基于斑馬魚生物模型的黃芩靶向降糖作用評(píng)價(jià)

劉 均，李 強(qiáng)，譚 蓉

中華全國供銷合作總社 杭州茶葉研究院/浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310016

黃芩（Scutellaria barbara，SB）為唇形科黃芩屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是常用大宗中藥材。SB根部可入藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血和安胎等功效。SB其它部位，如利用SB葉開發(fā)的“黃芩茶”可作代茶飲，已有近千年的歷史。SB葉具有較好的利用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿υ絹碓揭鹑藗兊年P(guān)注。但是，相對(duì)SB豐富的資源量來說，目前SB葉資源的利用率較低，而且對(duì)SB葉缺乏系統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，限制了SB產(chǎn)業(yè)綜合價(jià)值的提升。

斑馬魚（Zebra fish）是一種脊椎模式生物，與人類基因的相似度達(dá)87%，而且由于其養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精、體外發(fā)育及胚體透明，已成為生命科學(xué)研究的新寵。利用斑馬魚可以構(gòu)建人類各種疾病和腫瘤模型開展靶向藥物篩選及安全與毒理評(píng)價(jià)研究，如糖尿病[1-2]、高血脂[3-4]、高尿酸癥[5-6]及失眠[7-8]等。本試驗(yàn)以斑馬魚（5 days post fertilization，5 dpf）為對(duì)象，系統(tǒng)研究了不同濃度、不同孵育時(shí)間下斑馬魚對(duì)SB耐受性的影響，以及SB靶向降糖功效評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果可為SB葉開發(fā)黃芩茶及SB健康功能食品的開發(fā)等提供基礎(chǔ)理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器及試劑

全自動(dòng)智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱，天津市宏諾儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Multiskan SkyHigh），賽默飛世爾科技(中國)有限公司；精密電子天平（AL-204），梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；離心機(jī)（3K1S），德國sigma離心機(jī)公司；手持式高速勻漿機(jī)（MY-20），上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。SB，灤平縣濟(jì)世中藥材種子繁育限公司；阿卡波糖（Acarbose，ACA），拜耳醫(yī)藥保健有限公司；ALX（CAS號(hào)：2244-11-3，純度≥98%）；葡萄糖（glucose，GLU），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GLU檢測(cè)試劑盒（葡萄糖氧化酶法），南京建成生物工程研究所。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚（3月齡，AB型），上海費(fèi)曦生物科技有限公司。斑馬魚胚胎繁殖以自然交配方式進(jìn)行。每個(gè)產(chǎn)卵盒中按1∶1放入公魚和母魚，放入28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中。采用光周期為14 h光照與10 h黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便，清洗后換孵育水（60 μg/mL，海鹽水），置于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫孵育，每24 h換水一次，去掉卵膜和死卵。試驗(yàn)完成后，用三卡因甲磺酸對(duì)暴露斑馬魚麻醉處死。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚對(duì)Scutellaria barbara（SB）的耐受性試驗(yàn)

選取發(fā)育正常的 4 dpf（days post fertilization）野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予（0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000）μg/mL SB溶液（以生藥量計(jì)），分別記為 T0 ～ T10000，每孔加藥物 5 mL，置于 28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h換水一次，記錄每孔斑馬魚幼魚死亡數(shù)量，計(jì)算每組死亡率。以24 h為基準(zhǔn)，利用SPSS 17.0軟件中Regression中PROBIT程序計(jì)算其LC50，并利用Graphpad Prism 軟件中Analyze Data 中 XY analysis 中Linear regression 分析。

1.2.2 SB對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚GLU值影響試驗(yàn)

選取發(fā)育正常的4 dpf野生型AB系斑馬魚隨機(jī)分組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予 0 mg/ml GLU+0 μg/mL SB、10 mg/mL GLU+0 μg/mL SB、10 mg/mL GLU+200 μg/mL SB、10 mg/mL GLU+400 μg/mL SB 和 10 mg/mL GLU+800 μg/mL SB 溶液，分別記為 NC1、NC2、T1-200SB、T2-400SB和T3-800SB，每孔加藥物5 mL，置于28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔取10條魚于1.5 mL離心管中冷凍保存用于測(cè)定GLU含量。

1.2.3 SB對(duì)糖尿病斑馬魚GLU值影響試驗(yàn)

選取發(fā)育正常的4 dpf野生型AB系斑馬魚給予 10 mg/mL GLU+25 μM ALX 聯(lián)合孵育 24 h以誘導(dǎo)糖尿病模型，隨后將糖尿病斑馬魚隨機(jī)分組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15條，分別給予10 mg/mL GLU 與 0、200、400 和 800 μg/mL SB 或 400 μg/mL ACA聯(lián)合孵育24 h，并分別記為MC、T-200SB、T-400SB、T-800SB和T-400ACA。同步設(shè)置純水和10 mg/mL GLU組作為空白對(duì)照和高糖誘導(dǎo)對(duì)照組，分別記為NC1和NC2。試驗(yàn)結(jié)束后，每孔取10魚條于1.5 mL離心管中冷凍保存用于測(cè)定GLU含量。

