武海軍

山東省食品藥品審評查驗中心

陳少鵬*

濱州學院

肝素屬于自然界中生物合成的最復雜的一類糖胺聚糖分子，主要表現(xiàn)在分子結(jié)構(gòu)骨架的多變性和結(jié)構(gòu)骨架上取代基的多樣性，是迄今為止仍然不能被大規(guī)模人工合成或通過基因工程技術(shù)規(guī)?；磉_的一類復雜多糖分子。盡管肝素已臨床應用多年，但是科學界對肝素結(jié)構(gòu)與活性的研究仍然不夠明確，除了在抗凝、抗血栓領域具有相對比較成熟臨床應用之外，肝素還具有多種潛在的生物活性和臨床應用價值[1]。普通肝素作用于凝血因子 Ⅻa、Ⅺa、Ⅸa、Ⅹa 以及抗凝血酶Ⅲ等靶點，而低分子量肝素主要作用于凝血因子Ⅹa 和抗凝血酶Ⅲ等，代表藥物包括依諾肝素、那曲肝素鈣、達肝素鈉、汀肝素鈉和帕肝素鈉等[2]。

近年來，全球各國藥品監(jiān)管部門均提高了糖胺聚糖類多組分藥物的準入標準，同時強化了對已上市產(chǎn)品的全產(chǎn)業(yè)鏈監(jiān)管。低分子量肝素由于生產(chǎn)工藝的不同，包括依諾肝素鈉、那屈肝素鈣和達肝素鈉等不同通用名產(chǎn)品，但我國低分子量肝素市場還有一些品種尚不能完全按照國家藥典標準歸類到某一通用名或無法確定參比制劑。低分子量肝素屬于多組分藥物，其原料藥與注射劑生產(chǎn)工藝復雜，無菌要求嚴格，給產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量控制帶來較大的挑戰(zhàn)。近年來，我國肝素一致性評價工作的政策引導和監(jiān)督管理不斷加強。2021年8月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心組織制定了《低分子量肝素類仿制藥免疫原性研究指導原則（試行）》，低分子量肝素類仿制藥的開發(fā)及一致性評價標準與國際市場接軌。查閱國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心網(wǎng)站最新信息顯示，我國依諾肝素鈉注射液、那屈肝素鈣注射液、達肝素注射液通過一致性評價的生產(chǎn)企業(yè)分別有7家、3 家和1 家[3]。此外，仍有舒洛地特、汀肝素鈉、帕肝素鈉、貝米肝素、達那肝素等肝素產(chǎn)品尚未在我國上市或未實現(xiàn)國產(chǎn)化。本文參考國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（Center for Drug Evaluation，CDE）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA） 等機構(gòu)發(fā)布的技術(shù)指南要求，對目前低分子量肝素多組分藥物一致性評價技術(shù)要點進行詳細的技術(shù)總結(jié)，為相關單位開展低分子量肝素一致性評價及監(jiān)管部門開展技術(shù)審評和質(zhì)量監(jiān)管提供參考[4]。

1 低分子量肝素原料藥一致性研究

FDA 和EMA 針對低分子量肝素生物一致性評價研究出臺了相關規(guī)范，并且兩個機構(gòu)在技術(shù)層面的獲批標準大致相同，均要求低分子量肝素應與原研藥在結(jié)構(gòu)分析、免疫原性檢測、健康受試者的藥學特征等方面保持一致。近年來，我國也相繼發(fā)布了多項相關文件，不斷規(guī)范低分子量肝素原料藥一致性研究。本文針對相關技術(shù)指南、藥典、文獻等資料，對低分子量肝素的具體研究技術(shù)方案進行了介紹與解讀。

