張冬雪，鄒偉

卒中是全球公共健康的高危疾病之一，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率等特點，據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增卒中患者約1500萬，是世界第2大致死和第3大致殘疾病。其中缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是卒中的主要亞型，主要由腦大動脈閉塞導(dǎo)致的局灶性腦缺血引起，占所有卒中的80%左右[1-2]。對于IS的治療，及時的血液再灌注，包括使用tPA進行超早期靜脈溶栓或手術(shù)機械取栓治療，是最直接有效的療法[3]。但相關(guān)研究顯示，tPA在血管內(nèi)的溶栓作用是有益的，在腦實質(zhì)內(nèi)（非溶栓作用）是有害的，且tPA治療時間窗窄，僅有4.5 h，禁忌證較多，治療后有發(fā)生腦出血的風(fēng)險，多數(shù)患者因錯過最佳治療時機，出現(xiàn)不同程度的后遺癥[4]。找到高效又安全的療法成為IS研究亟待解決的問題。近年來，外泌體因其獨特的細胞間交流、靶向運輸、內(nèi)容物加工等特性受到廣泛關(guān)注[5]，且外泌體內(nèi)的微小核糖核酸（microRNA，miRNA/miR）作為IS的新型標志物，可促進血管生成和神經(jīng)發(fā)生，抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。深入研究外泌體對IS后繼發(fā)性神經(jīng)損傷的作用有助于該病的早期診斷、治療及預(yù)后[6-7]。本文主要介紹外泌體對IS的作用機制、防治價值以及干細胞源性外泌體的相關(guān)治療作用，以期為該病的治療和科學(xué)研究提供借鑒。

1 外泌體概述

外泌體是一種直徑為30～150 nm的特殊細胞外囊泡[8]，1983年被首次發(fā)現(xiàn)[9]，1987年被正式命名為“外泌體”[10]。在研究初期，人們發(fā)現(xiàn)外泌體可清除細胞內(nèi)某些無用的RNA片段與質(zhì)膜，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體充當(dāng)細胞“清潔工”角色，用于給細胞減負[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，外泌體可運載蛋白質(zhì)、膽固醇、DNA、RNA（mRNA、非編碼RNA、miRNA）等物質(zhì)，并通過質(zhì)膜融合和受體-配體識別完成細胞間信號交流與傳導(dǎo)[12]。尤其是其所含的RNA，對受體細胞有重要的調(diào)控作用[13]，其中miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）結(jié)合來阻斷mRNA的轉(zhuǎn)錄，增加mRNA穩(wěn)定性，抑制翻譯和表觀遺傳變化，進而調(diào)控基因表達[14]。同時外泌體可將miRNA分子遠距離平移轉(zhuǎn)載至受體細胞，實現(xiàn)了細胞間高效信息交流和靶向運輸[15]。此外，外泌體小而無毒，其外膜為脂質(zhì)層結(jié)構(gòu)，可以很容易地穿過血腦屏障而不引起免疫反應(yīng)[16]，而不同源細胞的外泌體表面都攜有特殊蛋白（如CD9、CD63）、熱休克蛋白、參與膜融合與運輸?shù)牡鞍祝ㄈ鏕TP酶、附件蛋白）和凋亡誘導(dǎo)因子相互作用蛋白（apoptosis inducing factor interacting protein X，Alix）、腫瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，tsg101）等相似的保守蛋白，外膜富含神經(jīng)酰胺和甘油磷脂，提高了對靶細胞的親和性，便于被識別和分離純化，也保證了外泌體廣泛存在于生物體體液中不被降解，發(fā)揮穩(wěn)定性作用[17]。正是這些特性，為外泌體治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了有力的基礎(chǔ)理論支撐，使其成為介導(dǎo)腦損傷后特異性生物標志、靶向藥物運輸和神經(jīng)元再生的理想選擇，為外泌體治療IS的進一步研究和臨床應(yīng)用提供了可能[18]。

