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      circ_0046263靶向miR-1184調(diào)控肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

      2022-11-15 09:03:04劉文東張嘉麟余紫丹惠州市第三人民醫(yī)院腫瘤科惠州516001
      中國免疫學(xué)雜志 2022年17期
      關(guān)鍵詞:可抑制劃痕熒光素酶

      劉文東 張嘉麟 余紫丹(惠州市第三人民醫(yī)院腫瘤科,惠州 516001)

      肝細胞癌是全球癌癥病死率較高的腫瘤,多數(shù)患者確診時已是晚期,預(yù)后較差,肝癌監(jiān)測和早期發(fā)現(xiàn)增加了治愈的機會;分子靶向療法已在臨床上用于多種癌癥治療,研究導(dǎo)致肝癌發(fā)展和進展的各種分子機制,篩選特異性靶點、開發(fā)更多靶向特定途徑的藥物對肝癌診斷及治療具有重要意義[1-2]。環(huán)狀RNA(circRNA)是真核生物中具有特異性的共價封閉內(nèi)源性生物分子,可通過充當microRNA或蛋白抑制劑在多種疾病中發(fā)揮重要生物學(xué)功能,可作為多種類型癌癥的診斷或治療靶標[3-4]。研究報道,circ_0046263在鼻咽癌細胞系和組織中均表達上調(diào);敲除circ_0046263可抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移[5]。circ_0046263在非小細胞肺癌中明顯上調(diào);敲除circ_0046263對非小細胞肺癌細胞增殖、細胞周期和轉(zhuǎn)移具有抑制作用[6]。但circ_0046263在肝癌細胞中的作用及機制尚不清楚。本研究通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circ_0046263與miR-1184存在結(jié)合位點。研究報道,miR-1184在結(jié)腸癌細胞和組織中表達顯著下調(diào);miR-1184過表達通過抑制Ki67表達抑制結(jié)腸癌細胞增殖,并通過上調(diào)cleaved caspase-3和 下調(diào)Bcl-2表達促進 其凋亡[7]。沉默circVANGL1通過上調(diào)miR-1184表達抑制膀胱癌細胞侵襲、遷移和增殖[8]。說明miR-1184可能在癌癥中起抑癌作用。但miR-1184在肝癌中的作用及circ_0046263是否調(diào)控miR-1184表達尚不清楚。因此,本實驗以肝癌細胞株HCCLM3為研究對象,探究circ_0046263是否影響肝癌細胞增殖、遷移和侵襲及其機制是否與miR-1184有關(guān)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 組織來源選取惠州市第三人民醫(yī)院2017年1月至2020年12月經(jīng)病理檢測為肝癌且具有完整臨床病理資料的患者47例,其中男29例,女18例,年齡42~78歲,平均(56.7±2.1)歲。手術(shù)切除其腫瘤組織及癌旁組織,距腫瘤組織邊緣5 cm處切除的為癌旁組織,所有患者術(shù)前均未接受過任何放化治療或免疫治療,且知情同意。

      1.1.2 主要試劑肝癌細胞株HCCLM3購自美國ATCC;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Trizol試劑購自廈門慧嘉生物科技有限公司;熒光定量試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所;吉姆薩染色液購自廣州達暉生物技術(shù)股份有限公司;Transwell小室、Matrigel購自美國Corning公司;RIPA蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海臻諾生物科技有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1 細胞處理與分組肝癌細胞株HCCLM3采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),2 d換液1次,細胞融合至90%左右時消化傳代,取對數(shù)生長期細胞,轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0046863、miR-NC、miR-1184,6 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),記為si-NC組、si-circ_0046863組、miR-NC組、miR-1184組;將si-circ_0046263分別與anti-miR-NC、anti-miR-1184共轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞,記為si-circ_0046263+anti-miR-NC組、si-circ_0046263+anti-miR-1184組。

      1.2.2 RT-qPCR檢 測circ_0046263和miR-1184表達取適量肝癌組織、癌旁組織,加入Trizol試劑提取總RNA,用同樣方法提取各組HCCLM3細胞總RNA,合成cDNA后進行熒光定量PCR,以GAPDH和U6為內(nèi)參,PCR反應(yīng)體系:2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5μl、7μl無菌水;循環(huán)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s,共40個循環(huán);溶解曲線:95℃15 s,60℃15 s,95℃15 s。2-ΔΔCt計算相對表達。circ_0046263正向引物序列:5'-ACCATTTGGGATCACTTCCA-3',反 向引 物 序列:5'-CTTCTTCAGCCAGTTCACGA-3';GAPDH正向引物序列:5'-GTGAACCATGAGAAGTATG-3',反向引物序列:5'-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3';miR-1184正向引物序列:5'-CCTGCAGCGACTTGATGGC-3',反向引物序列:5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3';U6正向引物序列:5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCA-3',反向引物序列:5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3';引物由上海生工生物工程公司合成。

