王小川,李 昕,閻晉東,張 慧,趙小英

(湖南大學(xué)生物學(xué)院植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南省雜交油菜工程技術(shù)研究中心,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410082)

油菜是一種重要的油料作物,其株高嚴(yán)重影響作物的抗倒能力、產(chǎn)量和機(jī)械化收割。甘藍(lán)型油菜倒伏導(dǎo)致種子重量下降11%,收獲指數(shù)下降3.3%[1]。同時(shí),倒伏后的油菜難以收割,使損失更加嚴(yán)重。矮稈及半矮稈株型油菜品系選育有利于提高植株抗倒伏能力和收獲指數(shù)[2]。作物矮化大多與植物激素生物合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān),其中與赤霉素(gibberellin,GA)和油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)相關(guān)的研究較多,與生長(zhǎng)素(auxin)相關(guān)的研究比較少[3]。在小麥和水稻中,研究人員已成功分離、克隆出矮稈基因并將其應(yīng)用在育種中,取得了“綠色革命”的巨大成功[4～6]。目前,科研工作者已發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制了多個(gè)油菜矮稈材料,并對(duì)部分矮稈基因進(jìn)行了定位克隆。本文就油菜矮稈相關(guān)基因定位克隆及其應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 赤霉素相關(guān)油菜矮稈基因定位克隆

GA是控制植物株高的重要植物激素,GA信號(hào)缺陷導(dǎo)致植物變矮。近20年來,多個(gè)與GA信號(hào)相關(guān)的油菜矮稈基因被分離和鑒定(表1)。1995年,Foisset等[7～9]通過甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)誘變“Primor”品種,篩選到一個(gè)矮稈突變體bzh。該突變體的矮稈性狀受單基因控制,矮稈相關(guān)基因Bzh定位于A6染色體上。經(jīng)EMS誘變獲得的半矮稈突變體ds-1[10～11]由單個(gè)部分顯性基因BnaA6.rga-ds控制,其與Bzh互為等位基因,編碼GA信號(hào)抑制子RGA(repressor of ga l-3)蛋白。在突變體RGA蛋白的DELLA結(jié)構(gòu)域中,VHYNP保守序列中的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?序列突變?yōu)閂HYNL),致使突變體對(duì)GA不敏感,油菜株高變矮。與ds-1類似,EMS誘變雙低品種HS5獲得的矮稈突變體ds-3[12]對(duì)GA的敏感性降低,它受半顯性基因BnaC07.RGA控制,在該基因編碼的RGA蛋白的DELLA結(jié)構(gòu)域中,VHYNP保守序列中的脯氨酸也突變?yōu)榱涟彼?導(dǎo)致RGA不能與GA受體GID1(GA-insensitive dwarf 1)相互作用,GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻,RGA蛋白積累,最終植株矮化。白菜型油菜矮稈突變體dwf2[13～14]也是一個(gè)GA不敏感突變體,突變體中RGA基因編碼的DELLA蛋白C末端GRAS保守區(qū)域的第328位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)榫彼?R),致使RGA不能與E3泛素連接酶SCFSLY1相互作用,RGA蛋白降解受阻,GA信號(hào)減弱,植株變矮。經(jīng)硫酸二乙酯(diethylsulfate,DES)與快中子照射聯(lián)合處理得到的矮稈突變體ndf-1[15～16]對(duì)GA也不敏感,在該突變體中,編碼GA受體的BnGID1基因啟動(dòng)子嘧啶盒(P-box)序列有3個(gè)堿基發(fā)生突變(兩個(gè)TT突變?yōu)镃C,1個(gè)G缺失),從而影響了BnGID1的正常表達(dá),導(dǎo)致GA信號(hào)減弱,進(jìn)而使植株變矮。因此,GA信號(hào)受體GID1或者GA信號(hào)關(guān)鍵抑制子DELLA家族蛋白R(shí)GA的量發(fā)生變化,都會(huì)影響GA信號(hào)的正常傳遞,進(jìn)而控制油菜株高。

