陳 賢， 趙延存， 明 亮， 楊 勇， 劉鳳權(quán)

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇南京210014；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州310021)

由革蘭氏陰性黃單胞菌稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)引起的水稻白葉枯病(BB)嚴重危害水稻生產(chǎn)，是世界性的十大植物病害之一[1-2]。Xoo屬于γ-變形菌綱，呈短桿狀，在菌體一端有1根線狀鞭毛。在自然環(huán)境中，Xoo主要侵染水稻，也可侵染李氏禾、馬塘、茭白、野生稻、紫云英、看麥娘及草蘆等植物[3-4]。病原菌可入侵水稻葉片、種子等組織部位，并隨種子調(diào)運實現(xiàn)遠距離的傳播和擴散。在侵染循環(huán)中，Xoo可通過農(nóng)業(yè)灌溉水、暴風(fēng)雨等媒介接觸秧苗，從傷口和水孔進入水稻維管束，最后引起系統(tǒng)性侵染[5]。水稻白葉枯病于1884年在日本發(fā)現(xiàn)，隨后該病害在全球各主要水稻栽培地區(qū)均有發(fā)生的報道，在中國，該病害在水稻主產(chǎn)區(qū)都發(fā)生過，且以華南、華中及華東等稻區(qū)較為嚴重，北方稻區(qū)局部發(fā)生[6]。

水稻白葉枯病在水稻的整個生長周期內(nèi)均可發(fā)生，且以水稻的孕穗期最為嚴重[7]。Xoo侵染寄主后可使抽穗延遲，穗形變小，秕谷增多，一般減產(chǎn)10%～50%，發(fā)病嚴重時絕收[8]。水稻白葉枯病的癥狀與品種抗性、發(fā)病條件、侵入時期、侵染部位等有關(guān)。水稻白葉枯病的癥狀有4種類型，包括：葉枯型、黃化型、凋萎型和急癥型，以葉枯型最為常見[2]。水稻白葉枯病從潛伏到發(fā)生具有突發(fā)性快、對產(chǎn)量影響大等特點。20世紀80年代至90年代初期，是水稻白葉枯病在中國重發(fā)、流行時期,其中，1980年發(fā)生面積1.60×106hm2，稻谷損失超過4.50×105t[9]。近年來，隨著水稻品種的變化和稻種的南繁北調(diào)、災(zāi)難性天氣頻發(fā)和病原菌致病性的變異、栽培方式的變化等，水稻白葉枯病在華南、華東及華中等稻區(qū)的發(fā)生有潛在上升趨勢[10-11]。據(jù)統(tǒng)計，2017年中國水稻白葉枯病的發(fā)生面積超過6.67×105hm2[10]。

1 水稻白葉枯病主效抗病基因

截至2022年1月，經(jīng)文獻報道和國際注冊確認的水稻白葉枯病主效抗病基因共有46個，包括：17個隱性基因，29個顯性基因[12]。其中，36個基因已被定位，10個基因(OsXa1、Osxa5、OsXa7、OsXa10、Osxa13、OsXa21、OsXa23、OsXa25、OsXa26、OsXa27)已被成功克隆(表1)。在已被克隆的抗病基因中，OsXa21來自于西非長藥野生稻(Oryzalongistaminata)，OsXa23來自中國普通野生稻(Oryzarufipogon. Griff)，OsXa27來自中國小粒野生稻(OryzaminutaAcc.No: 101133)[13]。

