流行性腦脊髓膜炎的實驗室分子診斷研究進展

石剛 徐穎華 葉強

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）引起的一種急性呼吸道傳染?。?-2］。根據(jù)細菌表面莢膜多糖的不同，將Nm可分為12 個血清群，但絕大多數(shù)流腦病例是由A、B、C、W、X 和Y 血清群菌株所引起［3-4］。Nm經(jīng)呼吸道感染后臨床癥狀輕重懸殊，輕可表現(xiàn)為持續(xù)無癥狀帶菌狀態(tài)，而暴發(fā)型病情兇險，進展極其迅速，可在24 h 內(nèi)死亡［5］。研究發(fā)現(xiàn)10%～20%的存活者可能會有腦部損傷、失聰?shù)群筮z癥［6-7］。隨著近幾十年的腦膜炎球菌疫苗的廣泛使用，大幅度降低流腦發(fā)病率。但據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計報道，在2019年全世界仍有250 萬流腦病例，其中包括近20 萬死亡病例，嚴重影響人們生命健康［8］?？煽俊㈧`敏的實驗室診斷方法可為流腦臨床診斷和流行病學監(jiān)測研究提供可靠的手段和依據(jù)。隨著生物技術的發(fā)展，基于不同技術原理的快速分子檢測方法被開發(fā)和應用，顯著提高了不同層級實驗室Nm檢出率和靈敏度，并減少了診斷侵襲性腦膜炎球菌疾病所需的時間［7-8］。本文就目前國內(nèi)外流腦實驗室快速分子診斷的研究進展作一綜述，以期為后續(xù)流腦的預防和控制奠定一定基礎。

1 傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法作為細菌性腦膜炎實驗室診斷的金標準，是通過對疑似患者腦脊液（CerebroSpinal Fluid，CSF）進行細菌培養(yǎng)檢測，但檢測結(jié)果易受CSF 采集及運輸保存方式、疑似患者免疫狀態(tài)、以及是否服用過抗生素等因素影響，且檢測時間長、檢出率低、不利于疑似患者的快速診斷和治療，遠遠不能滿足目前的臨床診斷需要［9］。

2 快速檢測和分子檢測方法

2.1 快速檢測方法

研究人員應用抗A、W135、Y 和C 群Nm多糖的單克隆抗體，構(gòu)建雙重免疫學快速檢測方法。通過與細菌培養(yǎng)法及PCR 方法的平行驗證研究，證實所建立的快速檢測方法對參考菌株的敏感性和特異性為100%，而對CSF 樣品所含A、W135、Y 和C群Nm的敏感性和特異性為93.8%～100%［10-11］。

在非洲一項歷經(jīng)5年的快速檢測試紙條的現(xiàn)場評估研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)場工作人員和參考實驗室專業(yè)人員檢測2 095 份CSF 樣品的分析結(jié)果一致性高達94%，且檢測結(jié)果與細菌培養(yǎng)和實時PCR檢測結(jié)果的一致性為89%，方法的靈敏度和特異性分別為91.5%和84.6%。表明該方法可經(jīng)過培訓但非專業(yè)的工作人員操作并可獲得良好的檢測結(jié)果，尤其適合衛(wèi)生設施相對簡單的基層使用［12］。

2.2 環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是在21世紀初發(fā)展起來的新技術。該方法僅需簡單的水浴，但仍具有高效擴增和特異性高的優(yōu)點，被廣泛用于不同病原體的分子診斷［13-15］。研究人員應用LAMP 檢測技術對Nm分子診斷方法研究，發(fā)現(xiàn)含高拷貝靶基因的樣本可在16 min 出現(xiàn)陽性顏色變化，方法的最低檢出限為6 個拷貝，通過與391 例臨床樣品常規(guī)實時PCR 檢測結(jié)果比較，LAMP 方法靈敏度和特異性分別為100%和98.9%，極大節(jié)省了檢測成本和時間［16］。該方法被英國貝爾法斯特皇家兒童醫(yī)院作為急診實驗室診斷手段之一［17］。同時，通過對DNA 進行引物與探針的改變，不斷完善和改進LAMP 檢測方法，包括開發(fā)出可檢測幾種腦膜炎相關病原體的多重LAMP 檢測方法，成本低、靈敏度為90.9%、特異性為100%［18］。由于LAMP 檢測對設備的要求不高，因此對于資源有限的實驗室或者基層醫(yī)院是一種很有吸引力、能用于腦膜炎等傳染病的分子實驗室診斷方法。