1.1 低分子量肝素原料藥理化性質(zhì)一致性

1.1.1 低分子量肝素原料相對平均分子量及分子量分布的一致性對比研究

低分子量肝素屬于多組分藥物，糖胺聚糖寡糖分子組分呈正態(tài)分布特點，利用分子排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC） 原理對低分子量肝素進行初步分離，采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法進行分析。根據(jù)相關文獻，需確保低分子量肝素分子量及分布符合國家藥典標準要求，標準區(qū)間內(nèi)各組分含量比率與原研保持一致，即按照分子量每500 道爾頓為一個區(qū)間進行含量百分率對比，以確保仿制的低分子量肝素與原研藥各分子量范圍區(qū)間內(nèi)寡糖含量無明顯差異。此外，關于原研藥的選購，通常要求涵蓋新生產(chǎn)和近效期至少6 批次的原研藥。

1.1.2 特征低分子量肝素寡糖鏈的糖鏈指紋圖譜一致性對比研究

目前，主要采用季銨鹽涂漬色譜柱，以提高不同分子量與電荷分布糖胺聚糖分子的分離效率，然而該方法也存在穩(wěn)定性差、重現(xiàn)性不高等問題，表現(xiàn)為不同色譜柱涂漬后分離變異系數(shù)大，同一色譜柱涂漬后樣品出峰時間飄移現(xiàn)象明顯等。根據(jù)分子排阻原理，采用高效分子排阻色譜 法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）檢測四糖、六糖、八糖、十糖等特征寡糖組分的百分含量則可以避免上述技術(shù)問題。為獲取更多寡糖片段結(jié)構(gòu)信息，進一步采用液質(zhì)聯(lián)用方法對上述寡糖組分進行進一步分離，并對分離所得寡糖分子進行分子量結(jié)構(gòu)解析，同時與原研藥進行對比研究[5]。

1.1.3 總寡糖組分一致性對比研究

針對總寡糖組分一致性對比研究，通常先采用紫外光譜法和紅外光譜法進行官能團鑒別，然后再采用核磁共振一維氫譜、核磁共振二維氫譜和核磁共振碳譜方法進行研究，其中應重點對特征信號峰的峰位移和峰強度進行對比研究，確保與原研藥保持一致[6]。

鈉含量和硫酸羧基比在一定程度上反映低分子量肝素硫酸基和羧基等取代基的密度，采用原子吸收光譜法和電位滴定法對低分子量肝素中的鈉含量和硫酸羧基比進行對比研究是開展總寡糖組分一致性對比研究的重要研究內(nèi)容。

1.2 肝素原料來源與降解方式的一致性

1.2.1 肝素原料來源的一致性對比研究

肝素應屬自然界中生物合成的最復雜的一類糖胺聚糖分子，不同物種和同一物種不同的組織部位合成的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)具有明顯差異，表現(xiàn)為分子量的差異、糖鏈骨架單元排布序列的差異和硫酸化度的差異等。因此，起始原料是影響低分子量肝素一致性的關鍵工藝參數(shù)之一。為確保肝素原料的一致性，目前從技術(shù)上主要采取兩種方式進行控制，一是采用實時熒光定量PCR 對粗品肝素進行基因檢測，根據(jù)粗品肝素中殘留的核酸進行擴增，以確定是否有其他物種來源的肝素造成污染。二是采用核磁共振氫譜技術(shù)測定去蛋白肝素或肝素鈉精品等中間體，根據(jù)特征高位移信號區(qū)的峰強度，通過建立警戒值，輔助判定肝素中間體是否含其他組織來源的肝素。

1.2.2 低分子量肝素降解方式的一致性對比研究

低分子量肝素通常采取β-消除降解、亞硝酸降解、過氧化氫降解等原理進行降解，其在糖鏈末端特征結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，例如依諾肝素鈉在降解過程中，在糖胺聚糖非還原末端存在特征雙鍵，在糖鏈的還原末端還會產(chǎn)生的具有1,6-脫水衍生物結(jié)構(gòu)，各國藥典均規(guī)定其含量占全部糖的15%～25%[5]。又如肝素酶法降解的汀肝素則只在糖鏈非還原末端存在特征雙鍵。目前，市面上主要通過紫外可見-分光光度法、肝素酶降解后的特征二糖分析、飛行時間質(zhì)譜法（MALDITOF）以及糖基結(jié)構(gòu)解析法等對降解方式一致性進行判定[7]。

