王林，汪和廷，王慧，張從合

（安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司，安徽合肥 230088）

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物，我國(guó)大約有2/3 的人口以稻米作為主食[1-2]。隨著生活水平和消費(fèi)水平的不斷提高，人們對(duì)稻米品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。稻米品質(zhì)主要由外觀品質(zhì)、碾磨品質(zhì)、食味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)決定，其中食味品質(zhì)為重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，而淀粉的結(jié)構(gòu)和含量是影響食味品質(zhì)的關(guān)鍵[3]。稻米品質(zhì)是影響水稻品種推廣和商業(yè)價(jià)值的重要指標(biāo)。因此，目前主要以提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)作為水稻育種的主要目標(biāo)[4]。

稻米主要由胚和胚乳兩部分組成，而胚乳中的儲(chǔ)藏物質(zhì)90%以上為淀粉。淀粉的品質(zhì)與其組成、結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)密切相關(guān)[1]，因此，將稻米淀粉的合成途徑和調(diào)控基因等作為研究對(duì)象具有重要意義。長(zhǎng)期以來(lái)，科研工作者通過(guò)對(duì)一些人工突變和自然突變材料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了大量調(diào)控水稻淀粉生物合成的基因。如flo1 突變會(huì)導(dǎo)致直鏈淀粉含量升高[5-6]；在flo2 突變體中，直鏈淀粉含量會(huì)減少，聚合度（DP）9～21 和 DP≥38 減少，DP 22～38 增加[7-8]；在flo8 突變體中，直鏈淀粉含量下降，DP 10～12 和DP≥17減少，DP 7～9 和 DP 14～16 增加[9]。此外，通過(guò)生物信息學(xué)分析找到一些胚乳中特異性表達(dá)的相關(guān)基因或蛋白，通過(guò)對(duì)這些基因的克隆以及功能進(jìn)行分析，來(lái)了解它們?cè)诘矸酆铣芍械淖饔茫瑥亩行У卮龠M(jìn)了水稻淀粉生物合成的發(fā)展。

1 水稻淀粉合成

淀粉根據(jù)其連接方式的不同，分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，二者的比值決定著稻米品質(zhì)。瞬時(shí)淀粉白天通過(guò)光合作用在葉片中進(jìn)行合成，在夜間進(jìn)行降解，為植物代謝提供能量，其形成的淀粉顆粒幾乎為體積很小的支鏈淀粉[10]。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成中重要的一步，其包括在酶活性中心起主要作用的大亞基AGPL 及在活性中心起到催化和結(jié)合的小亞基AGPS[11]。在葉綠體中，利用卡爾文循環(huán)固定的CO2通過(guò)一系列反應(yīng)形成1-磷酸葡萄糖，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶可以催化1-磷酸葡萄糖形成淀粉合成的前體物質(zhì)ADPG，最終在淀粉合成酶及淀粉分支酶的作用下形成直鏈淀粉和支鏈淀粉[12]。相關(guān)研究表明，glgC-16 能夠編碼高活性和對(duì)異構(gòu)調(diào)節(jié)不敏感的AD-Pase，將大腸桿菌的突變基因glgC-16 轉(zhuǎn)入水稻中會(huì)顯著增加水稻籽粒的淀粉含量和千粒重[13]。

在淀粉體中，以蔗糖作為合成淀粉的碳源，經(jīng)過(guò)水解后的蔗糖以磷酸葡萄糖的形式進(jìn)入淀粉體參與淀粉的合成。Hirose 等研究表明，在水稻中有21個(gè)基因參與淀粉的合成[14]。淀粉合成酶一般與總淀粉含量，直鏈淀粉和支鏈淀粉比例以及支鏈淀粉分支長(zhǎng)度有關(guān)。淀粉合成酶一般為葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，包括顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）和可溶性淀粉合成酶（SSS）[15]。GBSSI 主要與直鏈淀粉的合成有關(guān)，GBSSII 與支鏈淀粉的合成有關(guān)。淀粉分支酶（SBE）具有雙重催化作用，一方面將α-1，4-糖苷鍵水解，另一方面催化非還原性末端連接到C-6 羥基上形成α-1，6-糖苷鍵分支點(diǎn)。淀粉去分支酶（SDBE）主要水解α-1，6-糖苷鍵，屬于淀粉水解酶家族。SDBE 能消除支鏈淀粉中出現(xiàn)的異常支鏈分支，從而形成正常的分支[16]。

