CAR-T細胞免疫療法的研究進展

鄭乃溶 徐建青

（復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032）

嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法通過對人體T細胞進行工程化改造，使T細胞可以特異性靶向清除腫瘤細胞，從而達到精準(zhǔn)治療癌癥的目的。目前CAR-T免疫療法尚不完善，在臨床治療上仍存在許多問題，如對腫瘤識別特異性不強、安全性不高、CAR-T在體內(nèi)的持久性較差等。研究人員對CAR-T進行了改良，以達到在臨床應(yīng)用中更安全、抗腫瘤效果更好的目標(biāo)。本文主要對CAR-T面臨的挑戰(zhàn)和優(yōu)化策略作一綜述。

CAR-T發(fā)展進程CAR-T免疫療法中CAR的設(shè)計是關(guān)鍵，CAR是融合了可以特異性識別抗原的單克隆抗體的單鏈可變片段（single-chain variable fragments，scFvs），包含可變重鏈區(qū)（variable heavy，VH）和可變輕鏈區(qū)（variable light，VL）與T細胞受體（T cell receptor，TCR）的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，且表達CAR的T細胞不受MHC限制。目前CAR已經(jīng)發(fā)展到第四代。第一代CAR的scFv只整合了CD3ζ信號域，可以引發(fā)腫瘤特異性細胞毒性［1］。部分第一代CAR-T細胞顯示出長期持久性［2］，但是擴增有限且不能誘導(dǎo)有意義的抗腫瘤作用［3］。第二代、第三代CAR在CD3ζ上游整合了1個或2個共刺激性結(jié)構(gòu)域（通常是CD28或4-1BB），賦予了T細胞更有效的抗腫瘤細胞作用，同時增加細胞因子的產(chǎn)生，并改善了CAR-T細胞的增殖和持久性［4-5］。第四代CAR也被稱為“裝甲CAR”。裝甲，即賦予CAR-T一個裝備，使其更強大。在第二代、第三代CAR基礎(chǔ)上又整合了其他刺激性結(jié)構(gòu)域，共表達一些關(guān)鍵的細胞因子或共刺激配體，旨在修飾腫瘤微環(huán) 境，如 炎 性 細 胞 因子IL-12［6］、IL-18［7］或CD40L［8］分泌，以增強抗原交叉呈遞并促進表位擴散?？v觀這四代CAR，第一代抗腫瘤作用弱，第三、四代雖然T細胞對腫瘤殺傷能力增強但給機體帶來的毒副作用也隨之增加，相較第三、四代而言，第二代CAR相對溫和，在腫瘤治療中應(yīng)用更廣泛。

CAR-T細胞療法面臨的挑戰(zhàn)當(dāng)前CAR-T免疫療法尚未被廣泛應(yīng)用是因為面臨三重挑戰(zhàn)。

挑戰(zhàn)一：克服CAR-T脫靶問題，提升特異識別能力。CAR-T細胞只有對腫瘤表面抗原進行特異性識別，才能確保其僅攻擊腫瘤細胞而不對正常組織造成損傷。然而，多項研究表明腫瘤會通過下調(diào)或丟失表面抗原來逃逸免疫系統(tǒng)識別，如用靶向CD19的CAR-T去治療B細胞淋巴瘤后，高達60%的復(fù)發(fā)以CD19抗原丟失為特征。其中可能的原因是，CD19外顯子2～5中發(fā)生基因突變，導(dǎo)致CD19蛋白丟失而無法被CAR-T識別［9］。在實體瘤中，因異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境使得CAR-T一方面很難找到特異性強、安全性高且不易脫靶的治療靶點，另一方面腫瘤會被腫瘤微環(huán)境保護而免受CAR-T細胞攻擊［10］，這些均導(dǎo)致CAR-T在實體瘤中的應(yīng)用更為艱難。

