劉孟超，張金鑫，曲魯江，劉華貴 ,王 梁

（1.北京市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，北京 100005；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097；4.北京市畜牧總站，北京 100107）

家養(yǎng)動物馴化以后，隨著人類的遷移分散到世界各地，在人類的生產(chǎn)、生活中發(fā)揮著重要作用。家養(yǎng)動物和野生動物相比，其外貌表型、生活習(xí)性、抗病免疫等方面都存在顯著差異。家雞由紅色原雞馴化而來（已有報道證實紅色原雞中的部分基因來源于灰色原雞的滲入[1]），經(jīng)過數(shù)千年的人工和自然選育，逐漸形成了體型外貌、行為習(xí)性、生產(chǎn)用途各異的地方雞品種，用來滿足人類對雞蛋、雞肉、娛樂（如斗雞、觀賞雞等）等方面的需求。

北京油雞作為北京的地方品種，在清朝中期已經(jīng)形成，經(jīng)過長期的選育形成了具有特殊外貌（即鳳頭、毛腳和胡子嘴）、肉蛋品質(zhì)兼優(yōu)的地方雞種，此外北京油雞少數(shù)個體存在多趾現(xiàn)象。近年來，研究者利用微衛(wèi)星、線粒體和高密度芯片等多種數(shù)據(jù)針對北京油雞遺傳資源現(xiàn)狀展開了調(diào)研[2]，圍繞北京油雞進(jìn)行了相應(yīng)的遺傳資源評估、保護(hù)和利用工作，目前該品種已經(jīng)在保種場得到了保護(hù)，同時通過將北京油雞作為遺傳品系進(jìn)行選育配套，形成了相應(yīng)的配套系。另外，針對北京油雞的不同外觀性狀，鑒定找到了與多趾、鳳冠性狀相關(guān)的基因或基因組區(qū)段[3-4]。這些工作為北京油雞的品種保護(hù)和利用提供了有價值的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

隨著全基因組測序技術(shù)價格的降低，該技術(shù)在雞等動物遺傳資源鑒定和評估方面得到了廣泛應(yīng)用。本研究利用北京油雞和其他國內(nèi)外雞種的基因組數(shù)據(jù)，應(yīng)用di選擇參數(shù)[5]，比對北京油雞和其他品種的基因組分化區(qū)域，分析北京油雞所特有的基因組選擇信號，并鑒定這些選擇信號下相關(guān)的特定基因，分析這些區(qū)域與北京油雞特異性性狀之間的關(guān)聯(lián)，找到北京油雞特異性性狀的全基因組特征，為進(jìn)一步了解和開發(fā)北京油雞奠定遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 北京油雞、紅色原雞和其他7 個中外雞種（白來航、白洛克、洛島紅、絲羽烏骨雞、藏雞、瓢雞和東濤雞），共計133 個樣本，其中：

1）瓢雞、東濤雞和北京油雞群體中部分個體進(jìn)行翅下靜脈采集，約1 mL 血樣置于盛有0.3 mL 抗凝劑（ACD）的離心管（2 mL）中，顛倒混勻后置于-20℃冰箱長期保存?zhèn)溆谩２捎锰旄蚪M試劑盒（TIANGEN，DP318）提取禽血DNA，最后取DNA 樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以保證DNA 條帶的完整性，最后將滿足質(zhì)量的DNA 用于建庫測序（Illumina Hiseq 2500 平臺）；

2）紅色原雞組織樣為中國農(nóng)科院韓建林老師提供，通過Illumina Hiseq 2500 平臺進(jìn)行測序；

3）白洛克、白來航、洛島紅、絲羽烏骨雞和藏雞樣本來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)表在NCBI 上的二代測序數(shù)據(jù)（SAMN14651083）。

1.2 數(shù)據(jù)比對和統(tǒng)計分析 全基因組原始數(shù)據(jù)利用BWA軟件[6]進(jìn)行比對，GATK4.0 軟件[7]獲得原始SNP 和indel。之后，利用VCFTOOLs 對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾及FST計算[8]。9 個雞群共計133 個樣本的基因組數(shù)據(jù)用于FST 及di 數(shù)據(jù)分析。

本研究利用了2 個參數(shù)，即群體分化指數(shù)FST[9]和di 統(tǒng)計量[5]。FST 是衡量2 個品種差異最為常見的選擇信號分析方法之一，將FST 結(jié)果進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為di 統(tǒng)計量分析，采用滑動窗口的形式，檢測不同品種特異性受選擇區(qū)域。該方法能夠更好地用于3 個以上群體的群體差異分析，從而鑒定到針對北京油雞特異性性狀的基因組學(xué)特征。以下是這2 個參數(shù)的計算方法：