2 相關(guān)家族轉(zhuǎn)錄因子在淀粉合成中的作用

2.1 bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子

bZIP 是第一個(gè)確定參與淀粉合成的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)報(bào)道，OsbZIP58 顯示直接與6個(gè)淀粉合成基因的啟動(dòng)子OsAGPL3、Wx、OsSSIIa、SBE1、OsBEIIb 和 ISA2 結(jié)合，并調(diào)節(jié)它們的表達(dá)，從而造成OsbZIP58 突變體中種子形態(tài)異常，在白色腹部區(qū)域淀粉積累改變，導(dǎo)致直鏈淀粉和總淀粉含量的下降[17]。此外，OsbZIP58 可以與OsLOL1 互作，通過(guò)調(diào)控赤霉素合成，進(jìn)而影響種子發(fā)芽和淀粉積累[18]。OsbZIP20 可以與ACGT 元件相互作用，從而影響淀粉合成；而OsbZIP33 在淀粉合成中可以與BEI 和GBSSI 的啟動(dòng)子序列ACGT 結(jié)合，從而調(diào)控淀粉合成[19-20]。

2.2 AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子

AP2/ERFs 在乙烯及其受體介導(dǎo)的信號(hào)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，也參與淀粉代謝和積累[21]。AP2/ERF 家族包括3個(gè)獨(dú)立的亞家族：ERF、AP2 和 RAV。ERF 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)谷物中淀粉的合成[21]。據(jù)報(bào)道，OsRSR1 為AP2/EREBP型調(diào)控因子，其突變體rsr1 會(huì)導(dǎo)致水稻直鏈淀粉含量的增加以及支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)，也會(huì)增加種子的大小[22]。AP2/ERF 也可以通過(guò)激素來(lái)調(diào)節(jié)淀粉合成基因。研究表明，在過(guò)表達(dá)水稻OsETR2 中，其可以增加淀粉顆粒在節(jié)間的積累[21]。AP2 家族轉(zhuǎn)錄因子OsSERF1，缺失SERF1會(huì)增加RPBF 的表達(dá)，以及淀粉含量的增加，從而導(dǎo)致水稻籽粒重量的增加[23]。

2.3 其他轉(zhuǎn)錄因子

OsBP-5 屬于MYC-like 家族轉(zhuǎn)錄因子，主要參與淀粉合成通路中GBSSI 的合成，從而影響淀粉的合成[24]。NAC家族轉(zhuǎn)錄因子OsNAC20 和OsNAC26 具有高度相似的氨基酸序列，單獨(dú)的OsNAC20 和單獨(dú)的OsNAC26 都很好地反式激活 AGPS2b、AGPL2、SSI、SBEI、Pul 和 DPE1，可以改變淀粉的積累，但是不會(huì)造成晶體結(jié)構(gòu)的改變。利用CRISPR/Cas9 構(gòu)建osnac20/osnac26 雙突變體，結(jié)果顯示osnac20/osnac26 雙突變體中總淀粉含量顯著下降，直鏈淀粉的含量顯著增加[25]。