挑戰(zhàn)二：確保CAR-T應(yīng)用的安全性。安全性是應(yīng)用CAR-T技術(shù)的前提條件。在表達CD19 CARs的患者T細胞治療中觀察到明顯的毒性，如細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）。CRS的發(fā)生與巨噬細胞密不可分，巨噬細胞是炎性細胞因子的主要來源（如IL-6、IL-1和IFN-γ），同時可能參與內(nèi)分泌和自我擴增的兒茶酚胺環(huán)，這些環(huán)路可直接激活CRS期間巨噬細胞的產(chǎn)生和細胞因子的釋放［11］。最近研究揭示了CAR-T療法中CRS的發(fā)生機制，CAR-T識別靶細胞后會釋放穿孔素和顆粒酶B，激活caspase3-GSDME途徑導(dǎo)致細胞焦亡而發(fā)生CRS［12］。焦亡的細胞會刺激巨噬細胞激活caspase1-GSDMD產(chǎn)生IL-6和IL-1β，從而引發(fā)CRS。該團隊還提出，與CAR-T靶向后的細胞不同，被天然T細胞靶向的細胞會經(jīng)歷凋亡途徑而非焦亡?？赡茉蛴卸皇荂AR-T細胞釋放的穿孔素/顆粒酶B比天然T細胞更多且親和力更高；二是天然T細胞只誘導(dǎo)少量GSDME裂解而不會激活GSDMD［12］。機制的闡明可為CART療法的優(yōu)化提供新方向。

挑戰(zhàn)三：維持CAR-T細胞在體內(nèi)的持久力。在慢性感染或癌癥中，長期的抗原刺激會導(dǎo)致T細胞耗竭狀，表現(xiàn)為表面表達多種抑制性受體，包括PD-1、TIM-3和LAG-3等，這些耗竭的T細胞增殖能力差、效應(yīng)功能低［13］。臨床前和臨床上有充分的證據(jù)表明CAR-T同樣容易發(fā)生耗竭而限制療效。在無反應(yīng)者中，腫瘤浸潤性CD19 CAR-T上的典型耗竭標(biāo)志物比表現(xiàn)出完全應(yīng)答的正常人更高［14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun的功能缺陷是T細胞耗竭的關(guān)鍵所在，c-Jun是調(diào)節(jié)細胞蛋白質(zhì)水平的主要基因，其缺陷會導(dǎo)致抑制T細胞活性的蛋白質(zhì)增加［15］。如何增強CAR-T在體內(nèi)的持久性，有效提高CART的抗腫瘤效力是CAR-T技術(shù)目前面臨的問題之一。

CAR-T技術(shù)的優(yōu)化與改良

增強CAR靶向特異性 針對陰性抗原癌細胞的逃逸，對scFv進行優(yōu)化，通常將其設(shè)計為靶向兩種抗原，其結(jié)合任一抗原都會觸發(fā)CAR-T的激活。其中，一類是將編碼不同CAR的兩個載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)至單個T細胞［16］，或是構(gòu)建一個雙順反子載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進細胞中，使每個細胞上表達兩個單獨的嵌合受體［17］；另一類是使用串聯(lián)雙特異性CAR，胞外部分的兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域任一對抗原識別即可觸發(fā)效應(yīng)子功能。使用雙特異性CD20/CD19 CAR-T可治療復(fù)發(fā)B細胞惡性腫瘤患者，Ⅰ期臨床結(jié)果顯示在治療28天后總緩解率達到82%，同時發(fā)現(xiàn)輸注非低溫保存的雙特異性CD20/CD19 CAR-T效果更優(yōu)，接受最高劑量且非低溫保存的患者其28天總緩解率可高達100%，這又為CAR-T提出了一種可能性［18］。另有研究通過分泌由兩個融合的scFv組成的雙特異性T細胞接合劑（bispecific T-cell engager，BiTE）來促進內(nèi)源性非工程T細胞與腫瘤細胞的接合。Choi等［19］設(shè)計了一種可分泌EGFR/CD3 BiTE的、靶向EGFR-Ⅷ的CAR-T細胞來清除膠質(zhì)母細胞瘤，已在小鼠模型中得到證實，在治療3周后80%的小鼠表現(xiàn)出完全緩解，體內(nèi)無腫瘤存在。這些很好地解決了膠質(zhì)母細胞瘤由于異質(zhì)性而難以被完全靶向清除的問題。

除scFv的優(yōu)化，對胞外區(qū)也進行了改良。與傳統(tǒng)CAR-T直接作用于靶細胞不同，研究人員提出了一個新的概念：模塊化的CAR-T（modular CART，modCAR-T）。這類CAR-T通常與其銜接子共同作用，銜接子一端與CAR-T結(jié)合，另一端用于識別并結(jié)合腫瘤表面抗原。如此，既可以增加對抗原識別的特異性以減少腫瘤逃逸可能，又可以通過操縱銜接子來控制T細胞的激活狀態(tài)，達到雙重效果。CAR銜接子可以是單克隆抗體、抗體片段、小分子或任何能夠靶向至少一種所需抗原并可以被mod CAR-T細胞同時識別的結(jié)構(gòu)［20］。各種藥物的臨床試驗正在進行中，2020年Arndt等［21］的一篇綜述對其進行了詳細說明。