2.3 線性探針技術

線性探針技術（line-probeassay，LipA）是通過DNA 擴增-雜交反應來檢測Nm基因位點突變狀態(tài)，用于CSF 標本中Nm及耐藥性的檢測分析。Ahmet Soysal 等［19］應用該技術對751 例CSF 樣本進行了腦膜炎病原體診斷，并與PCR 方法進行比較。發(fā)現(xiàn)127 例為肺炎鏈球菌陽性，53 例為b 型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae type b，Hib）陽性，41 例為Nm陽性，以PCR 結(jié)果為參照，LipA對肺炎鏈球菌、Hib和Nm的特異性為88%，建議LipA 檢測可用于細菌性腦膜炎病原體CSF 標本臨床分子診斷和流行病學監(jiān)測研究。

2.4 PCR 檢測技術

與傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法相比，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法不會因服用抗生素或樣品運送與處理而導致待檢測樣品中活菌死亡而影響［20-21］。研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR 對流腦診斷陽性率達91%～100%，假陰性少見，小于5%［22］。Whiley 等［23］報道的流腦雙重PCR 檢測方法，即在同一PCR 反應體系中加入針對Nm兩個靶基因porA與ctrA的兩對引物進行擴增，提高試驗的靈敏度和特異性。

目前采用PCR 不僅可以檢測細菌靶基因，也可分析感染菌株的血清群。研究人員應用多重PCR 方法對2015-2018年在土耳其收集994 例疑似腦膜炎患者的CSF 樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)89 例為Nm感染，隨后對不同血清群特異性包括針對X 群Nm 的ctrA基因、B、C、W 和Y 群Nm的特異性siaD基因和A 群Nm的orf-2基因引物進行PCR擴增，結(jié)果證實絕大多數(shù)流腦感染為B 群流腦，共45 例，而W 群流腦病例為9 例［24］。

盡管PCR 檢測方法是一種快速、準確、靈敏度高與特異性強的檢測流腦感染方法，但其實際應用和所用檢測靶基因還未在全世界范圍內(nèi)形成統(tǒng)一的規(guī)定［25］。例如，在歐盟，僅有25%的病例僅是通過PCR 確診，而在英國和愛爾蘭，這一比例約為50%；在美國，CDC 直到2010年以后才在其病例定義中將PCR 作為實驗室診斷確診檢測方法［26］。

2.5 檢測多種呼吸道病原體的多重實時PCR

為了滿足臨床診斷需要，近幾年，多重實時PCR（Multiplex Real-time PCR polymerase Chain Reaction，MRT-PCR）技術應用越來越廣泛。研究人員建立可同時檢測肺炎鏈球菌（靶基因plyA）、Hib（靶基因bexA）和Nm（靶基因ctrA和sodC）的多重實時PCR 方法［27］。在一份收集122 份疑似流腦患者CSF 樣本比較分析中，發(fā)現(xiàn)50 例陽性樣本，包括32 例肺炎鏈球菌、12 例Nm和1 例b 型流感嗜血桿菌，MRT-PCR 提高了疑似流腦患者的陽性檢出率，進一步增加了反應的靈敏度和特異性［28］。

任紅宇等［29］研究人員通過優(yōu)化單一PCR 擴增體系及擴增程序，建立了檢測Nm、Hib、肺炎鏈球菌等8 種病原體的多重實時PCR 方法，此方法具有較高的靈敏度，且檢測快速，適合臨床疑似細菌性腦膜炎感染病例的檢測與篩查，提高陽性診斷率。

盡管CSF 的常規(guī)化學和細胞分析可能有助于迅速區(qū)分細菌和病毒感染，但無法確定具體的病因［30-31］。為了助力精準診斷，研究人員建立檢測CSF 中14 種病原微生物（細菌、病毒、真菌）的多重實時PCR 方法，研究結(jié)果表明該方法的細菌性病原體陽性檢出符合率為97.5%，病毒為90.1%，真菌為52%，實驗反應時間不超過60 分鐘，與常規(guī)PCR 方法比較，陰性符合率大于99.9%［32］，且能夠檢測到單獨的、有針對性檢測而不被發(fā)現(xiàn)的混合感染病例。因此，MRT-PCR 也必將推動臨床實驗室快速、精準檢測能力的發(fā)展。

2.6 全基因測序方法

宏基因組二代測序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）由于可以不依賴于培養(yǎng)結(jié)果，直接從樣本中獲得病原體的核酸序列信息，被越來越多地應用于包括對細菌性腦膜炎在內(nèi)的各種病原體引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷。