表1 油菜矮稈突變體及相關(guān)基因Table 1 Dwarf mutants and related genes of Brassica napus

此外,宋稀等[17]在田間獲得一個(gè)自然矮化突變體dw-1,其平均株高為95 cm,由1對(duì)加性-顯性主基因控制,并已被證明是GA響應(yīng)減弱類型突變體。Zeng等[18]通過EMS誘變從甘藍(lán)型油菜自交系T6中獲得一個(gè)矮稈突變體bnaC.dwf。該突變體受1對(duì)隱性基因控制,對(duì)外源GA3處理不敏感,表明其GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在缺陷。目前,dw-1和bnaC.dwf矮稈性狀相關(guān)基因尚未定位克隆。

GA代謝過程發(fā)生變化也會(huì)影響植物株高。GA代謝途徑中的赤霉素2-氧化酶(GA 2-oxidase,GA2ox)能通過β-羥基化作用將活性GA1和GA4催化,形成無活性GA8和GA34,降低生物活性GAs的含量,進(jìn)而影響植物株高。近幾年,課題組從甘藍(lán)型油菜中分離了兩個(gè)GA2ox基因BnGA2ox6和BnGA2ox2,發(fā)現(xiàn)BnGA2ox6異源表達(dá)到擬南芥中能夠使轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出GA缺乏表型,幼苗下胚軸變短,成年植株變矮;經(jīng)外源GA3處理,植株又能夠恢復(fù)幼苗下胚軸長(zhǎng)度和株高[19]。與Bn-GA2ox6類似,BnGA2ox2在擬南芥和油菜中異源表達(dá)或者過量表達(dá)時(shí),導(dǎo)致擬南芥和油菜幼苗及成年植株矮化;噴施外源GA3也能夠恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植株表型[20]。這些研究結(jié)果表明,BnGA2ox6和BnGA2ox2是兩個(gè)新的油菜矮稈相關(guān)基因。

2 生長(zhǎng)素相關(guān)油菜矮稈基因定位克隆

生長(zhǎng)素也是控制植物株高的主要植物激素之一。近年來,科研工作者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的矮稈突變體,并定位克隆了矮稈性狀相關(guān)基因(表1)。Zhao等[21]在“矮源1號(hào)”小孢子培養(yǎng)過程中獲得一個(gè)矮稈突變體ds-4,其成熟期株高為23 cm左右,受半顯性基因BnaC05.IAA7控制。該基因編碼生長(zhǎng)素信號(hào)負(fù)調(diào)節(jié)子AUX/IAA(auxin/indole-3-acetic acid)蛋白 IAA7,突變體中AUX/IAA7蛋白保守區(qū)域第87位的脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?序列GWPPV突變?yōu)镚WLPV),使生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的AUX/IAA7與生長(zhǎng)素受體TIR1(transport inhibitor response 1)的相互作用受到抑制,導(dǎo)致IAA7不能被降解而積累,植株莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受抑制而變矮。EMS誘變矮稈突變體sca[22]的株高為76 cm左右,受半顯性基因BnaA3.IAA7控制。該突變體IAA7蛋白第84位的甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?序列GWPPV突變?yōu)镋WPPV),破壞了保守結(jié)構(gòu)域,降低了生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的BnaA3.IAA7與TIR1的親和力,抑制了低濃度生長(zhǎng)素條件下BnaA3.IAA7蛋白降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而降低了油菜株高。顯性矮稈突變體g7[23]也可能與生長(zhǎng)素信號(hào)受阻有關(guān),其矮稈基因定位在C5染色體的0.6 Mb區(qū)間內(nèi),其中一個(gè)單核苷酸突變(G-A)使Bna.IAA7.C05編碼蛋白IAA7第89位甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?即保守序列GWPPV突變?yōu)镋WPPV,這可能與矮稈表型有關(guān)。課題組前期已將EMS誘變突變體 bnd2(Brassica napus dwarf 2)[24～25]的矮稈性狀相關(guān)基因BND2定位在A8染色體15.62 Mb至15.76 Mb的140 kb區(qū)間,該區(qū)域內(nèi)有27個(gè)候選基因,其中BnaA08g20960D基因第5個(gè)內(nèi)含子中存在一個(gè)單堿基突變(C-T),使得BnaA08g20960D的表達(dá)量降低。該基因與擬南芥編碼肌醇1,3,4,5,6-五磷酸-2激酶的AtIPK1基因同源,AtIPK1催化肌醇1,2,3,4,5,6-六磷酸(inositol hexakisphosphate,InsP6)生物合成中的最后一步[26]。InsP6已被證明是生長(zhǎng)素受體TIR1的輔酶,能夠穩(wěn)定TIR1蛋白構(gòu)象,保證生長(zhǎng)素有效地與TIR1活性位點(diǎn)結(jié)合,引發(fā)生長(zhǎng)素響應(yīng)[27～29]。因此,我們推測(cè)BnaA08g-20960D是BND2的候選基因,目前正在開展遺傳學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

