星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)性容積減?。≧VD）的關(guān)鍵膜蛋白研究進(jìn)展*

周佐邑高嘉琪高凱龔艷君于常海

（1）北京大學(xué)第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100034；2）北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科，北京 100034；3）北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100191；4）北京大學(xué)第三醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100191）

水約占大腦重量的80%，水平衡是腦部生理活動(dòng)的重要基礎(chǔ)，同時(shí)，水平衡的紊亂也是腦部疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一［1］。宏觀層面上看，腦浸潤 于腦 脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中，CSF主要由位于腦室的脈絡(luò)叢產(chǎn)生，同時(shí)也來自腦微循環(huán)以及腦部細(xì)胞代謝產(chǎn)生的水［2-3］。CSF循環(huán)于腦室和蛛網(wǎng)膜下腔中并最終主要由蛛網(wǎng)膜粒吸收，維持顱內(nèi)壓的相對(duì)穩(wěn)定［2，4］。因顱骨的解剖學(xué)限制，在有限的顱內(nèi)空間中，液體的增多（如腦脊液回流不暢、腦水腫）會(huì)極大增加顱內(nèi)壓，引起繼發(fā)損傷和威脅生命的并發(fā)癥［5］。微觀層面上，神經(jīng)元和多種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生存的細(xì)胞外環(huán)境為腦部組織液（interstitial fluid，ISF），復(fù)雜的神經(jīng)電活動(dòng)依賴于神經(jīng)遞質(zhì)和受體的結(jié)合以及細(xì)胞內(nèi)外的離子轉(zhuǎn)移，輕微的細(xì)胞容積或細(xì)胞外空間（extracellular space，ECS）容積變化都可能會(huì)影響局部神經(jīng)遞質(zhì)及離子濃度，進(jìn)而影響神經(jīng)元信號(hào)傳輸?shù)裙δ堋２±砬闆r下，腦細(xì)胞水腫使得ECS減小，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和類似物質(zhì)在ECS中的累及，進(jìn)而可能導(dǎo)致興奮性毒性等損傷［6］。因此，維持腦的水平衡是至關(guān)重要的。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)目最多的細(xì)胞類群之一［7］，近年來的研究顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)發(fā)揮多種重要功能，包括構(gòu)成血腦屏障（BBB）、支持營養(yǎng)神經(jīng)元、調(diào)節(jié)突觸形成和成熟以及參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞等［8-11］。其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的一項(xiàng)基本功能是監(jiān)測(cè)和維持腦部細(xì)胞外微環(huán)境的穩(wěn)定，包括水電解質(zhì)平衡［12-14］。生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過快速改變自身局部容積，介導(dǎo)水和離子的再分布，是神經(jīng)活動(dòng)中突觸間隙過量鉀離子清除的主要機(jī)制［15-17］。在腦缺血缺氧、腦外傷、肝性腦病、癲癇等多種疾病情況中，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)首先并最顯著地出現(xiàn)水腫［6，18-20］。星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫造成的細(xì)胞外液與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的離子梯度，是腦水腫病理過程進(jìn)展的重要推動(dòng)力［19］；同時(shí)，腫脹的星形膠質(zhì)細(xì)胞壓迫毛細(xì)血管微循環(huán)，也加劇了局部缺血缺氧損傷［5］。