1.3 檢測(cè)方法

GLU含量檢測(cè)按如下步驟進(jìn)行：取100 μL磷酸緩沖鹽溶液于裝魚的1.5 mL離心管中，采用高速手持式勻漿機(jī)勻漿1 min至魚體組織裂解充分，于 4℃下以 2 500 r/s離心 10 min，取上清樣2.5 μL采用GLU檢測(cè)試劑盒（GLU氧化酶法）測(cè)定GLU濃度，其測(cè)定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步處理后，用 Graphpad Prism 6.0 繪圖，并用 SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)；差異顯著性采用Duncan分析并將進(jìn)行多重比較，p＜ 0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚對(duì)SB的耐受性

從圖1可看出，斑馬魚幼魚對(duì)高濃度SB溶液具有不耐受性。SB濃度大于等于8000 μg/mL時(shí)，僅孵育24 h死亡率達(dá)到69.44%。另外，從孵育時(shí)間上看，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)死亡率不斷增加，尤其是 SB 劑量濃度為50 ～ 2 000 μg/mL，孵育72 h至120 h時(shí)致死作用明顯增強(qiáng)。以48 h基準(zhǔn)，采用SPSS中PROBIT程序分析得出斑馬魚幼魚的SB耐受性（表1），死亡率與SB濃度間的關(guān)系為 Probit（p）= -2.047000+0.000443X，按該模型計(jì)算得出SB的LC50為4 621.832 μg/mL，95% 可信范圍為 4 031.335 ～ 5 376.152 μg/mL。采用Graphpad Prism線性回歸分析得出斑馬魚幼魚的SB耐受性（圖2），死亡率（%）與SB濃度（μg/ml）間的關(guān)系為y=0.01050x-1.261（R2=0.9546），按該模型計(jì)算得出SB的LC50為4 882 μg/mL，正好處于Probit模型95%可信區(qū)間內(nèi)?？梢?，若按照10% ～ 25% LC50劑量濃度設(shè)置藥物處理組，孵育48 h可選用SB的適宜劑量濃度范圍為 462.18 ～ 1 155.46 μg/mL。

圖1 不同黃芩濃度及孵育時(shí)間對(duì)斑馬魚幼魚死亡率的影響Figure 1 Effects of different concentrations of Scutellaria barbara and its incubation time on the lethality rate of zebra fish larvae

表1 斑馬魚幼魚對(duì)黃芩耐受性影響的參數(shù)估計(jì)表Table 1 Parameter estimates of SB tolerance in zebra fish larvae

圖2 不同黃芩濃度對(duì)斑馬魚幼魚24 h死亡率的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Scutellaria barbara on the 24-hour lethallty rate of zebra fish larvae

2.2 SB對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚GLU值的影響

綜合斑馬魚幼魚對(duì)不同濃度SB耐受性的特點(diǎn)，選取200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB用于開展SB靶向降糖作用功效評(píng)價(jià)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以10 mg/mL GLU處理可明顯增加斑馬魚幼魚組織中的GLU值，達(dá)到12.97%（p＞ 0.05）。另外，與 10 mg/mL GLU 處理組相比，200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB 處理可以降低斑馬魚葡萄糖值分別達(dá)到28.32%（p＞0.05）、27.11%（p＜ 0.05）和 35.37%（p＜ 0.05），表明適宜劑量濃度的SB具有降糖作用（圖3）。

圖3 黃芩對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚葡萄糖值的影響Figure 3 Effects of Scutellaria barbara on the values of glucose of hyperglycemia-induced zebra fish larvae

2.3 SB對(duì)糖尿病斑馬魚GLU值的影響

從圖3可看出，與空白對(duì)照組相比，10 mg/mL GLU單獨(dú)誘導(dǎo)組并未顯著增加GLU值（p＞0.05），但 10 mg/mL GLU 和 0.025 mM ALX 聯(lián)合處理組GLU值從0.0930 mM增加到0.2129 mM，增長(zhǎng)1.29倍（p＜ 0.05）。相比糖尿病模型對(duì)照組，200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB處理組斑馬魚GLU值分別降低了7.37%、8.36%和8.31%，差異均不顯著（p＞ 0.05），但是ACA處理組GLU值降低了17.90%（p＜ 0.05）。結(jié)果表明SB具有一定的降糖能力，但其降糖效應(yīng)明顯低于ACA。

圖4 黃芩對(duì)糖尿病斑馬魚葡萄糖值的影響Figure 4 Effects of Scutellaria barbara on the values of glucose of diabetic zebra fish larvae