      1.2.3 CCK-8檢測細胞活性取各組對數(shù)生長期HCCLM3細胞,消化后接種至96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h,加入10μl CCK-8試劑孵育2 h,酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)。

      1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù)將各組HCCLM3細胞以200個/孔接種于6孔板,培養(yǎng)2周,終止培養(yǎng)后PBS洗滌2次,甲醇固定15 min后加入吉姆薩染色液染色30 min,光學(xué)顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落。

      1.2.5 劃痕實驗檢測劃痕愈合率取各組對數(shù)生長期細胞,消化后接種于培養(yǎng)皿,待細胞鋪滿皿底后用槍頭劃痕,PBS沖洗,更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)0 h和24 h后拍照觀察,Image-Pro Plus 6.0軟件計算劃痕愈合率。

      1.2.6 Transwell檢測侵襲細胞數(shù)取100μl稀釋的Matrigel平鋪于Transwell上室,凝固后接種100μl無血清重懸的細胞,下室加入500μl含血清培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室,棄培養(yǎng)液,PBS洗2遍,甲醇固定30 min,將小室風(fēng)干,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,PBS漂洗,干燥,光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野并計數(shù)。

      1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 提取各組HCCLM3細胞總蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入E-cadherin和N-cadherin一抗(1∶800)37℃孵育2 h,加入二抗山羊抗兔IgG(1∶1 500)室溫孵育2 h,暗室曝光顯影,分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達。

      1.2.8 雙熒光素酶報告實驗構(gòu)建circ_0046263野生型(WT-circ_0046263)和突變型(MUT-circ_0046263)熒光素報告酶載體,將miR-NC和miR-1184分別與其共轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞,按照說明書檢測熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circ_0046863、si-NC、si-circ_0046863分別轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞,RT-qPCR檢測miR-1184表達。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示,兩組比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 circ_0046263和miR-1184在肝癌組織中的表達收集肝癌患者癌組織及癌旁組織,RT-qPCR檢測circ_0046263和miR-1184表達,結(jié)果顯示,肝癌組織circ_0046263表達高于癌旁組織,miR-1184表達低于癌旁組織(P<0.05,表1),表明肝癌組織中circ_0046263呈高表達,而miR-1184呈低表達。

      表1 肝癌組織circ_0046263和miR-1184表達(±s,n=47)Tab.1 Expressions of circ_0046263 and miR-1184 in liver cancer tissue(±s,n=47)

      表1 肝癌組織circ_0046263和miR-1184表達(±s,n=47)Tab.1 Expressions of circ_0046263 and miR-1184 in liver cancer tissue(±s,n=47)

      Note:Compared with adjacent tissues,1)P<0.05.

      Groups Adjacent tissues Liver cancer tissues t P circ_0046263 1.00±0.08 3.53±0.311)32.763 0.000 miR-1184 1.00±0.07 0.33±0.031)60.313 0.000

      2.2 抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖的影響RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染si-circ_0046263后circ_0046263表達降低;克隆形成實驗中si-circ_0046263組HCCLM3細胞克隆形成數(shù)少于si-NC組(P<0.05),CCK-8實驗中,si-circ_0046263組HCCLM3細胞活性低于si-NC組(P<0.05,圖1、表2),表明抑制circ_0046263表達可抑制HCCLM3細胞增殖和克隆形成。

      表2 抑制circ_0046263表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖(±s,n=9)Tab.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits proliferation of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      表2 抑制circ_0046263表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖(±s,n=9)Tab.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits proliferation of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.

      Groups si-NC si-circ_0046263 tP circ_0046263 1.00±0.00 0.24±0.021)114.000 0.000 OD450 0.65±0.04 0.32±0.031)19.800 0.000 Cell clone formation 78.08±6.17 35.06±3.241)18.519 0.000

      圖1 抑制circ_0046263表達抑制肝癌HCCLM3細胞克隆形成Fig.1 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits clonal formation of HCCLM3 cells

      2.3 抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲的影響轉(zhuǎn)染si-circ_0046263及陰性對照si-NC后,劃痕實驗結(jié)果顯示,si-circ_0046263組HCCLM3細胞劃痕愈合率低于si-NC組,Transwell結(jié)果顯示,si-circ_0046263組HCCLM3細胞侵襲數(shù)少于si-NC組,Western blot結(jié)果顯示,si-circ_0046263組E-cadherin表達高于si-NC組,而N-cadherin表達低于si-NC組(P<0.05,圖2、表3),表明抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移侵襲。

      表3 抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲(±s,n=9)Tab.3 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      表3 抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲(±s,n=9)Tab.3 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.