表1 已經(jīng)克隆的水稻抗白葉枯病基因

OsXa21、OsXa23和OsXa27為廣譜抗性基因。OsXa21是一個編碼LRR-RK受體類蛋白激酶的主效抗病基因[14]，是在水稻育種中被廣泛運用的抗病基因之一。OsXa21對國內(nèi)和國際上的Xoo生理小種均表現(xiàn)為高抗。OsXa21與avrXa21(RaxX)互作后，其帶有核定位的激酶區(qū)域與OsWARKY64互作，進而激活水稻防御基因的轉(zhuǎn)錄，增強水稻抗病性[15]。OsXa23為廣譜全育期抗性基因，由章琦等[13]從普通野生稻中鑒定獲得。OsXa23最為可能的候選基因是LOC_OS11g37620，對該基因的研究尚處在功能驗證階段[16]。OsXa27為廣譜抗性基因，受avrXa27誘導(dǎo)表達，且表達僅限于侵染區(qū)域。在感病材料中，avrXa27可抑制宿主過敏性反應(yīng)(HR)的發(fā)生，并操縱糖轉(zhuǎn)移蛋白來獲取營養(yǎng)[17]。

Osxa5、Osxa13均為隱性基因。Osxa5是一個編碼TFIIAγ類轉(zhuǎn)錄因子的抗性基因[18]。Osxa5與其等位基因OsXa5僅存在2個堿基的差異：Osxa5第39號氨基酸為疏水性纈氨酸，OsXa5第39號氨基酸為親水性谷氨酸。攜帶Osxa5的抗病材料和攜帶OsXa5的感病材料接種Xoo后，病原菌在抗病材料中的擴散速率明顯低于感病材料，推測抗性基因Osxa5可能通過減緩病原菌在維管束中的擴散轉(zhuǎn)移速率使寄主表現(xiàn)出抗性。Osxa13為隱性抗病基因，OsXa13為感病基因[19]。OsXa13的啟動子區(qū)域可被pthXo1專一化識別，激活的OsXa13與CopT1、CopT5互作，可將銅離子從維管束中移到外部，維持維管束內(nèi)部的低銅離子環(huán)境，促進病原菌的增殖、擴散[20]。在攜帶Osxa13的抗病材料中，Osxa13啟動子區(qū)域不能被pthXo1識別，造成病原菌無法操控寄主的免疫反應(yīng)，最終使得水稻抗病，推測啟動子區(qū)域的差異可能是造成抗病和感病差異的主要因素。OsXa25是一個顯性抗病基因，為組成型表達模式。Osxa25和OsXa25均編碼一個MtN3家族蛋白[21]，它們之間僅有8個氨基酸不同，而在啟動子區(qū)域沒有差別，推測二者在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異可能是造成抗病和感病差異的主要因素。

OsXa1、OsXa21及OsXa26均為編碼受體類蛋白激酶的抗性基因。OsXa1為具核苷酸結(jié)合位的亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域(NBS-LRR)類蛋白質(zhì)，無跨膜結(jié)構(gòu)域[22]。OsXa1在感病材料中不表達，只在抗病品種中受Xoo和機械損傷的誘導(dǎo)表達，且對日本的水稻白葉枯病菌生理小種1號表現(xiàn)為專一性高抗。推測，病原菌某個未知的無毒蛋白質(zhì)可通過誘導(dǎo)OsXa1的表達來增強水稻抗病性。OsXa26為富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶(LRR-RK)，對水稻白葉枯病菌JL691生理小種表現(xiàn)為專一性抗性[23]。Osxa26為持家基因，且僅在維管束內(nèi)表達。在感病材料中，Osxa26與其等位基因OsXa26只在富含亮氨酸片段(LRR)區(qū)域有差異。推測，該區(qū)域的微小變化可能造成二者在抗性上的巨大差別。

OsXa10是一個編碼六聚體蛋白的抗病基因，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且受AvrXa10誘導(dǎo)表達[24]。OsXa10被激活后參與細胞內(nèi)鈣離子泄漏以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解，進而啟動細胞程序性死亡，阻斷病原的增殖和擴散，最終增強水稻抗病性。

