甕佳旭，仇鑫，2，李子孝，2，3，4

隨著年齡的增長(zhǎng)，體細(xì)胞突變?cè)谠煅杉?xì)胞（hemopoietic stem cells，HSCs）中逐漸積累，導(dǎo)致克隆性造血（clonal hematopoiesis，CH）現(xiàn)象的發(fā)生[1]。當(dāng)克隆性造血發(fā)生在沒(méi)有血液系統(tǒng)腫瘤等異常的個(gè)體中時(shí)被定義為不確定潛能的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）[2]。已有多項(xiàng)研究表明，攜帶CHIP與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。甲基胞嘧啶雙加氧酶-2（methylcytosine dioxygenase 2，TET2）基因作為研究最為廣泛的CHIP相關(guān)基因，其突變可加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，并增加冠心病、卒中等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中是缺血性卒中最常見(jiàn)的類型[6]，盡管傳統(tǒng)的動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素如高血壓、高血脂和糖尿病等已成為卒中一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防的重點(diǎn)干預(yù)對(duì)象，且已取得了明顯的干預(yù)效果，但卒中的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率仍不容樂(lè)觀[7]，需要尋找未知的潛在機(jī)制并對(duì)患者進(jìn)行更精準(zhǔn)的干預(yù)，以改善卒中預(yù)后。本文總結(jié)了與年齡相關(guān)的CHIP主要基因TET2參與卒中發(fā)生及發(fā)展過(guò)程的可能機(jī)制，為探究卒中防治措施提供新思路。

1 TET2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)

TET2位于人4號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)4帶（4q24）區(qū)域，其編碼蛋白TET2屬于依賴于Fe2+和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）的TET雙加氧酶家族，在DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。TET2蛋白氨基端的具體結(jié)構(gòu)尚不清楚，其羧基末端由1個(gè)半胱氨酸富集區(qū)域和1個(gè)雙鏈β-螺旋結(jié)構(gòu)組成，是發(fā)揮去甲基化作用的核心催化結(jié)構(gòu)。TET2作用于不同修飾形式的胞嘧啶（cytosine，C），可以將5-甲基胞嘧啶（5-methyl cytosine，5mC）依次氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl cytosine，5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5-formyl cytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxyl cytosine，5caC）。5fC和5caC又可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（thymine DNA glycosylase，TDG）特異性識(shí)別并切除，進(jìn)而啟動(dòng)堿基切除修復(fù)途徑（base excision repair，BER），從而實(shí)現(xiàn)主動(dòng)DNA去甲基化過(guò)程[9]。TET2去甲基化作用發(fā)生在各種生物環(huán)境中，對(duì)胚胎發(fā)生、細(xì)胞分化和神經(jīng)元功能等多種過(guò)程具有關(guān)鍵影響[10]。

2 TET2基因突變相關(guān)CHIP與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)系

卒中的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，動(dòng)脈粥樣硬化是其中重要病因之一。作為一種內(nèi)膜炎癥性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成涉及血管內(nèi)皮功能障礙、炎癥細(xì)胞募集等過(guò)程[11]。既往研究表明，TET2基因可能通過(guò)多種方式影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Jaiswal等[3]將Tet2敲除（knockout，KO）和野生（wildtype，WT）小鼠的骨髓細(xì)胞分別移植到低密度脂蛋白受體敲除后易患動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠中，通過(guò)測(cè)量小鼠主動(dòng)脈根部病變的大小來(lái)評(píng)估其動(dòng)脈粥樣硬化程度。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)的第5周、9周、13周和17周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈粥樣硬化病灶分別是對(duì)照組的2.0倍、1.7倍、1.4倍和2.7倍。Fuster等[4]在類似的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Tet2KO小鼠在第9周時(shí)表現(xiàn)出了比WT小鼠擴(kuò)大60%的粥樣硬化斑塊，并發(fā)現(xiàn)斑塊面積與血管內(nèi)膜中巨噬細(xì)胞數(shù)量具有相關(guān)性。將Tet2KO和WT小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞與低密度脂蛋白（200 mg/mL）共同體外培養(yǎng)，使用mRNA測(cè)序分析轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示，具有促炎作用的細(xì)胞因子、趨化因子基因在Tet2KO小鼠的巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄上調(diào)[4]，以CXC趨化因子亞家族（CXC chemokine subfamily，Cxcl）1、Cxcl2、Cxcl3、Pf4及細(xì)胞因子基因IL-1β和IL-6的轉(zhuǎn)錄上調(diào)最為顯著。Tet2KO小鼠血清中趨化因子的水平是WT小鼠的2～4倍[3]。這說(shuō)明Tet2基因功能喪失可以加速小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化，其機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子、趨化因子的轉(zhuǎn)錄增加有關(guān)。