1.3 二糖組成、寡糖序列以及低分子糖胺聚糖特征寡糖一致性

1.3.1 二糖組成一致性對比研究

目前，普遍采用肝素酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）聯(lián)合酶降解法將糖胺聚糖分子徹底降解為二糖分子，再采用強陰離子交換高效液相色譜（SAX-HPLC）對降解得到的二糖進行分離，并對比二糖標準品，對二糖組成與含量進行定性與定量研究，至少與三批次不同效期的原研藥降解后的二糖做對比研究，以評價原料藥在二糖組成方面的一致性。

1.3.2 低分子量肝素特征寡糖片段一致性對比研究

根據(jù)肝素酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）對糖胺聚糖分子酶切位點不同，采用一種酶進行定向酶切，所得寡糖片段分別通過SAX-HPLC或者反相高效液相色譜（reverse phasehigh-performance liquid chromatography，RPHPLC）法進行分離，進一步采用MALDI-TOF 對每一個寡糖分子峰進行結(jié)構(gòu)解析[7-8]。也有文獻曾報道采用亞硝酸降解，通過高效毛細管電泳法對寡糖片段進行解析，但該方法重現(xiàn)性不高，難以通過方法學驗證[9]。

1.3.3 四糖與六糖一致性對比研究

四糖與六糖屬于相對容易分離的寡糖分子，開展低分子量肝素四糖與六糖一致性研究可以一定程度反應一致性。采用分子排阻色譜法對糖胺聚糖組分進行粗分離得到四糖和六糖粗分離物，再采用強陰離子交換色譜法，對四糖和六糖粗分離物根據(jù)電荷密度不同進行進一步分離[10]，所得不同組分分別采用MALDI-TOF與核磁共振法對每一種四糖和六糖單體進行結(jié)構(gòu)確證[11]。

1.4 低分子量肝素生物活性的一致性

生物活性一致性是確保制劑體內(nèi)藥效學生物等效性試驗的關鍵，相關單位需參照《中國藥典》（2020年版）對低分子量肝素抗Ⅹa 活性和抗Ⅱa 活性進行檢測，以評估低分子量肝素在抗Ⅹa 和抗Ⅱa 活性上的一致性[12]。此外，據(jù)文獻報道，還可以采用活化部分凝血活酶時間（activeated partial thromboplasting time，APTT）法檢測原料藥活性，以評估低分子量肝素活化部分凝血活酶時間的一致性[13]。

2 低分子量肝素制劑一致性研究

2.1 低分子量肝素制劑體內(nèi)藥效動力學一致性

由于低分子量肝素屬于多組分糖胺聚糖，根據(jù)目前的技術(shù)研究水平，難以通過直接檢測糖胺聚糖化合物濃度判斷等效性。主要采用向健康受試者在空腹條件下以單劑量、雙向交叉試驗的形式皮下給藥，并根據(jù)方案定時采集血樣，離心取血漿測定血漿中抗F Ⅹa 和抗FⅡa 活性[14]。再根據(jù)相關數(shù)據(jù)完成血漿抗Ⅹa 活性與時間關系曲線圖、血漿抗FⅡa 活性與時間曲線圖，并計算所得受試制劑與原研藥抗Xa活性和抗FⅡa 活性幾何均值、比值，以評價體內(nèi)藥效動力學是否一致[15]。