2 水稻白葉枯病抗病相關(guān)基因

在水稻與Xoo識別、互作的過程中，除了46個主效抗病基因參與之外，抗病相關(guān)基因也參與了水稻的抗病性。與主效抗病基因不同，多數(shù)抗病相關(guān)基因介導(dǎo)的抗病性大多沒有生理小種特異性。一般情況下，抗病相關(guān)基因多數(shù)位于抗病信號傳導(dǎo)的下游，故而其抗病性比主效抗病基因低[28]。據(jù)不完全統(tǒng)計，有超過16個抗病相關(guān)基因參與水稻對白葉枯病的抗病性(表2)。

表2 已經(jīng)克隆的水稻抗白葉枯病相關(guān)基因

OsCDR1和OsWRKY45均受水楊酸(SA)和苯并噻二唑(BTH)誘導(dǎo)表達[29-30]。OsCDR1是一個組成型抗病相關(guān)基因，編碼一個天冬氨酸蛋白酶[31]。在轉(zhuǎn)基因植株中，過表達OsCDR1可促進SA的合成，并誘導(dǎo)防御蛋白PR1和PR2的表達，最終增強水稻對白葉枯病的抗病性。OsWRKY45是一個編碼WRKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的抗性基因[30]。在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達OsWRKY45，磷酸化后的OsWRKY45會激活其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，調(diào)控防御基因的表達，最終增強水稻的防御能力。OsSnL6介導(dǎo)的抗病性也與SA信號途徑相關(guān)。OsSnL6是一個編碼類肉桂酰輔酶A還原酶的抗病相關(guān)基因[32]。在NPR1同源蛋白(NH1)抗性植株中，抑制OsSnL6的表達可下調(diào)病程防御基因的表達量，并增強水稻對白葉枯病的感病性。有關(guān)OsSnL6介導(dǎo)NH1的抗病信號網(wǎng)絡(luò)仍需進一步解析。

OsXB24、OsXb3、OsBiP3、OsWRKY62在OsXa21基因介導(dǎo)的水稻白葉枯病免疫反應(yīng)中具有重要作用。OsXB24是OsXa21的受體，負調(diào)控OsXa21介導(dǎo)的抗病性。在水稻中沉默OsXB24，可增強水稻對Xoo的抗病性[33]。相反，在水稻中過表達OsXB24，OsXa21被OsXB24磷酸化后降解，使得水稻感病。OsXb3是一個編碼泛素連接酶E3的抗病基因，泛素化OsXa21[34]。理論上，OsXb3下調(diào)表達應(yīng)該會增加OsXA21的積累。在沉默OsXb3感病植株中，OsXa21積累量是減少的，具體的機制未知。OsBiP3是一個編碼熱激蛋白HSP70的抗病性相關(guān)基因，參與OsXa21蛋白的穩(wěn)定性和折疊[35]。OsWRKY62是編碼一個轉(zhuǎn)錄因子的抗病性基因，負調(diào)控OsXa21介導(dǎo)的水稻基礎(chǔ)抗病性[36]。在過表達OsWRKY62的轉(zhuǎn)基因植株中，防御基因的表達均受到抑制，最終使得水稻喪失抗病性。

OsLOL2和OsSpL28均參與細胞程序性死亡。OsLOL2是鋅指蛋白家族的抗性蛋白，參與調(diào)控水稻抗病性[37]。在水稻中過表達OsLOL2，PR1等防御基因的表達量均上調(diào)，株系表現(xiàn)為抗水稻白葉枯病。OsLOL2參與調(diào)控水稻細胞程序性死亡，而OsLOL2參與的水稻抗病性是否與細胞程序性死亡有關(guān)，需進一步研究。OsSpL28是一個編碼斑點葉蛋白的抗病相關(guān)基因[38]，它編碼的蛋白質(zhì)定位于高爾基體膜上，參與調(diào)控囊泡運輸。在OsSpL28突變的抗病性植株中，過氧化氫在斑點周圍大量積累并形成過敏性反應(yīng)，抵御病原菌的侵入，具體的信號網(wǎng)絡(luò)未知。