2 外泌體與缺血性卒中

IS是臨床最常見的腦血管病之一，其繼發(fā)的腦損傷機制極為復(fù)雜，但多與缺血灶擴張導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元壞死、血管損傷和細胞凋亡等機制有關(guān)。研究證實，外泌體作為細胞間物質(zhì)和信息的“傳遞員”，參與調(diào)控各種生理、病理過程，并可通過抑制以上損傷，延緩病理進程[6-7]。此外，在不同病理狀態(tài)下細胞分泌的外泌體有各自的特征性作用，當(dāng)腦組織缺血缺氧時，多個miRNA表達水平均發(fā)生變化，并在不同區(qū)域和時間上差異明顯，可利用這些差異對比，尋找生物標志物，發(fā)掘外泌體對IS的防治價值[19]。

2.1 外泌體對缺血性卒中的作用機制

2.1.1 抑制炎癥反應(yīng) 免疫炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致卒中后繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一。其中小膠質(zhì)細胞是先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的固有免疫細胞，被認為是對急性腦損傷（包括腦梗死）做出反應(yīng)的第1個非神經(jīng)細胞[20]。急性腦損傷后，炎癥反應(yīng)立即觸發(fā)，小膠質(zhì)細胞被過度活化并表現(xiàn)為M1（促炎）和M2（抗炎）兩種類型[21]。因而調(diào)控小膠質(zhì)細胞的極化可作為抑制IS后腦損傷的治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦損傷后，損傷區(qū)域內(nèi)星形膠質(zhì)細胞外泌體miR-873a-5p表達增加，介導(dǎo)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B，NF-kB）信號通路和小膠質(zhì)細胞的M1活化被抑制，促進M2型標志物精氨酸酶1（arginase 1，ARG1）、IL-4、IL-10表達，增強抗炎作用[22]。黃山[23]發(fā)現(xiàn)，小鼠重復(fù)創(chuàng)傷性腦損傷（repetitive traumatic brain injury，rTBI）后，小膠質(zhì)細胞外泌體miRNA-124-3p表達增加，調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-蛋白激酶B（mammalian target of rapamycin-protein kinase B，mTORAkt）信號通路，促進小膠質(zhì)細胞從M1型向M2型極化的轉(zhuǎn)變，抑制rTBI后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。同時M2型小膠質(zhì)細胞外泌體miR-124被神經(jīng)元吸收，抑制其下游泛素特異性蛋白酶14（ubiquitin-specific protease 14，USP14）表達，降低實驗小鼠的腦梗死面積，促進神經(jīng)功能恢復(fù)[24]。

2.1.2 促進神經(jīng)元再生與突觸重塑 由于腦組織對缺血缺氧的耐受性極差，當(dāng)腦血管破裂或相應(yīng)供血動脈阻塞后，大腦神經(jīng)元很快發(fā)生不可逆性損傷甚至壞死。研究表明外泌體miRNA可調(diào)控神經(jīng)軸突的增殖和分化，促進神經(jīng)元再生與突觸重塑[25-26]。Meng等[25]通過雙熒光素酶報告分析證實，細胞癌基因c-Fos為miR-181c的靶基因，IS后外泌體miR-181c表達下調(diào)，c-Fos基因表達增加，同時激活活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和活化T細胞核因子c1（nuclear factor of activated T-cells cytplasmic 1，NFATc1）等下游基因，提高腦組織對缺血缺氧損傷的耐受性，進而保護神經(jīng)元細胞。在體外實驗中，E盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，Zeb2）/軸抑制蛋白（axis inhibition protein 2，Axin2）可刺激內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，誘導(dǎo)卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)，在大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中，富含Zeb2/Axin2的外泌體可下調(diào)性別決定區(qū)盒基因10（sex determining region Y-box 10，SOX10）、內(nèi)皮素-3和Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）表達，增強神經(jīng)干細胞的增殖和分化，促進腦室下區(qū)、海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元再生以及神經(jīng)生長因子表達上調(diào)，改善MCAO大鼠神經(jīng)可塑性，而在缺血邊界區(qū)，富含Zeb2/Axin2的外泌體可逆轉(zhuǎn)缺血損傷引起的軸突缺失，促進突觸重塑和增殖[26]。