2.2 低分子量肝素制劑免疫原性風險評估

臨床使用中，肝素與低分子量肝素經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)存在發(fā)生肝素誘導的血小板減少癥（HIT）的風險。這意味著針對低分子量肝素一致性評價，需要開展相關研究，以評估其引起潛在的HIT 風險。為規(guī)范低分子量肝素類產(chǎn)品的研究和開發(fā)，CDE 組織制定了《低分子量肝素類仿制藥免疫原性研究指導原則（試行）》[15]。參考上述技術(shù)指南，并結(jié)合FDA 注冊申報的依諾肝素鈉制劑免疫原性研究風險評估項目，筆者建議該系列低分子量肝素產(chǎn)品免疫原性技術(shù)研究概況可分如下幾部分開展。

2.2.1 低分子量肝素與血小板因子4 相互作用

血小板因子4（platelet factor 4，PF4）與低分子量肝素形成復合物的大小對肝素誘導的HIT 發(fā)病機制至關重要，有研究發(fā)現(xiàn)隨著PF4-低分子量肝素復合物摩爾比的增加，形成PF4-低分子量肝素復合物的大小隨之增加。而在PF4-低分子量肝素復合物形成過程中，其復合物大小、表面電荷及化學計量都具有至關重要的作用[16]。目前，可利用表面等離子共振技術(shù)研究低分子量肝素與PF4 親和作用或利用圓二色譜（circular dichroism，CD） 法研究依諾肝素鈉對PF4 二級結(jié)構(gòu)的影響。通過光子相關光譜（photon correlation spectroscopy，PCS）法和 Zeta 電位技術(shù)研究復合物大小與表面電荷。其他適用的方法還包括分子排阻色譜結(jié)合紫外光（SEC-UV）分析技術(shù)和分子排阻色譜結(jié)合多角度光散射（SEC-MALS）分析技術(shù)、超速離心、場流分離（field flow fractionation，F(xiàn)FF）和原子力顯微鏡技術(shù)等[17]。

2.2.2 雜質(zhì)風險評估

研究表明低分子量肝素中的雜質(zhì)可增強產(chǎn)品的免疫原性，雜質(zhì)的存在可能會改變低分子量肝素的識別、攝取、處理或呈現(xiàn)，以及改變與PF4 形成復合物的形態(tài)和大小，進而對免疫系統(tǒng)造成影響[18]。雜質(zhì)對免疫原性的影響取決于其在最終產(chǎn)品中的性質(zhì)和水平。因此，對低分子量肝素中雜質(zhì)的研究至關重要，應結(jié)合原料藥雜質(zhì)譜研究數(shù)據(jù)，從起始原料引入的雜質(zhì)、工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)三方面進行系統(tǒng)的雜質(zhì)風險評估，以證明產(chǎn)品免疫原性風險不高于原研藥。

肝素是動物結(jié)締組織中肥大細胞產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)復雜的糖胺聚糖分子，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類物質(zhì)等多種生物大分子共存。通過起始原料引入的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)、核酸、有關物質(zhì)、脂類物質(zhì)、重金屬等。蛋白質(zhì)、核酸和有關物質(zhì)三種雜質(zhì)可參照《中國藥典》（2020年版）相關方法和標準進行。重金屬限度檢測除參照《中國藥典》規(guī)定的檢查方法之外，還建議參照《歐洲藥典》要求，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法對重金屬進行分類風險評估。脂類物質(zhì)通常采用氣質(zhì)聯(lián)用方法，通過建立脂質(zhì)庫，然后根據(jù)分子量結(jié)果進行對比研究，從而確認脂質(zhì)譜和脂質(zhì)含量。工藝引入雜質(zhì)因產(chǎn)品工藝不同而存在較大差異，例如依諾肝素鈉主要研究的特征工藝雜質(zhì)包括氯化芐、苯甲醇、芐索氯銨鹽、游離硫酸鹽等。達肝素鈉和那屈肝素鈣研究的主要特征工藝雜質(zhì)包括亞硝酸鹽、亞硝胺、游離硫酸鹽等。低分子量肝素降解雜質(zhì)主要通過開展穩(wěn)定性研究，考察過程中分子量和游離硫酸鹽的變化進行評估。