OsPdk1、OsOXi1和OsMPK6均為激酶基因。OsPdk1是一個編碼3-磷酸肌醇(PI3)依賴性蛋白激酶的抗病相關(guān)基因[39]。過表達OsPdk1可以增強水稻抗白葉枯病。OsPdk1位于OsOxi1-OsPti1a信號上游，與OsOxi1互作，正調(diào)控水稻的基礎(chǔ)抗病性。OsOXi1是一個編碼絲氨酸/色氨酸激酶的抗病性基因[40]。在過表達OsOXi1的抗病性植株中，OsOXi1通過磷酸化OsPti1a調(diào)控水稻的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。突變OsOXi1第233號氨基酸位點則使水稻感病。OsMPK6是編碼一個有絲分裂原活化蛋白激酶的抗病性基因，負調(diào)控水稻的防御反應(yīng)[41]。OsMPK6在水稻抗白葉枯病中發(fā)揮雙面作用，既是激活子又是抑制子[41-42]。在沉默或敲除OsMPK6的轉(zhuǎn)基因抗病性植株中，參與水稻防御相關(guān)基因的表達均上調(diào)；相反，在水稻中過表達OsMPK6，參與寄主防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均受到抑制，具體的機制未知。

OsrTGA2.1是一個編碼轉(zhuǎn)錄因子的抗病性相關(guān)基因[43]。在OsrTGA2.1沉默的抗病性增強植株中，大部分防御基因均上調(diào)表達，暗示該基因可能負調(diào)控水稻的抗病性。OsDR8是一個合成硫胺素的抗病性相關(guān)基因，位于抗病信號上游[44]。在敲除OsDR8的抗病性喪失植株中，大部分防御基因均下調(diào)表達，推測該基因通過調(diào)控防御基因的表達參與水稻抗性。OsGH3-8是一個編碼調(diào)控生長素活性的抗病性相關(guān)基因[45]。OsGH3-8通過抑制生長素活性阻止細胞壁松弛，從而增強水稻的抗病性。OsHPL3是一個編碼過氧化氫裂解酶的抗病性相關(guān)基因[46]。在OsHPL3突變的抗病性植株中，茉莉酸(JA)的合成途徑和信號途徑均被激活，具體的信號網(wǎng)絡(luò)未知。

3 水稻感病基因

水稻抗病性是由基因決定的一種生物學(xué)特性，由寄主和病原菌共同形成[50]。當病原菌無毒基因識別水稻抗病性基因時，會誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性。相反，當無毒基因識別感病基因時，則會導(dǎo)致植株感病。

目前，水稻中的感病基因分為2類：一類是SWEET基因家族的第三亞族基因成員，包括：OsSWEET11/OsXa13、OsSWEET12、OsSWEET13/OsXa25、OsSWEET14和OsSWEET15；另一類是轉(zhuǎn)錄因子[51-52]。SWEET家族是一類參與蔗糖及單糖運輸?shù)奶寝D(zhuǎn)運蛋白，具有典型的MtN3/saliva跨膜結(jié)構(gòu)域[53]。據(jù)推測，水稻基因組中SWEET基因數(shù)量超過21個。在SWEET類基因中，病原菌TALE效應(yīng)蛋白被分泌運輸?shù)郊闹骷毎?，能直接特異結(jié)合其啟動子序列并調(diào)控SWEET的表達，促進蔗糖合成，并在維管束中積累，這些蔗糖為病原菌的生長和增殖提供了豐富的營養(yǎng)，最終使得水稻感病[54]。例如：水稻白葉枯病菌TALE效應(yīng)蛋白可識別Xa13的啟動子區(qū)域，操控它的表達，進而使得水稻感病。相反，如果xa13的啟動子發(fā)生了變異而無法被病原菌TALE效應(yīng)蛋白所識別，則無法誘導(dǎo)它們表達，水稻表現(xiàn)抗病[55-56]。因此，利用基因編輯技術(shù)對SWEET家族基因的啟動子進行編輯修飾后，也可以創(chuàng)制廣譜抗水稻白葉枯病的新品種[51]。