      Groups si-NC si-circ_0046263 t P Scratch healing rate(%)63.92±5.02 22.53±2.091)22.835 0.000 Invasive cell number 99.61±9.14 42.94±4.121)16.957 0.000 E-cadherin protein 0.13±0.02 0.55±0.041)28.174 0.000 N-cadherin protein 0.66±0.05 0.25±0.021)22.841 0.000

      圖2 抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲Fig.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells

      2.4 circ_0046263靶向調(diào)控miR-1184表達circular RNA Interactome預(yù)測顯示,circ_0046263與miR-1184存在互補核苷酸序列(圖3)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,WT-circ_0046263與miR-1184共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性降低,而MUT-circ_0046263與miR-1184共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性無顯著變化(表4)。RT-qPCR結(jié)果顯示,pcDNAcirc_0046263組miR-1184表 達 低 于pcDNA組;si-circ_0046263組miR-1184表達高于si-NC組(P<0.05,表5)。表明circ_0046263可靶向調(diào)控miR-1184表達。

      圖3 circ_0046263序列中含有與miR-1184互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circ_0046263 contains a nucleotide sequence complementary to miR-1184

      表4 circ_0046263野生型和突變型載體與miR-NC、miR-1184共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性(±s,n=9)Tab.4 Luciferase activity of circ_0046263 wild-type and mutant vectors co-transfected with miR-NC and miR-1184(±s,n=9)

      表4 circ_0046263野生型和突變型載體與miR-NC、miR-1184共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性(±s,n=9)Tab.4 Luciferase activity of circ_0046263 wild-type and mutant vectors co-transfected with miR-NC and miR-1184(±s,n=9)

      Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

      Groups miR-NC miR-1184 t P WT-circ_0046263 1.03±0.07 0.61±0.061)13.667 0.000 MUT-circ_0046263 1.04±0.08 1.01±0.06 0.900 0.381

      表5 circ_0046263調(diào)控miR-1184表達(±s,n=9)Tab.5 circ_0046263 regulates expression of miR-1184(±s,n=9)

      表5 circ_0046263調(diào)控miR-1184表達(±s,n=9)Tab.5 circ_0046263 regulates expression of miR-1184(±s,n=9)

      Note:Compared with pcDNA group,1)P<0.05;compared with si-NC group,2)P<0.05.

      Groups pcDNA pcDNA-circ_0046263 si-NC si-circ_0046263 F P miR-1184 1.00±0.00 0.38±0.041)0.98±0.06 3.13±0.312)517.276 0.000

      2.5 miR-1184過表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的影響RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-1184后,miR-1184表達升高;克隆形成實驗中miR-1184組HCCLM3細胞克隆形成數(shù)少于miR-NC組(P<0.05),CCK-8實 驗 中,si-circ_0046263組HCCLM3細胞活性低于si-NC組,劃痕實驗結(jié)果顯示,si-circ_0046263組HCCLM3細胞劃痕愈合率低于si-NC組,Transwell結(jié)果顯示,si-circ_0046263組HCCLM3細胞侵襲數(shù)少于si-NC組,Western blot結(jié)果顯示,si-circ_0046263組E-cadherin表達高于si-NC組,而N-cadherin表達低于si-NC組(P<0.05,圖4、表6)。表明miR-1184過表達可抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲。

      表6 miR-1184過表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.6 Overexpression of miR-1184 inhibits proliferation,migration and invasion of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      表6 miR-1184過表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲(±s,n=9)Tab.6 Overexpression of miR-1184 inhibits proliferation,migration and invasion of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

      Groups miR-NC miR-1184 t P miR-1184 1.00±0.00 2.67±0.221)22.773 0.000 OD450 0.68±0.04 0.39±0.041)15.380 0.000 Cell clone formation 77.81±6.49 42.29±3.621)14.339 0.000 Scratch healing rate(%)64.87±5.19 28.56±3.291)17.727 0.000 Invasive cell number 96.83±8.22 49.67±5.421)14.369 0.000 E-cadherin protein 0.12±0.02 0.48±0.041)24.150 0.000 N-cadherin protein 0.68±0.05 0.30±0.031)19.551 0.000