綜上，根據(jù)目前的技術(shù)水平，低分子量肝素雜質(zhì)研究的策略主要從雜質(zhì)類別入手進行系統(tǒng)研究。此外，雜質(zhì)譜研究可作為開展低分子量肝素制劑免疫原性風險評估的主要依據(jù)。

2.2.3 體內(nèi)外免疫風險評估

通過適當?shù)捏w外和體內(nèi)實驗，證明仿制低分子量肝素和原研藥的免疫調(diào)節(jié)效應，可進一步補充關于免疫原性風險的研究。如采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測肝素誘導的血小板減少癥抗體IgG、IgA、IgM；血小板計數(shù)監(jiān)測：先測基礎血小板計數(shù)，每日皮下注射低分子量肝素，期間隔日測1 次，用藥2 周；功能性測試：低分子量肝素誘導血小板聚集試驗[19]。

3 針對低分子量肝素制劑一致性的常規(guī)研究

3.1 包裝材料相容性研究

對于低分子量肝素制劑包裝材料相容性研究建議可以參考《化學藥品注射劑與藥用玻璃包裝容器相容性研究技術(shù)指導原則（試行）》《化學藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導原則（試行）》《化學藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導原則（試行）》[20]等文件。主要針對低分子量肝素注射液預灌封注射器組合件中的玻璃針管、不銹鋼注射針、氯化丁基橡膠活塞、聚異戊二烯橡膠針頭護帽中的元素及有機物向低分子量肝素制劑中的遷移情況進行檢測研究，對包裝系統(tǒng)中可能遷移入藥物的金屬及非金屬元素與有機浸出物進行定量測定，并進行系統(tǒng)的方法學驗證試驗，最終結(jié)合上述研究數(shù)據(jù)與產(chǎn)品穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進行安全性評估[21]。

3.2 其他常規(guī)研究

針對低分子量肝素成品制劑，除進行免疫原性研究、藥效動力學研究和包裝材料相容性研究之外，還需開展常規(guī)的加速穩(wěn)定性研究、長期穩(wěn)定性研究、低溫凍融試驗、推桿推動力實驗等研究，以評估低分子量肝素制劑在常規(guī)儲存條件下和極端條件下產(chǎn)品的分子量、活性和游離硫酸鹽等有關物質(zhì)的變化情況，并與原研藥進行對比研究，以評估藥品的安全性和有效性[22]。

4 結(jié)語

由于低分子量肝素屬于結(jié)構(gòu)復雜的糖胺聚糖類多組分藥物，目前我國和美國按照化學藥品進行注冊管理，歐洲則按照生物制品進行注冊管理。低分子量肝素系列藥品存在諸多特性理化指標和生物活性指標，例如相對平均分子質(zhì)量及分子量分布、抗Ⅹa因子活性、抗FⅡa 因子活性等，批次之間存在一定的波動，且糖胺聚糖分子通常極性強、結(jié)構(gòu)復雜，即便結(jié)合多種分離技術(shù)和分析手段也難以較精細地表征其活性成分的全面一致性或相似性。由于分析技術(shù)的局限性意味著絕大多數(shù)低分子量肝素的多糖鏈可能無法表征。本文參考相關技術(shù)指南、藥典、文獻等資料，并結(jié)合低分子量肝素項目研發(fā)情況，對低分子量肝素一致性評價技術(shù)研究進展進行總結(jié)?？梢灶A見，隨著國內(nèi)外糖胺聚糖分離純化技術(shù)的提高，結(jié)構(gòu)確證手段的進步，特別是我國仿制藥一致性評價的推進，國產(chǎn)低分子量肝素在理化性質(zhì)一致性、生物活性一致性、體內(nèi)抗Ⅹa 因子與抗Ⅱa 活性一致性等方面會得到快速提升，將有助于提升我國肝素生產(chǎn)企業(yè)的國際競爭力和產(chǎn)業(yè)鏈控制力。