4 水稻抗病性基因與白葉枯病菌無毒基因的互作機制

水稻與病原菌Xoo的互作機制符合Flor[57]提出的基因-基因假說。當病原菌相對應(yīng)的毒性基因(vir)或無毒基因(avr)被水稻抗病基因(R)感知識別時，能在侵染區(qū)域激發(fā)強烈的免疫反應(yīng)，限制病原菌的生長、增殖和擴展，水稻表現(xiàn)為抗病[58]。例如，avrxa5-Osxa5[59]、avrXa7-OsXa7[60]、avrXa10-OsXa10[24]、avrXa27-OsXa27[61]、avrXa23-OsXa23[16]、avrxa13-Osxa13[55]、raxX-OsXa21[62]、pthXo6-OsTFX1[63]、pthXo7-OsTFIIAγ[64]和pthXo8-OsHen1[65]等(表3)。其中，avrXa7-OsXa7、avrXa10-OsXa10及avrXa27-OsXa27研究的比較深入。

表3 水稻抗病基因及其對應(yīng)的病原菌無毒基因

OsXa7是一個顯性抗病基因，對中國華南稻區(qū)攜帶AvrXa7的病原菌具有較高的抗性[25]。水稻白葉枯病菌AvrXa7蛋白被OsXa7識別后，在侵染區(qū)域可快速觸發(fā)免疫防御反應(yīng)，最終阻斷病原菌擴散[60]。OsXa10也是一個顯性抗病基因，并受AvrXa10調(diào)控。激活的OsXa10參與鈣離子泄露和程序性細胞死亡，誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生過敏性反應(yīng)[27]。如果病原菌不攜帶AvrXa10，則攜帶Xa10基因的株系表現(xiàn)為感病。

OsXa27也是一個顯性抗病基因，對攜帶Ⅲ型效應(yīng)因子基因AvrXa27的病原菌表現(xiàn)為專一抗性[66]。在抗病材料和感病材料中，OsXa27的編碼區(qū)域完全相同，二者在啟動子區(qū)域有10個堿基的差異[17]。AvrXa27可誘導(dǎo)抗病材料中OsXa27的表達，而在感病材料中OsXa27則不表達。推測啟動子區(qū)域的差異是造成二者差異的主要因素。在攜帶OsXa27的抗病材料中，OsXa27識別病原菌的AvrXa27后，在維管束細胞中大量表達，最終將病原菌限制在侵染區(qū)域[61]。相反，在攜帶OsXa27的感病材料中，由于病原菌無法成功誘導(dǎo)激活OsXa27的表達，最終使得寄主感病。

5 水稻對白葉枯病菌的主要防御機制

水稻與病原菌互作的過程中形成了許多防御體系，一般可分為誘導(dǎo)型防御體系和組成型防御體系[68]。誘導(dǎo)型防御體系由獲得性系統(tǒng)抗病性(SAR)和誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗病性(ISR)組成，是水稻抵御病原菌侵染的第二類防御系統(tǒng)，是水稻的先天性免疫系統(tǒng)[69]。組成型防御體系是水稻抵御病原菌侵染的第一道防線[2]，它主要由物理屏障(結(jié)構(gòu)抗病性)和化學(xué)屏障(生化抗病性)組成，是水稻既存的抗病性。