應(yīng)對(duì)水腫，星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)性容積減小（regulatory volume decrease，RVD）的方式代償性快速減小自身部分容積。RVD是多種細(xì)胞在水腫時(shí)通過離子或中性滲透物的跨膜流動(dòng)使水從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移進(jìn)而恢復(fù)自身原有容積的一種代償機(jī)制，在不同的細(xì)胞中，根據(jù)其各自表達(dá)的膜蛋白不同，引起RVD的機(jī)制也不甚相同［21］。星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD的確切機(jī)制，目前仍未被完全揭示。早期觀點(diǎn)認(rèn)為，TRPV4（transient receptor potential vanilloid 4）介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流激活下游信號(hào)通路是星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力［22］，但后續(xù)研究通過藥物抑制TRPV4功能或去除細(xì)胞外液鈣離子等方式發(fā)現(xiàn)，阻斷TRPV4介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流并未影響星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD過程，提示TRPV4介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流并非星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD發(fā)生的必要條件［23-24］。近年來，更多研究表明體積調(diào)節(jié)性陰離子通道（volume-regulated anion channel，VRAC）介導(dǎo)的陰離子外流是星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD的主要驅(qū)動(dòng)力［25-27］。水從星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的這一過程，也并非簡單的跨膜自由擴(kuò)散，而是通過水通道蛋白（aquaporin，AQP），尤其是水通道蛋白4（AQP4），所進(jìn)行的快速轉(zhuǎn)移［24］。表1按時(shí)間順序列舉了星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD的關(guān)鍵研究進(jìn)展。進(jìn)一步了解VRAC和AQP的結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD中如何發(fā)揮作用，是理解星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD機(jī)制以及病理狀態(tài)下RVD無法代償機(jī)理的關(guān)鍵，有助于發(fā)現(xiàn)腦水腫治療的潛在靶點(diǎn)，本文的后半部分將分別圍繞VRAC及AQP進(jìn)行具體介紹。

Table 1 Milestones in the research of astrocyte RVD表1星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD關(guān)鍵研究進(jìn)展年表

1 體積調(diào)節(jié)性陰離子通道（VRAC）

早在20世紀(jì)80年代，細(xì)胞水腫激活的陰離子外流就首次在人外周血單核細(xì)胞中被報(bào)道并被認(rèn)為是單核細(xì)胞RVD的關(guān)鍵因素［28］。此后，VRAC被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中［37］。細(xì)胞水腫時(shí)，VRAC受到激活，介導(dǎo)氯離子和有機(jī)分子的外流，配合鉀離子的外流，減少細(xì)胞內(nèi)滲透性物質(zhì)濃度，進(jìn)而引起水向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)移，造成細(xì)胞容積減小［25，38］。然而長期以來，VRAC的分子本質(zhì)一直未得到明確。直到2014年，兩項(xiàng)研究揭示了VRAC的主要成分為LRRC8（leucine-rich repeatcontaining 8）家族，一類4次跨膜蛋白家族所構(gòu)成的多聚體［32-33］。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，VRAC是由LRRC8A及其家族的其他成員（LRRC8B~E）構(gòu)成的異六聚體。其主要結(jié)構(gòu)包括一個(gè)跨膜孔結(jié)構(gòu)域以及胞漿側(cè)的亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域。VRAC的跨膜孔在細(xì)胞內(nèi)外并非對(duì)稱，其胞漿側(cè)孔徑較寬而胞外側(cè)孔徑小，跨膜孔胞外側(cè)是形成VRAC選擇性的核心結(jié)構(gòu)［34-35，39］。

Hyzinski-Garcia等［26］使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)確定了LRRC8A~E在原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中的mRNA表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)LRRC8A是組成VRAC的核心組分，使用小干擾RNA敲除LRRC8A和LRRC8D，電中性滲透性物質(zhì)（如肌醇、?；撬幔┑耐饬魇艿揭种?；而敲除LRRC8A和LRRCB/C/E則顯著抑制了帶電荷的滲透性物質(zhì)（如D-天冬氨酸）的外流［26，40］。Formaggio等［27］則通過免疫印跡和免疫熒光的方法確定了LRRC8A蛋白在原代大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠腦切片的原位膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用小干擾RNA敲低LRRC8A表達(dá)后，星形膠質(zhì)細(xì)胞在低滲刺激水腫后的RVD不能發(fā)生，直接證明了LRRC8A是星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD的必需蛋白質(zhì)。