1.3 基因注釋和功能分析 根據(jù)雞第6 版的基因組注釋信息，利用Ensembl 數(shù)據(jù)庫對北京油雞特異性的全基因組di 分析結(jié)果進(jìn)行注釋（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002315.5/），查找相關(guān)SNP 的位置信息，通過R 語言對結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)概況 本研究利用全基因組二代重測序數(shù)據(jù)，樣本基因組測序深度在8.1×～48.04×，比對率均在95% 以上（表1）。基于第六版參考基因組，通過GATK 軟件本研究共得到31 134 064 個SNPs，經(jīng)過過濾后（標(biāo)準(zhǔn)：-max-missing 0.5，-maf 0.05，-minQ 20，-min-meanDP 5，-max-meanDP 1000，-minGQ 5）13 768 621 個SNP 被保留用于后續(xù)分析。

表1 樣本來源及測序數(shù)據(jù)概況

2.2 選擇信號檢測 研究采用基因組滑動窗口的方式進(jìn)行，以20 kb 的窗口大小、10 kb 的滑動步長，對北京油雞和其他8 個品種的FST 和di 結(jié)果進(jìn)行分析，探究北京油雞與其他品種表型差異的分子遺傳學(xué)原因，鑒定北京油雞特異性性狀的候選基因。通過對北京油雞全基因組di 分析，本研究一共劃分出96 018 個受選擇窗口，其di 選擇信號值范圍在-29.10～44.14 之間，詳細(xì)結(jié)果見圖1。di 值越大，表明該區(qū)域受選擇強(qiáng)度越高。將di值前1% 的基因組區(qū)域（960 個區(qū)域，di＞18.68）設(shè)定為顯著區(qū)域，涉及378 個基因，可以看到顯著區(qū)域覆蓋雞的多條染色體（1，2，3，4，11，13，15，17，33）。在這378 個基因里，鑒定找到了40 個與北京油雞特征性狀（毛腳、鳳冠、毛色，多趾）、適應(yīng)性性狀（免疫調(diào)節(jié)）、生長發(fā)育和繁殖性狀相關(guān)的候選區(qū)域及基因（表2）。

圖1 di 在常染色體上檢測到的選擇信號的全基因組分布

2.3 基因注釋及功能分析 與北京油雞特異性性狀相關(guān)的候選基因可分為以下4 類。一是與外觀相關(guān)的性狀：北京油雞具有多趾、鳳冠、胡子嘴、羽毛較為密集等特征，本研究鑒定到的與之對應(yīng)的基因包括：與鳳冠形成相關(guān)的HOXC8、HOXC10基因[10-11]，與毛脛、多趾相關(guān)的PITX1、TBX5基因[12-13]，與羽毛發(fā)育和性狀相關(guān)的IL9、HOX家族[14]、FZD4[15-16]基因等（表2）。由于在馴化和品種形成過程中，人類總會依據(jù)個人喜好將一些品種特有的外觀性狀保留下來，這就使得相應(yīng)的等位基因變異得以保存，并在基因組分析過程中使北京油雞與其他雞種特有差異的基因組區(qū)段被鑒定出來。二是與色素沉積相關(guān)的性狀：色素沉積的性狀主要包括蛋殼顏色、羽毛顏色和皮膚顏色等，由于色素性狀相對變異比較大，也更容易滿足人們對動物顏色喜好的選擇，所以在品種形成過程中也往往是受到正向選擇的。本研究鑒定到的基因包括影響蛋殼顏色的SLCO1A2[17]、SLCO1C1[18]等基因，與羽毛顏色或者膚色相關(guān)的MC1R[19]、TYR[20]等基因（表2）。三是免疫相關(guān)性狀。在品種選育過程中，品種所接觸的環(huán)境總會發(fā)生變化，包括接觸到的病原微生物也會有所差異。為了適應(yīng)新的環(huán)境，所形成品種的免疫反應(yīng)和相關(guān)基因也會受到選擇。本研究鑒定到的與北京油雞相關(guān)的基因包括：與禽白血病抗性相關(guān)的HSPA5基因，與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的CSF2、IL13、IL4、KK34、ZFP36L2基因以及與禽流感抗性相關(guān)的USP18基因（表2）。四是與發(fā)育、繁殖、生長等生產(chǎn)性狀相關(guān)的基因：包括與生長發(fā)育相關(guān)的BCL2L13、CNMD、FGF1、CXCL14、FZD4、IGF1、LMX1B、PBX3、IRX2、PMCH、TBX3等基因[21-23]，與繁殖（產(chǎn)蛋）性狀相關(guān)的SYCP3基因等[24]。同時，與視力相關(guān)的LHX5基因也在油雞品種形成過程中受到了明顯的選擇，而馴化動物視力下降從而變得溫順也是人類選擇家養(yǎng)動物的指標(biāo)之一（表2）。di 值檢測選擇信號不僅為雞馴化過程中的選擇信號鑒定提供幫助，同時也證明了利用di 值挖掘品種特異性性狀候選區(qū)域的可靠性。