2.1.3 促進血管新生 IS發(fā)生后，局部血供破壞，腦組織缺血乏氧，導(dǎo)致血管通透性改變等一系列連鎖反應(yīng)，加重腦組織損傷。內(nèi)皮細胞來源于內(nèi)皮祖細胞，是構(gòu)成血管系統(tǒng)的基本單位，內(nèi)皮細胞的增殖和分化是血管生成的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死模型建立12 h后，梗死區(qū)域內(nèi)內(nèi)皮細胞開始增殖，3 d后缺血半暗帶區(qū)域血管密度增加，循環(huán)內(nèi)皮祖細胞釋放的外泌體miR-296轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)皮細胞，促進血管生成[27-28]。此外，內(nèi)皮細胞外泌體miR-210是促進血管生成和神經(jīng)生成的關(guān)鍵因子，與局部血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平升高相關(guān)，miR-210的上調(diào)是內(nèi)皮細胞對缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵反饋，可直接影響內(nèi)皮細胞生存、遷移和分化[29]。實驗證實，在缺氧條件下，miR-210表達增加，促進內(nèi)皮細胞增殖和血管新生，提示miR-210可能是IS治療的潛在靶點[30]。而在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）模型中，miR-17-92富集的外泌體可顯著改善大鼠感覺、運動功能，促進內(nèi)源性血管新生[31]。

2.1.4 抑制細胞凋亡 研究表明，細胞凋亡廣泛參與IS的發(fā)病機制，來自不同細胞的外泌體可抑制缺血模型中的細胞凋亡和神經(jīng)元死亡，在IS病程中具有明顯的神經(jīng)保護潛能[32]。Deng等[33]發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白2（lipocalin 2，LCN2）表達增高可介導(dǎo)神經(jīng)元死亡和腦損傷，而外泌體miR-138-5p是LCN2的負調(diào)控因子，在氧-葡萄糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞中，過表達的miR-138-5p可通過抑制LCN2表達下調(diào)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease 3，caspase-3）和B細胞淋巴瘤/白血病2基因相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma/leukemia 2 gene associated X protein，Bax）的水平，上調(diào)Bcl-2水平，抑制星形膠質(zhì)細胞的凋亡，減少缺血后的神經(jīng)元損傷。此外，在缺血模型中，外泌體miR-22-3p能結(jié)合并抑制賴氨酸特異性去甲基化酶6B（lysine-specific demethylase 6B，KDM6B）表達，并通過KDM6B/骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/Bcl-2修飾因子（Bcl-2 modifying factor，BMF）軸發(fā)揮抗凋亡作用[34]。內(nèi)皮細胞來源的外泌體可抑制caspase-3、Bax的表達水平，上調(diào)Bcl-2的表達水平，保護神經(jīng)細胞免受缺血再灌注損傷[35]。

2.2 外泌體對缺血性卒中的防治價值

2.2.1 早期診斷 臨床過程中，在卒中溶栓時間窗內(nèi)區(qū)分TIA和IS極為困難，早期診斷對疾病的治療和預(yù)后尤為重要。Ji等[36]發(fā)現(xiàn)，急性期IS患者血清外泌體miR-9和miR-12水平明顯高于健康人，且與卒中評分和血清IL-6含量呈正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.7126、0.6825和0.6980、0.6550，提示外泌體miR-9和miR-12是急性期IS診斷和嚴重程度評估的潛在標志物。Li等[37]檢測不同缺血時長大鼠腦脊液和血漿中趨勢一致的外泌體miRNA含量，結(jié)果顯示，缺血10 min大鼠血漿外泌體rno-miR-122-5p水平較其他組明顯下調(diào)，缺血5 min大鼠血漿外泌體rno-miR-300-3p水平顯著高于其余各組，且血漿和腦脊液中這些miRNA的水平是相關(guān)的，提示外泌體rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p可能是TIA血源性的生物標志物。除此之外，血漿miR-21-5p、miR-30a-5p和miR-223等對IS的診斷也有重要價值[38-39]。