值得注意的是，VRAC不僅可以介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD，通過VRAC釋放至細(xì)胞外液的有機(jī)分子，特別是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，也是突觸間隙中谷氨酸的重要來源之一。定向敲除小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的LRRC8A后，小鼠的微型興奮突觸后電流頻率減少，突出可塑性降低，同時(shí)出現(xiàn)了持續(xù)的學(xué)習(xí)及記憶缺陷。在腦缺血等病理情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞病理性水腫，激活VRAC引起大量谷氨酸釋放，如細(xì)胞外液與神經(jīng)元表面受體相結(jié)合，可能進(jìn)一步加重缺血性卒中時(shí)神經(jīng)元的興奮性損傷［36，41］。VRAC的生理功能及其在病理性水腫中所發(fā)揮的復(fù)雜作用仍有待進(jìn)一步研究明確。

2 水通道蛋白（AQP）

1988年，Denker等［29］在人類紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)AQP成員AQP1，并因此獲得了2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目前，在人類和嚙齒類動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13種AQP亞型（AQP0~AQP12）。所有這些亞型都具有相對(duì)保守的整體結(jié)構(gòu)，通常作為穩(wěn)定的均四聚體存在于細(xì)胞膜上，其中每個(gè)單體都獨(dú)立形成一個(gè)雙向水通道。根據(jù)先前報(bào)道的人類AQP1信息，以AQP1為例畫出AQP單體的一般三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖（圖1a）［31，42-44］（同時(shí)參考數(shù)據(jù)庫信息：RSCB蛋白數(shù)據(jù)庫（ID：1FQY）；Uniprot數(shù)據(jù)庫（ID：P29972））。AQP每個(gè)單體（大小為26~34 ku）由6個(gè)跨越膜的α螺旋（H1~6）組成，6個(gè)跨膜螺旋之間由5個(gè)長度不同的氨基酸環(huán)（Loop A-E）順序連接。前3個(gè)跨膜螺旋（H1~3）與后3個(gè)跨膜螺旋（H4~6）具有氨基酸的高度同源性。6個(gè)螺旋串聯(lián)并重復(fù)跨膜，使得每對(duì)高度同源的螺旋（H1-H4、H2-H5、H3-H6）都處于相反的取向，構(gòu)成了通道雙向性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。決定AQP通道選擇性的最重要結(jié)構(gòu)是NPA模體，這一結(jié)構(gòu)由環(huán)B和環(huán)E分別部分插入脂雙層形成的兩段非跨膜螺旋（HB和HE）構(gòu)成，HB和HE在脂雙層中心相遇的末端是兩個(gè)高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（NPA）序列（圖1，紅色），通常將位于HB的NPA保守序列稱為NPA1，而將位于HE的NPA保守序列稱為NPA2，兩個(gè)NPA序列相互作用于脂雙層中心，稱為NPA模體，這一結(jié)構(gòu)決定了AQP通道的電荷選擇性，不允許氫離子通過。AQP通道物理上的最狹窄處則由位于NPA模體近胞外側(cè)的四氨基酸功能位點(diǎn)（芳香族/精氨酸收縮區(qū)（ar/R收縮）和一個(gè)半胱氨酸）形成，在人AQP1中這4個(gè)氨基酸分別為Phe56、His180、Arg195和Cys189（圖1，粉色）［31，45-46］。

目前被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的13種AQP亞型可根據(jù)其功能及氨基酸序列特點(diǎn)分為3個(gè)亞家族（圖1），AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8屬于經(jīng)典AQP亞家族，其特點(diǎn)是通道內(nèi)徑相對(duì)較窄，具有較嚴(yán)格的水分子選擇性（同時(shí)可通過氨、尿素等極性小分子）。其中的AQP6因其水通透性較差并可允許甘油通過，其分類尚存在一定爭議。AQP3、AQP7、AQP9、AQP10屬于甘油-水通道亞家族，其特點(diǎn)是通道內(nèi)徑較大，允許甘油通過［43］。同時(shí)，甘油-水通道亞家族中的水通道蛋白在氨基酸序列擁有共同特點(diǎn)，即NPA2下游第2位氨基酸為保守的天冬氨酸。AQP11、AQP12屬于超AQP亞家族（superaquaporins），其序列特點(diǎn)是具有高度退化的NPA1，但在NPA2的下游具有保守的半胱氨酸。目前AQP11已被證實(shí)具有水通透性，但AQP12是否有水通透性尚不明確［47-48］。從進(jìn)化的角度看，經(jīng)典AQP亞家族和甘油-水通道亞家族可能來源于一個(gè)共同的AQP祖先，而超AQP亞家族與前二者的關(guān)系較遠(yuǎn)［48-49］。