此外,Zheng等[30]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)自然矮稈突變體ed1,該突變體受一個(gè)半顯性基因控制,成熟期株高為23 cm左右,葉片卷曲。研究人員初步證明ed1是一個(gè)IAA/BR不敏感突變體,與IAA信號(hào)途徑有關(guān)。這為ed1矮稈性狀相關(guān)基因的定位提供了線索。

3 其他油菜矮稈突變體

浦惠明等[31]研究的甘藍(lán)型油菜矮稈品種“矮源1號(hào)”在成熟階段平均株高約為24 cm,矮稈性狀呈顯性。自然矮稈突變體99cdam[32]的株高約為85 cm,受3對(duì)隱性基因控制。矮稈突變體bndf-1[33]的株高約為75 cm,株型緊湊,矮稈性狀受單顯性基因控制。EMS誘變矮稈突變體bndwf1[34]的成熟期株高為80～110 cm,受單顯性基因控制;bndwf1突變體基因定位于A9染色體152 kb區(qū)間內(nèi),該區(qū)間包含14個(gè)注釋或預(yù)測(cè)的基因,其中7個(gè)可能與bndwf1的矮稈表型有關(guān)。EMS誘變矮稈突變體bndwf/dcl1[35]的株高為40～70 cm,受單顯性基因控制,該突變體基因定位于C5染色體175 kb區(qū)間內(nèi)。矮稈新材料dw871[36～38]的株高性狀由1對(duì)顯性主基因控制,后者初步定位在A10染色體1.83 Mb區(qū)間內(nèi);該株系矮稈單株后代品質(zhì)表現(xiàn)為雙低和雜黃籽,其豐產(chǎn)性與同源高稈品系相當(dāng),是甘藍(lán)型油菜新型矮稈種質(zhì)資源。王偉榮等[39]在航空誘變甘藍(lán)型油菜品種“0602”“0607”“滬油12”“滬油14”和“滬油16”的后代中也發(fā)現(xiàn)了矮稈新材料。這表明航天誘變也是選育新品種的一條有效途徑。需要指出的是,上述矮稈突變體是否與GA、IAA、BR等植物激素生物合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)尚不明確。

