S 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

液氮：純度不小于99.9% (體積分?jǐn)?shù))，昆明倉(cāng)輝經(jīng)貿(mào)有限公司。

中藥材樣品：天麻、三七、石斛、紅花、茯苓，市售新鮮樣品。

11 種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品：伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、T-2 毒素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，純度均不小于95% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

13C34伏馬毒素B1、13C17黃曲霉毒素B1 同位素標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)樣品：質(zhì)量濃度均為25 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

甲醇、甲酸：色譜純，北京迪科馬科技有限公司。氨水：分析純，西隴化工股份有限公司。

多功能固相凈化柱：M1000 型，青島普瑞邦生物工程有限公司。

PriboFast?固相凈化柱：MFC100 型，青島普瑞邦生物工程有限公司。

PriboFast?真菌毒素六合一免疫親和柱：IAC-400-6 型，柱容量為6 mL，青島普瑞邦生物工程有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 溶液配制

提取溶劑A：乙腈和水按80∶20 的體積比混合均勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸。

提取溶劑B：乙腈和水按20∶80 的體積比混合均勻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸。

11 種霉菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：11 種霉菌毒素的質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，分別稱(chēng)取伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、T-2 毒素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇各1.0 mg 于10 mL 容量瓶中，均用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，配制成11 種單標(biāo)儲(chǔ)備液。分別移取上述11 種單標(biāo)儲(chǔ)備液各0.5 mL 于同一只50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，混勻。

混合內(nèi)標(biāo)溶液：13C34伏馬毒素B1、13C17黃曲霉毒素B1 質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，分別移取13C34伏馬毒素B1 和13C17黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)樣品各1.0 mL 于同一只25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，混勻。

11 種霉菌毒素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取適量的11 種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 混合內(nèi)標(biāo)溶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液定容至標(biāo)線，配置成11 種真菌毒素的質(zhì)量濃度均分別為0.1、1.0、5.0、20、50、100 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；分別移取上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各1.0 mL，加入已吹至近干的空白樣品基質(zhì)中，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，得到相同質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配系列混合校正工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜

色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司)；柱溫：(25±5)℃；流動(dòng)相：A 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液，B為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的甲醇溶液，流量為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜

離子源：正離子電噴霧電離源(ESI+)；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；干燥氣：氮?dú)猓髁繛? L/min，溫度為325 ℃；鞘氣：氮?dú)?，流量?0 L/min，溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓：3 500 V；11 種真菌毒素質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 11 種真菌毒素和2 種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜采集參數(shù)

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 樣品處理

將采購(gòu)的新鮮中藥材樣品，在自然條件下陰干，使最終水分控制在5%～10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))之間。然后磨碎過(guò)0.425 mm 篩。稱(chēng)取2 g 磨碎后的樣品，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 提取溶劑A，渦旋1 min，振蕩提取60 min,以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一只50 mL 離心管中，向剩余樣品中再次加入15 mL 提取溶劑B，渦旋1 min，繼續(xù)振蕩提取30 min，然后以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，合并第一次提取液。再次以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，于40 ℃氮吹濃縮至10 mL，取980 μL 最終提取液于樣品瓶中，加入20 μL 混合內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾膜后得到樣品溶液。

1.4.2 定量方法

在1.3 儀器工作條件下，先測(cè)定1.2 中不同濃度的11 種真菌毒素基質(zhì)匹配系列混合校正溶液，然后測(cè)定1.4.1 處理后的樣品溶液，樣品溶液中檢出的色譜峰保留時(shí)間需與標(biāo)準(zhǔn)溶液中某組分色譜峰保留時(shí)間一致，且所選擇的兩對(duì)子離子的質(zhì)荷比一致。以待測(cè)真菌毒素質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)、待測(cè)真菌毒素色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制校正曲線，采用內(nèi)標(biāo)法定量，得到待測(cè)真菌毒素的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[11]，采用常用的C18色譜柱分離，并對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。分離真菌毒素最常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈水溶液(加入一定量的甲酸、乙酸銨)。分別考察了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨水溶液、乙腈-甲酸水溶液和乙腈-乙酸銨水溶液4 種流動(dòng)相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為有機(jī)相可使真菌毒素得到較好的分離，加入甲酸可提高分離度，通過(guò)提高離子化效率而提高11 種真菌毒素的靈敏度。綜合考慮，選擇0.1%的甲酸溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液為流動(dòng)相體系。質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL 的11 種真菌毒素基質(zhì)匹配混合校正溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖如圖1 所示。