除此之外，TET2基因還可參與到血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能等過(guò)程中，通過(guò)去甲基化功能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。VSMCs去分化是動(dòng)脈粥樣硬化的主要促進(jìn)因素之一[12]，Liu等[13]的研究揭示了通過(guò)選擇性去除VSMCs特異性基因組蛋白H3第4位賴氨酸上的二甲基化修飾后，會(huì)出現(xiàn)TET2募集受損，VSMCs的分化能力喪失。在氧化低密度脂蛋白處理的內(nèi)皮細(xì)胞中，沉默TET2基因可導(dǎo)致自噬相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的自噬，加速其功能障礙[14-16]。

3 TET2基因突變相關(guān)CHIP與卒中的關(guān)系

既往已有研究發(fā)現(xiàn)，CHIP與卒中風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。2014年，Jaiswal等[17]發(fā)現(xiàn)包括TET2基因突變?cè)趦?nèi)的160個(gè)體細(xì)胞突變相關(guān)CHIP攜帶者發(fā)生缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)為非CHIP攜帶者的2.6倍（HR2.6，95%CI1.3～4.8，P=0.003）。2020年，來(lái)自英國(guó)的一項(xiàng)研究提示，具有更高變異等位基因頻率（variant allele fraction，VAF）＞10%的CHIP攜帶者，發(fā)生聯(lián)合血管事件（心肌梗死、卒中或死亡等）的風(fēng)險(xiǎn)更高（HR1.59，95%CI1.21～2.09，P＜0.001），其中TET2基因突變相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)增高65%（HR1.65，95%CI1.05～2.75，P=0.041）[18]。

2021年，Bhattachary等[19]進(jìn)一步的研究顯示CHIP可作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素增加卒中的風(fēng)險(xiǎn)。此項(xiàng)研究共納入了86 178例參與者，其中6%為CHIP攜帶者，數(shù)據(jù)分析顯示CHIP攜帶者的卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)約為非CHIP攜帶者的1.14倍（HR1.14，95%CI1.03～1.27，P=0.01），CHIP為卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。對(duì)常見(jiàn)CHIP突變相關(guān)基因（DNMT3A、TET2、ASXL1、TP53）分別進(jìn)行分析，結(jié)果顯示只有TET2基因與卒中（缺血性和出血性）風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)（HR1.85，95%CI1.19～2.79，P=0.004），且TET2基因突變相關(guān)CHIP攜帶者缺血性卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是未攜帶者的1.93倍（HR1.93，95%CI1.18～3.05，P=0.006）。在缺血性卒中的病因類型分析中，攜帶CHIP與小血管病型缺血性卒中具有顯著相關(guān)性（HR1.55，95%CI1.20～2.02，P=0.001），提示CHIP與腦白質(zhì)病變等腦小血管病可能有潛在相關(guān)性，值得進(jìn)一步研究。

4 TET2基因突變相關(guān)CHIP與卒中功能預(yù)后

卒中后免疫炎性反應(yīng)是影響患者功能預(yù)后的重要因素[20-21]。在卒中急性期，缺血損傷的細(xì)胞釋放內(nèi)源性損傷因子——損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）可激活小膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子釋放，招募中性粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞進(jìn)入缺血腦組織[21]。而在CHIP發(fā)生后，帶有突變的HSCs產(chǎn)生髓系分化偏移，增強(qiáng)固有免疫系統(tǒng)的炎癥應(yīng)答，從而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[22]。