2.2.2 臨床分期 Li等[40]采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse trans-criptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測55例IS患者和25名健康對照者血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p的水平，通過構(gòu)建ROC曲線評估m(xù)iR在IS分期中的診斷準確性，結(jié)果顯示，與健康對照組相比較時，亞急性期兩種miRNA的AUC分別為0.971和0.889；急性期AUC分別為0.769和0.423；在急性期與亞急性期表達比較時，miR-422a的AUC為0.957，miR-125b-2-3p的AUC為0.769。可見血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p可作為IS患者的血液生物標志物，其中miR-422a的診斷價值更高，這兩種miRNA的聯(lián)合使用可能是確定急性與亞急性IS分期的有力手段。

2.2.3 靶向治療 研究顯示，基因靶向治療是治療IS的理想療法，外泌體含有源代細胞的特異性miRNA，是體內(nèi)基因靶向運輸?shù)奶烊惠d體[41]。Gherardini等[42]發(fā)現(xiàn)，卒中后星形膠質(zhì)細胞增生產(chǎn)生的硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sul-fate proteoglycan，CSPG）可抑制神經(jīng)元軸突再生。在MCAO大鼠模型中，皮質(zhì)神經(jīng)元miR-17-92過表達簇富集的外泌體可靶向抑制磷酸酶和張力素同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因的表達，增加PTEN下游蛋白的磷酸化，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長與缺血邊界區(qū)的神經(jīng)突觸重塑，改善神經(jīng)功能，克服了CSPG的抑制作用[43]。在小鼠腦缺血再灌注實驗中，外泌體miR-451a可以靶向抑制Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Ras related c3 botulinum toxin substrate 1，Rac1），減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，提高缺血再灌注后神經(jīng)細胞的存活率[44]。

2.2.4 預(yù)后評估 Wang等[45]通過臨床高通量測序篩選分析卒中患者血清外泌體中的獨特miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-328-3p上調(diào)時會加重腦缺血再灌注損傷，證明miR-328-3p對IS的短期預(yù)后具有重要的預(yù)測作用。在急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者血液中，外泌體miR-134表達量顯著高于健康對照組，且高表達的外泌體miR-134水平與患者NIHSS評分、梗死體積、IL-6和血漿hs-CRP含量呈正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.6079、0.7841、0.6936和0.6207，在預(yù)后較差的卒中患者中miR-134峰度較高（mRS＞2分），提示外泌體miR-134可能是區(qū)分AIS與非卒中的關(guān)鍵因素，是評估AIS預(yù)后的新型標志物[46]。

3 干細胞源性外泌體對缺血性卒中的治療作用

近年來，干細胞移植治療IS取得了較好的效果[47]，最初的目的是用干細胞替換丟失或損傷的組織，經(jīng)過不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，干細胞可通過分泌外泌體促進受損腦組織重塑和血管新生，恢復(fù)神經(jīng)功能，而無須考慮干細胞移植可能帶來的免疫排異反應(yīng)等不良反應(yīng)。其中，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）源性與神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSC）源性外泌體研究最為廣泛。

3.1 間充質(zhì)干細胞源性外泌體 目前已知可分泌外泌體的細胞類型中，MSC是最高產(chǎn)的一類細胞，在動物疾病模型中，MSC源性外泌體（MSC-exos）具有治療作用并表現(xiàn)出免疫抑制活性，且其質(zhì)量和數(shù)量不會因MSC永生化而打折扣[48]。研究表明，MSC移植作為IS的輔助治療方法，其作用僅次于溶栓治療[49]，然而MSC并沒有被整合到原有的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，而是通過釋放外泌體間接改善腦神經(jīng)損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)再生。Shabbir等[50]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)化的MSC-exos可促進成纖維細胞增殖和遷移，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞管狀分化，同時激活A(yù)kt、ERK和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等多條信號通路，誘導(dǎo)多種生長因子（如神經(jīng)生長因子）表達增加，促進血管愈合與新生，且內(nèi)皮細胞和新生血管數(shù)量與MSC-exos的濃度有明顯的劑量依賴性，進一步證實MSC-exos在IS治療中的重要作用。