4 油菜矮稈基因應(yīng)用研究

大量育種實(shí)踐表明,適當(dāng)?shù)闹旮邔?duì)于提高抗倒性和產(chǎn)量尤為重要。傅廷棟[40]認(rèn)為,半矮稈抗倒伏材料能使收獲速度增加25%;關(guān)周博等[41]提出,適合機(jī)械化收割的油菜品種一般以1.5～1.7 m株高為宜。近年來,科研工作者利用矮稈基因育成了一系列具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗倒品種(系)、不育系和雜交組合。Wang等[42]將矮稈基因NDF-1轉(zhuǎn)育到雙低甘藍(lán)型油菜品系中,育成了矮稈雙低品系ddf-1和ddf-2,其單株種子產(chǎn)量、收獲指數(shù)和生物量都有了顯著的提高。ddf-1與高稈品系雜交獲得的F1植株株型理想,超親優(yōu)勢(shì)率高達(dá)30%～40%。此外,該團(tuán)隊(duì)利用NDF-1矮稈基因育成的矮稈核不育兩用系與高稈優(yōu)良品系雜交,選育出了半矮稈抗倒、耐肥、耐密植且高產(chǎn)的強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合。另有研究人員將白菜型油菜矮稈突變體dwf2(brrga1-d)等位基因?qū)胫晷透叽?、易倒伏的甘藍(lán)型油菜中,顯著降低了株高,提高了抗倒伏性,且對(duì)油菜產(chǎn)量無明顯影響[14]。將矮稈突變體bndf-1與其他親本雜交,獲得的雜種F1的株高也顯著降低,同時(shí)產(chǎn)量也無顯著影響[33],提示該突變體具有較好的應(yīng)用前景。將油菜矮稈突變體sca與油菜品種4312、ZS11和ZY821配組,獲得的雜交F1植株株高介于兩個(gè)親本之間,并且單株產(chǎn)量顯著高于兩個(gè)親本[22],表明這些雜交組合具有較強(qiáng)的產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)。張瑞茂等[36～37]利用新選育的dw871矮稈材料開展了兩項(xiàng)轉(zhuǎn)育工作,一是將dw871矮稈直立株型轉(zhuǎn)育到現(xiàn)有的高稈甘藍(lán)型油菜品種,成功獲得了大量的矮稈直立株型常規(guī)品系;二是進(jìn)行甘藍(lán)型油菜隱性核不育三系的轉(zhuǎn)育,獲得3份不同來源的甘藍(lán)型油菜隱性核不育三系,實(shí)現(xiàn)了三系配套。他們提供的多個(gè)矮稈直立株型甘藍(lán)型油菜新組合已在長(zhǎng)江流域各省區(qū)市進(jìn)行多點(diǎn)試驗(yàn)與示范。最近,課題組將矮稈突變體bnd2與高稈品種L329雜交,發(fā)現(xiàn)雜交F1與L329相比,株高沒有增加,但是單株產(chǎn)量增加,提示bnd2可用于甘藍(lán)型油菜抗倒伏和高產(chǎn)雜交育種[25]。這種矮稈性狀并不影響雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn),并且以矮稈為母本,以高稈為父本,更有利于雜交制種。因此,矮稈基因在油菜雜交育種中具有極好的應(yīng)用前景。

5 展望

盡管在甘藍(lán)型油菜中已經(jīng)報(bào)道了多個(gè)矮稈突變體材料,定位克隆了多個(gè)矮稈基因,但由于與產(chǎn)量相關(guān)的其他農(nóng)藝性狀受影響,所以產(chǎn)量降低,目前只有少數(shù)材料可用作實(shí)際育種資源。因此,選育具有育種應(yīng)用價(jià)值的矮稈材料和定位克隆矮稈基因,仍然是未來的一個(gè)研究方向。

近年來,隨著參考基因組研究和高通量測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing)發(fā)展,基于高通量測(cè)序技術(shù)與混合樣本分組分析(bulked segregant analysis,BSA)相結(jié)合的方法,即BSA-seq,加速了重要性狀相關(guān)基因的克隆。該方法已被成功地用于定位克隆油菜矮稈基因[25]。此外,新發(fā)展的油菜60K單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片可以用來快速對(duì)甘藍(lán)型油菜進(jìn)行全基因組基因分型,以及快速鑒定與目標(biāo)基因相關(guān)的SNP位點(diǎn);油菜60K SNP芯片結(jié)合BSA方法可快速鑒定與目標(biāo)基因連鎖的區(qū)段[43]。Hu等[44]將油菜60K SNP芯片與BSA分析相結(jié)合,在甘藍(lán)型油菜中鑒定出與裂葉相關(guān)的31個(gè)SNP,并通過傳統(tǒng)連鎖分析對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。Li等[45]利用油菜SNP芯片和BSA分析,鑒定出兩個(gè)控制油菜分枝形成的主效數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL)。這些生物技術(shù)手段和方法的綜合應(yīng)用,將進(jìn)一步提高油菜重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位克隆效率。

矮稈油菜在生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值,也是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要材料。對(duì)自然或人工誘變的矮稈突變體的矮稈基因進(jìn)行定位和克隆,將為培育豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適宜機(jī)械化栽培的矮稈油菜品種提供理論依據(jù)。