在潛伏早期，物理屏障和化學(xué)屏障能在一定程度上阻止病原菌的侵入或擴增，且二者往往同時發(fā)揮作用[70]。水稻物理屏障主要由氣孔、細胞壁角質(zhì)層及蠟質(zhì)層等組成[71]。氣孔等入侵通道是Xoo進入植株體內(nèi)重要的理化障礙，其數(shù)量的多寡也會影響品種的抗病性[5]。水稻氣孔的口徑為0.90 μm，水孔的大小約是氣孔的2倍[72]。Xoo的大小為0.61 μm×1.79 μm，推測病原菌可能不通過氣孔入侵水稻[73]。除了水孔外，葉片形態(tài)也會間接影響病原菌的擴散[74]。在抗病品種中，一般株型緊湊、葉片窄而挺直、開張角度小、葉片絨毛多[75]。相反，感病品種生長茂盛，且葉片平展，葉片相互摩擦幾率大，利于病原菌的傳播擴散[50]。生長素(IAA)和油菜素內(nèi)脂(BR)均參與調(diào)控水稻葉片角度，BR參與水稻對Xoo的抗性[76-77]。有關(guān)BR能否通過調(diào)控葉片角度參與水稻白葉枯病菌的傳播擴散有待進一步探索。水稻的化學(xué)屏障主要由酚類化合物或木質(zhì)素等具有抗菌或抑菌活性的次生代謝物組成[50]。在抗病品種中，植株體內(nèi)的多元酚和糖類均高于感病品種，而有利于病原菌生長的谷氨酸和天冬氨酸的含量則比較低[78]。

水稻的誘導(dǎo)性防御機制包括病原相關(guān)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)和效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI)，是水稻主要的先天性免疫防御系統(tǒng)[79]。PTI是一種由病原菌相關(guān)分子模型(PAMPs)所激發(fā)的一類具有廣譜性、持久性和穩(wěn)定性的抗病反應(yīng)，是一種低水平、非特異性、基礎(chǔ)性的免疫反應(yīng)[80]。例如，OsFLS2屬于LRR-RLK結(jié)構(gòu)蛋白，OsFLS2識別病原菌的Flg22后，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可通過與OsRac1互作激活PTI。相對于PTI，ETI促發(fā)的免疫反應(yīng)更為快速、劇烈、專一化，是水稻與病原菌在協(xié)同進化中獲得的特異性免疫反應(yīng)[81]。在病原菌侵染寄主后，由效應(yīng)分子觸發(fā)ETI的部位均表現(xiàn)為過敏性壞死(HR)，進而限制病原菌的擴散和傳播[82]。ETI能使寄主產(chǎn)生SAR，也具有廣譜抗性。例如，OsXa21是位于細胞膜上的抗病蛋白質(zhì)，它能特異性識別Xoo分泌的RaxX蛋白，繼而激活水稻免疫反應(yīng)[15]。

6 展望

水稻與Xoo的互作十分復(fù)雜。病原菌入侵植株，不但會引起寄主細胞和病原菌細胞結(jié)構(gòu)的變化，也會誘導(dǎo)水稻內(nèi)源防御系統(tǒng)的變化。目前，綜合防控水稻白葉枯病的方法包括：培育抗病品種、化學(xué)防治和生物防治等主要措施。水稻白葉枯病抗性基因具有多樣性，其介導(dǎo)的抗病機制沒有明確的交叉現(xiàn)象。因此，深入解析抗病基因和抗病相關(guān)基因的作用機理，對于抗病品種的布局、輪換以及多基因聚合育種具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

水稻與Xoo是一種敵我的協(xié)同進化關(guān)系，符合“基因-基因”假說。在植物病理學(xué)家的共同努力下，對水稻白葉枯病抗性基因的作用機理已經(jīng)進行了深入而系統(tǒng)的研究。若從病原菌與寄主互作的角度出發(fā)，以下3個科學(xué)問題尚待明確：第一，Xoo哪些致病基因會被寄主誘導(dǎo)表達，與之對應(yīng)的水稻誘導(dǎo)物是什么？第二，水稻哪些抗病性基因會被Xoo誘導(dǎo)表達，與之對應(yīng)的無毒基因又分別是什么，它們的互作關(guān)系如何？第三，如何在水稻育種中統(tǒng)籌使用好抗病基因和抗病相關(guān)基因？因此，深入解析抗病基因與致病基因的互作分子機制，將為水稻白葉枯病的綜合防控提供理論依據(jù)。