布爾邏輯門也已被CAR-T用于多種抗原的組合檢測，有效靶向腫瘤的同時減少脫靶毒性，提高抗腫瘤功效。AND門邏輯需要兩種不同抗原同時存在來激活CAR-T細胞，從而降低脫靶識別或發(fā)生脫靶毒性的風(fēng)險，能夠防止表達與腫瘤細胞相同抗原的健康組織遭受攻擊。人工合成的Notch（synthetic Notch，synNotch）受體識別細胞表面配體后能觸發(fā)誘導(dǎo)的靶基因表達，它識別腫瘤相關(guān)因子（tumor-associated antigen，TAA）并誘導(dǎo)CAR的表達，CAR可識別第2個TAA使T細胞活化［22］。2018年報道了一種SUPRA CAR系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過表達多種受體來對工程化T細胞中的各種布爾邏輯門進行編程，每種受體具有通過亮氨酸拉鏈二聚化重建的多個潛在的銜接蛋白伴侶。這樣的系統(tǒng)支持通過使用AND或AND-NOT門來提高特異性，同時通過不同的銜接蛋白靶向多種抗原以克服腫瘤異質(zhì)性，還可通過調(diào)節(jié)銜接子來調(diào)控CAR-T活性以保障安全性［23］。這種策略一旦被臨床證明可行，必將會減少CAR-T的治療成本。最近的一項研究設(shè)計了執(zhí)行AND、NOT、OR布爾邏輯運算的共定位依賴蛋白開關(guān)（Co-LOCKR），當(dāng)滿足所有條件時，這些開關(guān)才會通過構(gòu)象變化激活。該策略通過AND門來重定向T細胞對表達兩種表面抗原的腫瘤細胞的特異性識別，以避免識別單抗原細胞發(fā)生脫靶，又通過添加NOT或OR邏輯以避免或包括表達第3種抗原的細胞。該方法的優(yōu)勢在于可以通過Co-LOCKR使多個抗原信號最終整合為同一個輸出信號來達到通用的目的［24］，不過目前僅在體外證明了該方法的精準(zhǔn)靶向潛力，應(yīng)用于臨床仍面臨各種挑戰(zhàn)。

增強CAR-T療法安全性 目前可以通過降低CAR-T劑量以及使用類固醇療法或阻斷IL-6R的抗體來治療CRS。Tocilizumab于2017年8月被FDA批準(zhǔn)用于治療CAR-T免疫療法后發(fā)生的CRS，效果顯著。Staedtke等［25］的研究表明兒茶酚胺阻斷劑可抑制巨噬細胞釋放炎癥因子。根據(jù)對CAR-T引發(fā)CRS的最新機制研究，推測同時阻斷兒茶酚胺和GSDME或許有更好的效果［12］。常規(guī)的CAR-T細胞組成性表達CAR，能夠在抗原刺激后發(fā)出信號，這種持續(xù)激活的狀態(tài)容易引發(fā)細胞因子風(fēng)暴。當(dāng)前方法主要集中在條件性調(diào)節(jié)CAR-T的激活狀態(tài)或在CAR-T發(fā)揮作用后對其及時清除，避免CAR-T長時間駐留體內(nèi)引發(fā)細胞因子風(fēng)暴。