3.2 神經(jīng)干細胞源性外泌體 既往研究證實，NSC是僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)的特殊類型的干細胞，可塑性極強，可直接分化為神經(jīng)元，具有補償內(nèi)源性神經(jīng)細胞不足和改善細胞生存炎癥微環(huán)境的能力[51]?；谂杂^者效應(yīng)（如神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)），NSC源性外泌體（NSC-exos）可克服細胞移植治療中的免疫反應(yīng)或排異等風(fēng)險，被成功內(nèi)吞入細胞內(nèi)[52]，減少大鼠神經(jīng)元凋亡，抑制小膠質(zhì)細胞激活和神經(jīng)炎癥[53]。因此，作為神經(jīng)系統(tǒng)的天然種子資源，且NSC的無細胞治療是一種新的治療策略，NSC-exos在IS治療中發(fā)揮著重要作用[54]。研究表明，NSC-exos含有與神經(jīng)再生、神經(jīng)保護和神經(jīng)可塑性相關(guān)的miRNA和蛋白，并可作為獨立的代謝單位，改變環(huán)境中關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，影響周圍細胞的生理功能，抑制IS后腦組織水腫，保持腦白質(zhì)的完整性[55]。同時NSC還可以被干擾素γ正向誘導(dǎo)，產(chǎn)生變異外泌體，增強NSC-exos促細胞增殖和抗凋亡作用，突出了NSC-exos的重要作用和巨大前景[56]。

4 不足與展望

當(dāng)前，改善腦組織的缺血再灌注損傷仍然是IS治療的重點和難點，外泌體能夠穿越血腦屏障，且自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐受性強，具有攜帶、運輸特異性“貨物”，完成細胞間信息傳遞和靶向運輸?shù)淖饔茫瑔l(fā)了外泌體載藥療法的發(fā)展，推動了IS治療方法的多樣化。但外泌體研究尚處于初級階段，仍有不足之處：①在現(xiàn)有的外泌體治療IS的研究中，多以觀察性實驗為主，如何調(diào)控外泌體的釋放和內(nèi)容物的“分揀”，以及外泌體在大腦中的遷移和歸巢能力仍未被研究。②由于外泌體體積極小、定量方式不一，難以進行嚴格的分離、純化和計算給藥劑量。③臨床中靶向能力不足、體內(nèi)半衰期短、有效載荷不足等弊端也限制了外泌體載藥療法的應(yīng)用。④是否有哪些因子或通路在卒中后介導(dǎo)或激發(fā)相關(guān)細胞釋放外泌體，以及如何誘導(dǎo)、修飾外泌體，增強其正向作用，仍然是外泌體研究的熱點。因此，在接下來的研究中，應(yīng)在現(xiàn)有的理論和機制研究基礎(chǔ)上，針對以上問題進行深入探索與研究。

綜上所述，外泌體通過參與IS的病理過程發(fā)揮作用，是調(diào)節(jié)IS后繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)。雖然目前外泌體在IS領(lǐng)域的相關(guān)研究還不完善，但其發(fā)現(xiàn)對于提高IS后神經(jīng)細胞存活率和改善患者預(yù)后具有重要作用。進一步探討外泌體的作用與轉(zhuǎn)歸，探析其治療靶點及調(diào)控機制，對于防治IS后繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷具有長遠的臨床意義。

【點睛】腦組織缺血再灌注損傷是IS治療的重點和難點，外泌體及其內(nèi)含的microRNA作為IS的新型標志物，可促進血管生成和神經(jīng)發(fā)生，抑制炎癥反應(yīng)與細胞凋亡，對IS的早期診斷、治療及預(yù)后具有積極作用。