Fig.1 Structure and subfamilies of AQP圖1 AQP結(jié)構(gòu)及亞家族示意圖（以AQP1結(jié)構(gòu)為例）

至今，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)6種AQP亞型的表達(dá)，分別為AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9，這些水通道蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞生理及病理過程中發(fā)揮了多種作用［50］。其中，AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量最大的AQP，AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的分布并不是均勻的，而是與細(xì)胞外環(huán)境有著緊密聯(lián)系?？偟膩碚f，AQP4富集于星形膠質(zhì)細(xì)胞與液體接壤的細(xì)胞膜區(qū)域，包括包繞毛細(xì)血管，與血管內(nèi)皮、基底膜共同構(gòu)成BBB的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足；也包括緊鄰腦室或蛛網(wǎng)膜下腔腦脊液成分、構(gòu)成膠質(zhì)界膜（glia limitans）的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足（end-feet）［30，51］。星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP4參與了腦水平衡的多個(gè)重要環(huán)節(jié)，敲除AQP4的小鼠，其BBB對(duì)水的透過性較正常小鼠明顯下降［52］；敲除AQP4也使得CSF流動(dòng)及循環(huán)受到明顯抑制［53］。同時(shí)，在緊貼突觸結(jié)構(gòu)的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上，也有一定數(shù)量的AQP4表達(dá)，參與突觸間隙中鉀離子及谷氨酸的清除過程［54-58］。不僅如此，AQP4還被證明與星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移密切相關(guān)。小鼠腦外傷模型中，AQP4缺失的小鼠，星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移速度顯著減慢［59］。AQP4促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的機(jī)制可能為AQP4介導(dǎo)水快速進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)前沿（leading edge）的形成。另外，更近期的研究也發(fā)現(xiàn)，AQP4與結(jié)合素43（connexin 43）的相互作用，也可能作為AQP4促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的機(jī)制之一［59-61］。AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD的啟動(dòng)和加速過程中都發(fā)揮重要作用，一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞的快速水腫是RVD的啟動(dòng)條件，而AQP4介導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的快速水腫；另一方面，當(dāng)RVD過程啟動(dòng)后，隨著滲透性物質(zhì)快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的水也需要通過AQP4這一“快速通道”。AQP4既是星形膠質(zhì)細(xì)胞RVD啟動(dòng)的必要條件，也是RVD快速發(fā)生的通道［24］。

3 總 結(jié)

水平衡是腦發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。多種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病都可能打破這一平衡，進(jìn)而引發(fā)腦水腫、腦積水等病理改變，導(dǎo)致不良預(yù)后，甚至引起腦疝等威脅生命的臨床并發(fā)癥。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞之一，是大腦水平衡的主要維持者，在腦缺血等多種疾病發(fā)生進(jìn)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞最早也最為顯著地表現(xiàn)出細(xì)胞水腫，并進(jìn)而通過多種機(jī)制推動(dòng)疾病的發(fā)展。星形膠質(zhì)細(xì)胞快速水腫激活RVD啟動(dòng)，使得滲透性物質(zhì)和水快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，部分恢復(fù)細(xì)胞原有容積。VARC和AQP是RVD過程中的兩種關(guān)鍵膜蛋白，AQP介導(dǎo)細(xì)胞快速水腫激活VRAC，使得滲透性物質(zhì)快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，在滲透作用的驅(qū)動(dòng)下，細(xì)胞內(nèi)的水快速通過AQP轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，完成星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)性容量減少。對(duì)VRAC和AQP結(jié)構(gòu)及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞中功能的研究將進(jìn)一步幫助人們認(rèn)知RVD的發(fā)生機(jī)制，為多種疾病中腦水腫的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。