首先是利用基于四環(huán)素的基因表達控制系統(tǒng)來條件性誘導(dǎo)CAR基因表達。一項研究通過引入Tet-ON 3G系統(tǒng)，誘導(dǎo)針對肝細胞癌腫瘤相關(guān)抗原CD147的CAR表達。小分子強力霉素（Dox）充當(dāng)“ON開關(guān)”，在Dox存在的情況下，逆四環(huán)素反式激活蛋白誘導(dǎo)CD147-CAR表達，CD147-CAR的表達和活性在體外和體內(nèi)都受到Dox的控制，且體內(nèi)研究表明通過多次腫瘤內(nèi)給藥，（Dox+）Tet-CD147 CAR-T顯著抑制裸鼠的腫瘤生長［26］。相反，在Tet-OFF系統(tǒng)中，Dox通過取消四環(huán)素反式激活劑激活CAR轉(zhuǎn)錄的能力而充當(dāng)“OFF開關(guān)”。該系統(tǒng)被用于可逆地抑制CD5 CAR-T中有害的CAR信號和T細胞殺傷劑［27］。最近提出了一種新的方法，其不依賴轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的控制機制，而是使用基因組編輯通過破壞新陳代謝的關(guān)鍵基因來創(chuàng)造營養(yǎng)缺陷型。該研究敲除了T細胞和干細胞中的尿苷單磷酸合成酶基因，使細胞增殖依賴于外部尿苷，在體外和體內(nèi)的異種移植模型中都能通過調(diào)節(jié)尿苷供應(yīng)來控制細胞生長［28］。復(fù)旦大學(xué)徐建青團隊針對腫瘤微環(huán)境低氧的特征，設(shè)計了一種缺氧誘導(dǎo)型CAR（HiCAR），該CAR-T受缺氧反應(yīng)元件驅(qū)動，包含氧依賴性降解域，其在常氧下發(fā)生降解，缺氧狀態(tài)下穩(wěn)定，這一特性不僅增強了缺氧條件下其對腫瘤細胞的毒性，同時保障了安全性［29］。

還有一些研究致力于通過使用小分子藥物誘導(dǎo)自殺基因表達來實現(xiàn)CAR-T的“自殺”途徑。在CAR-T中表達誘導(dǎo)型胱天蛋白酶9（induced caspase 9，iCasp9）自殺基因，小分子AP1903可以激活caspase 9使細胞凋亡［30］。最近該方法用于漿細胞惡性多發(fā)性骨髓瘤的治療研究中，表達抗SLAMF7 CAR和自殺基因的T細胞在體外特異性識別SLAMF7，消除了小鼠體內(nèi)的腫瘤［31］。使用二聚劑AP1903可按需消除表達該構(gòu)建體的T細胞，保證安全性，臨床上將繼續(xù)測試其可行性。

增強CAR-T細胞的持久性 一名78歲的慢性淋巴細胞白血病患者病情在輸注CAR-T后得到深度緩解，這是由單個CAR誘導(dǎo)的T細胞克隆大量擴增所致，該CAR-T單克隆特別之處在于其雙等位基因TET 2功能異常。由此獲得啟發(fā)，發(fā)現(xiàn)實驗性敲除TET 2可使CAR-T細胞效力、擴增能力、持久性和記憶樣表型均增強［32］，這一偶然發(fā)現(xiàn)為CAR-T之后的改進提供了思路。還有研究將CAR轉(zhuǎn)基因插入T細胞受體α恒定區(qū)（T-cell receptorα constant，TRAC）位點，并內(nèi)源性控制CAR表達，可防止臨床前白血病模型中的耗竭［33］。一種可循環(huán)的CAR通過突變CAR胞質(zhì)域中所有的賴氨酸來阻止泛素化的發(fā)生，從而使CAR蛋白不會被溶酶體降解，抑制CAR下調(diào)、增強CAR返回細胞表面的循環(huán)，最終促進CAR的持久性及持續(xù)抗腫瘤效力［34］。將CD3ε胞質(zhì)域摻入第二代CAR中可改善CAR-T細胞的抗腫瘤活性。CD3ε的免疫受體基于酪氨酸的 活 化 基 序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）單磷酸化會招募抑制性Csk激酶，減弱TCR信號，減少CAR-T細胞因子的產(chǎn)生，而CD3ε的基本殘基富集序列（basic residue rich sequence，BRS）則通過募集p85促進CAR-T的持久性［35］。以上方法尚停留在初期基礎(chǔ)研究階段，僅提供新的研究方向，未經(jīng)臨床試驗證明。

結(jié)語目前CAR-T細胞療法研究熱點主要集中在特異性、安全性及持久性這3個方面，這也是CAR-T療法走向臨床的前提條件。進一步探究平衡CAR-T療法的有效性與安全性之間的關(guān)系以及CAR-T細胞的貯存、運輸，是未來實現(xiàn)CAR-T廣泛應(yīng)用的前提。CAR-T免疫療法應(yīng)用前景十分廣闊，必將給人類腫瘤等疾病的治療帶來重大突破。

作者貢獻聲明鄭乃溶 文獻調(diào)研和整理，論文構(gòu)思和撰寫。徐建青 論文審校和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。