3 蛋白水平調(diào)控水稻淀粉的合成

OsESV1 蛋白C 端有富含脯氨酸的序列。為了研究OsESV1 的功能，利用CRISPR/CaS9 系統(tǒng)得到了2 種不同編輯方式的osesv1 突變體，對(duì)其淀粉含量進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明，osesv1 突變體相對(duì)于野生型總淀粉含量無(wú)明顯變化，但直鏈淀粉含量顯著升高。同時(shí)，通過(guò)利用酵母雙雜交試驗(yàn)證明OsESV1 蛋白可以與ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基OsAGPS2a 和OsAGPS1 互作[26]。FLO6 蛋白在其N端有一個(gè)質(zhì)體定位信號(hào)肽，C 端具有1個(gè)CBM48 淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究表明FLO6 在體外和體內(nèi)都可以與異淀粉酶ISA1 互作，其突變體flo6 總淀粉含量上升，直鏈淀粉含量顯著下降，說(shuō)明FLO6 通過(guò)與ISA1 互作來(lái)調(diào)控復(fù)合淀粉顆粒的形成[27]。FLO2 蛋白含在3個(gè)不同位置由氨基酸殘基組成的TPR 結(jié)構(gòu)域，對(duì)60Co 突變得到的9個(gè)flo2 不同位點(diǎn)突變的水稻籽粒進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型，9個(gè)突變體籽粒的總淀粉含量顯著下降，直鏈淀粉含量和支鏈淀粉含量也呈顯著下降趨勢(shì)，表明flo2 突變改變了淀粉的組成成分[28]。FLO11 編碼1個(gè)熱激蛋白70 調(diào)控造粉體的發(fā)育，其突變體flo11 胚乳的中心和外圍淀粉顆粒變球形，外圍表現(xiàn)粉質(zhì)[31]。FLO7 蛋白N 端含有1個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，C 端含有1個(gè)DUF1338 結(jié)構(gòu)域，與野生型相比，flo7突變體中支鏈淀粉的聚合度發(fā)生明顯改變，且在后期胚乳中復(fù)合淀粉顆粒碎裂，無(wú)法形成緊密排列的多邊形，表明FLO7 影響水稻胚乳中正常復(fù)合淀粉顆粒形態(tài)的形成[30]。FLO15 編碼乙二醛酶I 蛋白OsGLY17，其突變體flo15 表現(xiàn)出復(fù)合淀粉顆粒發(fā)育存在缺陷，淀粉含量下降[31]。FLO16 編碼1個(gè)蘋果酸脫氫酶，其突變體flo16 表現(xiàn)出總淀粉含量及直鏈淀粉含量下降，同時(shí)表現(xiàn)出直鏈淀粉和支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[32]。Nayeon 等利用T-DNA 插入獲得了flo5 突變體，通過(guò)對(duì)其聚合度、糊化溫度、結(jié)晶度以及鏈長(zhǎng)的分析，闡明了FLO5 在水稻籽粒胚乳的淀粉合成過(guò)程中起著重要的作用[33]。Kang 等采用T-DNA 插入的方法獲得了flo4 突變體，flo4 編碼丙酮酸正磷酸二激酶，通過(guò)測(cè)量淀粉含量發(fā)現(xiàn)與野生型相比無(wú)明顯變化，但是利用掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)flo4 突變體中的胚乳是由松散的淀粉顆粒組成的[34]。

4 結(jié)論

不同家族轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子是通過(guò)與淀粉合成通路中淀粉酶的啟動(dòng)子結(jié)合或者通過(guò)與激素的相互作用來(lái)調(diào)控胚乳中淀粉的生物合成。而在蛋白水平上的相關(guān)基因大多是通過(guò)與淀粉合成通路中的相關(guān)酶對(duì)應(yīng)的基因互作來(lái)影響胚乳中復(fù)合顆粒的形成來(lái)調(diào)控淀粉的形成。此外，部分基因是由于其特有的胚乳突變，通過(guò)改變淀粉的結(jié)構(gòu)來(lái)改變?cè)旆垠w的發(fā)育。同時(shí)，利用一些T-DNA 插入的方式獲得一些胚乳突變體，雖然對(duì)淀粉的含量沒有明顯差異，但是會(huì)改變淀粉的結(jié)構(gòu)。

5 問題與展望

研究水稻淀粉的合成途徑可以為人們了解稻米營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的形成提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的水稻新品種具有實(shí)際指導(dǎo)作用。目前已通過(guò)一些方式（如GWAS 分析、EMS 誘變、生物信息學(xué)分析獲得同源基因）獲得了大量胚乳中參與淀粉合成的轉(zhuǎn)錄因子或者蛋白，且部分基因已被克隆，但是仍然存在著一定的問題：①部分基因是如何參與淀粉合成的機(jī)制尚不明確，這些轉(zhuǎn)錄因子或者蛋白間是否存在著聯(lián)系尚不清楚；②當(dāng)下對(duì)淀粉的研究大多是在基因或蛋白水平上，對(duì)于激素水平上的研究較少；③有研究表明不同的插秧密度對(duì)淀粉合成途徑中的相關(guān)酶活性存在一定影響[35]，但其影響機(jī)制還不清晰，尚需進(jìn)一步深入研究。

伴隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，預(yù)測(cè)未來(lái)水稻淀粉仍需系統(tǒng)深入研究的方向?yàn)椋孩偻ㄟ^(guò)施加外源激素進(jìn)行材料的處理來(lái)明確激素信號(hào)對(duì)淀粉形成的調(diào)控作用；②研究不同發(fā)育階段水稻淀粉的合成與代謝；③研究不同溫度、肥力水平以及插秧密度等環(huán)境因素和栽培技術(shù)對(duì)淀粉合成的影響，隨著管理水平以及機(jī)械化程度的提高，此項(xiàng)工作可能成為今后研究的重點(diǎn)。