最新一項(xiàng)納入485例ST段抬高型心肌梗死患者的前瞻性研究對(duì)入組者進(jìn)行了3年的隨訪，發(fā)現(xiàn)VAF≥2%的TET2基因突變相關(guān)CHIP攜帶者的全因死亡率顯著增加（HR2.71，95%CI1.30～5.65，P=0.008），復(fù)合不良血管事件（全因死亡、復(fù)發(fā)非致死性心肌梗死、非致死性卒中或心力衰竭住院）的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加（HR2.86，95%CI1.57～5.21，P=0.001）。研究進(jìn)一步比較了VAF≥2%的患者與＜2%的患者IL-1β和IL-6因子的血漿濃度，發(fā)現(xiàn)VAF≥2%的患者血漿中上述炎癥因子的水平顯著增高，這可能是導(dǎo)致疾病進(jìn)展及預(yù)后不良的因素之一[23]。目前關(guān)于TET2基因突變與卒中預(yù)后的臨床研究較少，但有研究認(rèn)為，TET2基因可通過(guò)獨(dú)立于其催化活性的途徑增加巨噬細(xì)胞IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[4，24]，而卒中后腦損傷與局部及全身IL-1β水平增高有關(guān)。IL-1βKO小鼠中IL-1β蛋白失活可顯著減小卒中后的梗死體積[25]，這提示靶向調(diào)控TET2基因功能，可能會(huì)減少相關(guān)炎癥因子釋放，進(jìn)而改善預(yù)后。另有研究顯示，TET2基因可以通過(guò)組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）介導(dǎo)的組蛋白去乙?；l(fā)揮抑制IL-1β基因轉(zhuǎn)錄的作用[26]。使用HDAC抑制劑曲古抑菌素A處理Tet2KO和WT小鼠的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2組IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平均明顯增加。除此之外，TET2還可通過(guò)調(diào)節(jié)Nod樣受體蛋白3（Nod-1ike receptor protein 3，NLRP3）炎性小體介導(dǎo)的IL-1β裂解過(guò)程影響其分泌[4，24]。因此，卒中后靶向調(diào)控TET2基因的表達(dá)可能通過(guò)NLRP3的抑制減少I(mǎi)L-1β增加，有望減少腦損傷，成為具有前景的治療靶點(diǎn)。

腦缺血發(fā)生24 h內(nèi)對(duì)腦組織樣本進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，即可發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞數(shù)量的增多[27]，其激活可受到骨髓調(diào)動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn)Tet2KO小鼠接受炎癥刺激后，可以出現(xiàn)中性粒細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，提示Tet2突變可能改變中性粒細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的作用效應(yīng)，從而影響卒中預(yù)后[28]。

5 TET2突變相關(guān)CHIP與治療

逆轉(zhuǎn)TET2基因突變的克隆性造血或靶向干預(yù)TET2基因相關(guān)炎性通路，可能是未來(lái)預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病的一個(gè)思路。Cimmino等[29]利用可逆轉(zhuǎn)的RNA干擾轉(zhuǎn)基因小鼠模型模擬了Tet2基因表達(dá)的恢復(fù)，可在體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)異常的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的自我更新。有研究證明，通過(guò)阻斷炎癥小體和IL-1β可抑制Tet2基因突變導(dǎo)致的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化加速[30]。MCC950作為NLRP3的特異性阻滯劑，在小鼠模型中可以抑制IL-1β的分泌，從而改善由Tet2基因突變導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化或心力衰竭。除此之外，卡那單抗抗炎血栓結(jié)局研究（canakinumab antiinflammatory thrombosis outcomes study，CANTOS）是一項(xiàng)國(guó)際多中心、雙盲、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，共納入了10 061例hsCRP≥2 mg/L的心肌梗死患者，結(jié)果提示使用150 mg劑量的卡那單抗（人抗IL-1β單克隆抗體）可顯著減少CRP水平升高心肌梗死患者的不良心血管結(jié)局[31]，提示靶向炎癥途徑在改善血管疾病不良預(yù)后中可能具有良好前景。目前卒中領(lǐng)域的相關(guān)研究仍然空缺，未來(lái)可開(kāi)展靶向干預(yù)TET2基因相關(guān)炎癥通路的探索研究。

CHIP是人類衰老、炎癥和心腦血管疾病間相互影響機(jī)制的重要連接途徑[30]。作為CHIP中最常見(jiàn)的突變類型之一，TET2基因相關(guān)CHIP是近年新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立于傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的心腦血管疾病潛在危險(xiǎn)因素。TET2基因突變可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞加速炎癥，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，增加卒中等心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。另外，TET2基因突變可參與并促進(jìn)多種免疫炎性反應(yīng)介導(dǎo)的腦損傷，可能與卒中后不良預(yù)后相關(guān)。逆轉(zhuǎn)克隆性造血或靶向干預(yù)TET2等相關(guān)基因的治療可能有助于降低卒中的發(fā)生及其不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)，是潛在的干預(yù)卒中發(fā)生和發(fā)展的新治療方法。

【點(diǎn)睛】TET2基因突變相關(guān)CHIP可能通過(guò)炎癥通路增加卒中風(fēng)險(xiǎn)，可能成為未來(lái)預(yù)防和治療卒中的靶點(diǎn)。