圖1 11 種真菌毒素基質(zhì)匹配混合校正溶液MRM 色譜圖

2.2 提取方式選擇

要實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)不同理化性質(zhì)的真菌毒素，需要合適的提取溶劑。常用的提取溶劑一般為不同體積比的甲醇、乙腈等有機(jī)相與水的混合溶液。Sulyok等[19]曾對(duì)體積比為20∶80至90∶10的乙腈-水體系進(jìn)行考察，結(jié)果表明，當(dāng)以乙腈體積分?jǐn)?shù)占比較高的乙腈-水體系為提取溶劑時(shí)，對(duì)多種真菌毒素的提取效果均較好，最常用的提取溶劑為乙腈-水(體積比為80∶20)[20]。待測(cè)的11 種真菌毒素極性差異較大，若使用同一種提取溶劑提取，會(huì)存在提取不完全的情況。選擇乙腈-水體系作為提取溶劑，按1.2 方法分別配制提取溶劑A、提取溶劑B。分別考察提取溶劑A、提取溶劑B 及兩種提取溶劑混合提取3 種提取方式對(duì)11 種真菌毒素的提取效果，不同提取溶劑對(duì)應(yīng)的真菌毒素的回收率見(jiàn)表3。

表3 不同提取方式對(duì)應(yīng)的真菌毒素回收率 %

由表3 可知，提取溶劑A 對(duì)大部分真菌毒素提取效果較好，但對(duì)極性較大的伏馬毒素類(lèi)提取效果較差；提取溶劑B 對(duì)大部分真菌毒素提取效果較差，但對(duì)極性較大的伏馬毒素類(lèi)提取效果較好；采用混合提取，即先用提取溶劑A 對(duì)大部分真菌毒素進(jìn)行提取，然后用提取溶劑B 對(duì)極性較大的伏馬毒素類(lèi)進(jìn)行提取，11 種真菌毒素的提取效果均較好，回收率均達(dá)到80%以上，故選擇提取溶劑A 和提取溶劑B 混合提取方式。

2.3 基質(zhì)干擾與消除

由于植物提取液基質(zhì)復(fù)雜，分別采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線法和基質(zhì)匹配校正曲線法考察樣品基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。分別配制乙腈-水(體積比為80∶20)純?nèi)軇┫盗袠?biāo)準(zhǔn)工作溶液和11 種真菌毒素基質(zhì)匹配系列混合校正溶液，在1.3 儀器工作條件下分別測(cè)定，繪制純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配校正曲線，以?xún)煞N曲線斜率的相對(duì)偏差反映基質(zhì)效應(yīng)大小，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，兩種曲線斜率的相對(duì)偏差絕對(duì)值為9.9%～46.5%，表明采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)中藥材中11 種真菌毒素基質(zhì)效應(yīng)較大。

表4 11 種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線和校正曲線的斜率

為了有效消除基質(zhì)效應(yīng)，選取3 種凈化方法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)：(1)基于QuEChERS 原則的凈化法；(2)免疫親和-凈化柱法；(3)兩步溶劑萃取法。3 種凈化方法對(duì)應(yīng)的11 種真菌毒素的回收率見(jiàn)表5。由表5 可知，采用前兩種凈化方法11 種真菌毒素的回收率整體偏低，采用兩步溶劑萃取直接過(guò)濾進(jìn)樣并結(jié)合內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，11 種真菌毒素的提取效果均較好，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定，故選擇以提取溶劑A和提取溶劑B 為溶劑的兩步溶劑萃取凈化方法消除基質(zhì)效應(yīng)。

表5 不同凈化法對(duì)應(yīng)的11 種真菌毒素回收率%

2.4 線性方程、檢出限和定量限

在1.3 儀器工作條件下，對(duì)11 種真菌毒素基質(zhì)匹配系列混合校正溶液進(jìn)行測(cè)定，以待測(cè)真菌毒素的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值x為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的待測(cè)真菌毒素的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積的比值y為縱坐標(biāo)擬合校正曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。取11 種真菌毒素基質(zhì)匹配混合校正溶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液不斷稀釋后測(cè)定，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的待測(cè)真菌毒素的質(zhì)量濃度為該方法的檢出限和定量限。11 種真菌毒素的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表6。由表6 可知，11種真菌毒素線性方程的相關(guān)系數(shù)均不小于0.996，檢出限和定量限均低于文獻(xiàn)值[14-15]。

表6 11 種真菌毒素的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

選擇天麻樣品，按1.4 方法進(jìn)行樣品處理，按1.3儀器工作條件測(cè)定，11 種真菌毒素均未檢出。在該天麻樣品中加入適量的11 種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按1.4 方法平行處理6 份樣品溶液，在1.3 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表7。天麻加標(biāo)樣品溶液MRM 色譜圖如圖2 所示。由表7 可知，11種真菌毒素的加標(biāo)回收率為76.1%～97.6%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.97%～8.58%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較好，滿足天麻等中藥材復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)要求。

表7 加標(biāo)回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

續(xù)表7

圖2 天麻加標(biāo)樣品MRM 色譜圖

3 結(jié)語(yǔ)

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中藥材中11 種真菌毒素的分析方法。該方法在14 min 內(nèi)能夠準(zhǔn)確地完成11 種真菌毒素的定性、定量分析，具有簡(jiǎn)潔、靈敏、準(zhǔn)確穩(wěn)定等特點(diǎn)，適合于中藥材中11種真菌毒素的快速測(cè)定，對(duì)評(píng)價(jià)中藥材內(nèi)在質(zhì)量與安全性具有重要意義。