4 討論與結(jié)論

SB屬多年生草本植物，其作為一種中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是治療感冒、流感、發(fā)燒等的常用藥物。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為SB具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，SB中富含黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素和漢黃芩苷等多種功能活性成分[9]。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)SB中富含的芩黃素（apigenin）、黃芩黃素（baicalein）、黃芩素（scutellarin）、5,7-二羥黃酮（chrysin）、芹菜素（apigenin-7-O-glucuronide）和黃芩苷（baicalin）等8種黃酮類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制能力，且抑制作用強(qiáng)于阿卡波糖。Wang等[11]基于通路蛋白和蛋白互作關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（a pathway-based protein-protein association network）分析發(fā)現(xiàn) 5,7-二羥黃酮（chrysin）、漢黃芩素（wogonin）和5,8,20-trihydroxy-7-methoxy flavone是 α-葡萄糖苷酶抑制劑的主要活性成分，而5-羥色胺能突觸通路（the serotonergic synapse pathway）是黃芩苷抗2型糖尿病的關(guān)鍵通路。本試驗(yàn)以斑馬魚為對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度（200 μg/mL、400 μg/mL和800 μg/mL）SB提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)模型中和胰島損傷模型中斑馬魚GLU值均有降低作用，與劉智等[12]研究結(jié)果一致，他們研究發(fā)現(xiàn) SB 莖葉總黃酮（75 mg/kg/d 和 150 mg/kg/d）可以顯著降低2型糖尿病型高脂血癥大鼠血糖。另趙碧玲等[13]也研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷（160 mg/kg/d）可以顯著降低糖尿病腎病SD雄性大鼠的血糖，表明SB具有一定的降糖效應(yīng)。

SB降糖作用機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化[14-15]、改善胰島素敏感性[13]、促進(jìn)血脂穩(wěn)定[16]與改善腸道微生態(tài)[17]等有關(guān)。Park等[14]研究發(fā)現(xiàn)SB甲醇提取物中約含有91.8 mg/g沒食子酸當(dāng)量的多酚物質(zhì)，對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用，并且清除DPPH自由基能力較強(qiáng)，可顯著降低過氧化氫誘導(dǎo)的人白細(xì)胞DNA損傷。陳麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)SB（10 g/kg/d，每mL SB提取物含生藥2 g）顯著提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，顯著降低丙二醛含量，表明SB可以顯著增加機(jī)體的抗氧化能力，減輕組織自由基代謝紊亂。劉智等[12]研究發(fā)現(xiàn)SB莖葉總黃酮（75 mg/kg/d和 150 mg/kg/d）可以顯著提升胰島素敏感性指數(shù)，表明SB莖葉總黃酮降糖降脂與改善胰島素抵抗作用有關(guān)。王勝男等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SB提取物（210 mg/kg/d、420 mg/kg/d和840 mg/kg/d）可以顯著降低糖尿病小鼠血清甘油三酯水平。Na等[17]研究發(fā)現(xiàn)SB可改善2型糖尿病患者糖耐量，并可改善腸道菌群平衡，尤其顯著增加乳酸桿菌（Lactobacillus）和阿克曼菌（Akkermansia）豐度，并改善炎癥反應(yīng)?？梢奡B可能成為治療糖尿病的潛在藥物，但也有不一致的結(jié)果。胡蜀紅等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷（200 mg/kg/d）可降低糖尿病大鼠糖化血紅蛋白含量和腎小球血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量，但對(duì)血糖無明顯影響。本試驗(yàn)以斑馬魚為生物模型，系統(tǒng)研究了不同SB濃度和不同孵育時(shí)間下對(duì)斑馬魚幼魚生物耐受性的影響，并開展了高糖誘導(dǎo)型（過食）和胰島素?fù)p傷型（糖尿病）斑馬魚靶向降糖作用評(píng)價(jià)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，需要構(gòu)建穩(wěn)定可靠的生物模型，繼續(xù)深入開展SB靶向降糖作用及其干預(yù)機(jī)制等研究，開展SB葉的生物活性、科學(xué)及安全性評(píng)價(jià)；繼續(xù)瞄準(zhǔn)亞健康人群開展靶點(diǎn)研究和功效評(píng)價(jià)，開發(fā)精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與個(gè)性化功能性飲品等。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，斑馬魚（5 dpf）對(duì)高濃度的SB具有不耐受性，孵育48 h 時(shí)的LC50為4 621.832 μg/mL，95% 可信范圍為 4 031.335 ～5 376.152 μg/mL。按10% ～ 25% LC50劑量濃度推薦可用于靶向功效評(píng)價(jià)的適宜劑量濃度為462.18 ～1 155.46 μg/mL。在 10 mg/mL GLU 誘導(dǎo)斑馬魚模 型 中，200 μg/mL、400 μg/mL 和 800 μg/mL SB處理斑馬魚GLU值分別降低了28.32%（p＞0.05）、27.11%（p＜ 0.05）和 35.37%（p＜ 0.05）；在 10 mg/mL GLU 和 0.025 mM ALX 誘導(dǎo)的糖尿病斑馬魚模型中，200 μg/mL、400 μg/mL 和800 μg/mL SB處理組斑馬魚GLU值分別降低了7.37%、8.36%和8.31%，但差異均不顯著（p＞0.05）。表明SB對(duì)過飲過食、糖尿病前驅(qū)或糖尿病患者具有一定的降糖作用，作為我國傳統(tǒng)中藥材其在功能食品上具有廣闊的應(yīng)用前景，SB葉可開發(fā)為保健茶飲。