研究人員通過對mNGS 診斷感染性腦膜炎和腦炎的情況進行了為期一年的研究，共檢測出32例感染，而常規(guī)直接檢測（即指CSF 培養(yǎng)、PCR 或抗原檢測，不包括血清學檢測或CSF 以外的樣本檢測）僅檢測出27 例；其中19 例用常規(guī)檢測和宏基因組方法均檢測出病原體；結(jié)果表明，CSF 樣本的宏基因組測序在診斷傳染性腦膜炎和腦炎的有效性，有助于改善腦膜炎和腦炎的病原體診斷，并在部分病例中對醫(yī)生的治療方案有指導作用［33］。通過對95 例患者樣本進行盲法mNGS 測試來評估診斷的準確性，與原始臨床診斷結(jié)果相比，mNGS 方法的靈敏度和特異性分別為73%和99%。隨后對從一組患有腦膜炎、腦炎和或脊髓炎的兒科患者中收集的20 份陽性CSF 樣本進行mNGS 挑戰(zhàn)試驗，相對于CSF 的常規(guī)細菌培養(yǎng)檢測，發(fā)現(xiàn)mNGS 方法在檢測致病性病原體方面的敏感性和特異性分別為92%和96%。這些結(jié)果進一步證實了mNGS 方法直接檢測病原體分析性能。mNGS 的優(yōu)勢在于，不依賴針對目標病原體的經(jīng)驗知識，能夠在一次化驗診斷中檢測出更多的感染因子。通過一次分析來識別潛在病因綜合譜一病毒、細菌、真菌和寄生蟲，是一種很有前景的傳染病診斷方法［34］。

3 小結(jié)與展望

在長期研究建立與發(fā)展的流腦實驗室診斷方法中，經(jīng)典的細菌培養(yǎng)法雖然特異性好，但耗時長，靈敏度低，不利于疑似患者的快速診斷和治療。近些年開發(fā)的流腦快速檢測試紙條方法、簡便、快捷，適合于基層醫(yī)院開展，具有較大的實用性。毋庸諱言，以PCR 為基礎的分子檢測方法是流腦診斷技術中靈敏度和特異性最高的檢測方法，是流腦診斷技術一次里程碑的進展，只要嚴格規(guī)范操作，避免假陽性、陰性結(jié)果出現(xiàn)，LAMP 檢測是一種恒溫核酸擴增的新型技術，具有特異性高、時間短、操作簡單等優(yōu)點，適用于不用層級實驗室。事實上，在一些國家，已經(jīng)批準涵蓋多種呼吸道病原體檢測的商業(yè)化PCR 試劑盒用于臨床實驗室診斷用［22］。但不可否認，雖然PCR 檢測成本持續(xù)在下降，在一些資源匱乏和缺乏訓練有素工作人員的國家和地區(qū)要引進PCR 檢測方法還是具有一定難度。為了更好的加強流腦的預防和控制，全球腦膜炎球菌倡議組織推薦，有條件的省級或地市級實驗室都應開展PCR 檢測Nm方法，可快速獲得（在數(shù)小時內(nèi)）檢測結(jié)果。此外，建議也應對使用的PCR 檢測方法進行驗證，并不取代細菌培養(yǎng)方法，并通過后者獲取細菌資源，共同促進流腦感染的防控［35］。

mNGS 分析的特異性僅次于金標準細菌培養(yǎng)方法，通過對腦膜炎和其他臨床癥患者的早期臨床研究，證實了直接通過對標本進行mNGS 分析能夠獲得具有挑戰(zhàn)性的感染診斷。然而，在已發(fā)表的回顧性病例研究中，由于應用mNGS 檢測而有益于臨床治療的患者比例較低，且檢測成本較高，這提升了我們對患者“何時進行檢測”以及mNGS檢測適合哪些患者理解的重要性［36］。此外，在臨床試驗室實施mNGS 還面臨參考標準、生物信息學分析以及不同國家公共衛(wèi)生政策和監(jiān)管等問題。

當前我國流腦實驗室診斷相關研究很少，而流行病學監(jiān)測研究均需要可靠的實驗室檢測方法。因此，加強流腦感染的實驗室分子診斷的研究是我國目前的當務之急。只有可靠的流腦實驗室診斷和檢測方法才能提供更加全面的流腦流行病學和實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)。因此，為了系統(tǒng)評價我國流腦的疾病負擔，建議進一步加強流腦監(jiān)測能力，尤其是一些地區(qū)尚不具備流腦實驗室監(jiān)測能力，推薦將檢測病原體敏感的RT-PCR 方法用于哨點檢測，提高病原體陽性檢出率。