表2 di 檢測到的與北京油雞表型性狀相關(guān)的潛在候選區(qū)域和基因

3 討 論

家雞在馴化過程中經(jīng)歷長期的自然選擇、人工選擇、遷移、遺傳漂變等事件的洗禮，逐漸分化出了不同的亞種或亞群，在體型外貌、環(huán)境適應(yīng)性、行為習(xí)性等方面已經(jīng)與野生祖先大為不同[1]。作為北京地方雞種的北京油雞，體型外貌則尤為特殊，是地方雞多樣性研究的熱點之一。選擇信號分析是生物信息分析中的“考古學(xué)”，通過選擇信號檢測能夠找到生物群體在千萬年進(jìn)化過程中在基因組上留下的痕跡[25]。這些痕跡可能與家禽育種、馴化適應(yīng)等方面密切相關(guān)，因此選擇信號研究有助于挖掘與家禽特異性狀相關(guān)的基因，了解性狀形成的潛在的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)一步解析群體之間差異性狀的遺傳機(jī)制，對于家禽遺傳改良有著重要意義。

選擇信號的檢測方式有很多種，主流的檢測手段可分為四大類：基于等位基因頻率譜、基于連鎖不平衡、基于群體分化和基于基因組雜合度的方法，針對不同的數(shù)據(jù)類型、數(shù)據(jù)質(zhì)量以及研究對象，可采用不同的選擇信號檢測方法[26]。本研究采用基于群體分化的di 選擇信號檢測方法來鑒定品種特異性選擇信號，檢測到許多與北京油雞體型、外貌相關(guān)的受選擇基因組區(qū)域，如油雞特有的鳳冠、多趾和毛脛等。此外，相比于其他地方雞種，北京油雞羽毛更豐富。因此，在本研究中也鑒定到了與羽毛生長發(fā)育相關(guān)的基因。在其他家養(yǎng)動物中，也有類似的發(fā)現(xiàn)，尤其是毛色（羽色）等色素沉積方面的性狀[27]。

家養(yǎng)動物與其野生祖先在生活地域方面也有很大差異。紅色原雞主要生活在東南亞四季溫濕度較高的環(huán)境，家雞則遍布世界各地，所面對的氣候條件、病原微生物則各不相同，雞就需要有相應(yīng)遺傳學(xué)變化去適應(yīng)這些環(huán)境[1]。本研究中，在北京油雞中鑒定到了很多與免疫調(diào)節(jié)、抗病相關(guān)的基因，說明這些基因在雞基因組馴化過

程中都受到了強(qiáng)烈的選擇。北京油雞在適應(yīng)環(huán)境的過程中，形成了自己特有的針對北京及周邊地區(qū)環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制。這也與其他家養(yǎng)動物或者其他雞品種的培育過程中免疫和環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的基因組區(qū)段受到選擇的研究結(jié)果一致[28-29]。

北京油雞作為家養(yǎng)品種，除了用作觀賞及文化傳承的載體外，最主要的作用還是滿足人們對雞肉和雞蛋的需要。因此，在北京油雞受選擇的基因組區(qū)域本研究還挖掘到部分與生長和產(chǎn)蛋相關(guān)的候選基因，其中IGF1基因[23]在很多家養(yǎng)動物中都受到了選擇，該基因與體型和生長速度關(guān)系密切。

4 結(jié) 論

本研究采用群基因組二代測序技術(shù)和基于群體分化計算的di 選擇信號分析，在北京油雞基因組中鑒定出960 個受到選擇的顯著區(qū)域，包括378 個受選擇的候選基因?；蜃⑨尫治鼋Y(jié)果表明，選擇作用體現(xiàn)在北京油雞的外貌表型、生長發(fā)育等方面，鑒定到了與油雞特異性狀（鳳冠、多趾和毛腳）以及與抗病免疫相關(guān)的基因，本研究結(jié)果對北京油雞品種遺傳資源的進(jìn)一步保護(hù)和利用具有重要意義。