      圖4 miR-1184過表達抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達Fig.4 Overexpression of miR-1184 inhibits expressions of proteins related to migration and invasion of liver cancer HCCLM3 cells

      2.6 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用si-circ_0046263與anti-miR-1184共轉(zhuǎn)染后miR-1184表達降低,克隆形成實驗中si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞克隆形成數(shù)多于si-circ_0046263+anti-miR-NC組(P<0.05),CCK-8結(jié)果顯示,si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞活性高于si-circ_0046263+anti-miR-NC組,劃痕實驗結(jié)果顯示,si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞劃痕愈合率高于si-circ_0046263+antimiR-NC組,Transwell結(jié)果顯示,si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞侵襲數(shù)多于si-circ_0046263+anti-miR-NC組,Western blot結(jié) 果 顯 示,si-circ_0046263+anti-miR-1184組E-cadherin表 達 低于si-circ_0046263+anti-miR-NC組,而N-cadherin表達 高 于si-circ_0046263+anti-miR-NC組(P<0.05,表7、圖5)。表明下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

      表7 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用(±s,n=9)Tab.7 Down-regulation of miR-1184 expression reversed effect of inhibiting circ_0046263 expression on proliferation,migration and invasion of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      表7 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用(±s,n=9)Tab.7 Down-regulation of miR-1184 expression reversed effect of inhibiting circ_0046263 expression on proliferation,migration and invasion of HCCLM3 cells(±s,n=9)

      Note:Compared with si-circ_0046263+anti-miR-NC group,1)P<0.05.

      Groups si-circ_0046263+anti-miR-NC si-circ_0046263+anti-miR-1184 t P miR-1184 1.00±0.00 0.27±0.031)73.000 0.000 OD450 0.31±0.03 0.57±0.041)15.600 0.000 Cell clone formation 33.82±4.58 69.14±6.021)14.008 0.000 Scratch healing rate(%)23.33±2.84 56.09±4.751)17.758 0.000 Invasive cell number 41.36±4.83 86.94±8.121)14.473 0.000 E-cadherin protein 0.57±0.05 0.25±0.021)17.827 0.000 N-cadherin protein 0.22±0.02 0.51±0.041)19.454 0.000

      圖5 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達的作用Fig.5 Down-regulating expression of miR-1184 reversed effect of inhibiting expression of circ_0046263 on expressions of proteins related to migration and invasion of liver cancer HCCLM3 cells

      3 討論

      近年分子靶向藥物治療已成為肝癌研究熱點,其可明顯改善患者療效;但目前分子靶向治療尚未成熟,急需發(fā)現(xiàn)新的分子靶點以開發(fā)相應(yīng)靶向藥物[9-11]。研究表明,circRNA可通過調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程在肝癌進程中發(fā)揮致癌作用或抑制作用,具有作為預(yù)后生物標志物及肝癌治療靶標的潛力[12]。如circTRIM33-12充當miR-191的海綿,可抑制肝細胞癌增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸[13]。circSETD3通過調(diào)控miR-421抑制肝細胞癌生長[14]。本研究發(fā)現(xiàn),肝癌組織中circ_0046263表達升高,提示circ_0046263在肝癌中起促癌作用。進一步抑制circ_0046263表達后,肝癌細胞HCCLM3活性降低,細胞克隆形成數(shù)減少,細胞劃痕愈合率降低,侵襲細胞數(shù)減少,且E-cadherin表達升高,N-cadherin表達降低,表明抑制circ_0046263表達抑制了肝癌細胞HCCLM3增殖、遷移和侵襲。

      研究報道,circ_0128846通過使miR-1184海綿化并釋放AJUBA使Hippo/YAP信號失活,從而促發(fā)結(jié)直腸癌[15]。干擾circBC048201表達可通過miR-1184/ITGA3軸抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲[16]。表明miR-1184不僅影響腫瘤進展,還可被circRNA調(diào)控。本研究結(jié)果顯示,肝癌組織中miR-1184呈低表達,過表達miR-1184后,肝癌細胞HCCLM3活性降低,細胞克隆形成數(shù)減少,細胞劃痕愈合率降低,侵襲細胞數(shù)減少,E-cadherin表達升高,N-cadherin表達降低;說明過表達miR-1184可抑制肝癌細胞進展。本研究還發(fā)現(xiàn)circ_0046263靶向調(diào)控miR-1184表達;下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

      綜上所述,抑制circ_0046263表達可能通過靶向上調(diào)miR-1184表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲。

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