韓婷婷 陳秋奇 鄧國(guó)防

結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是世界范圍內(nèi)一個(gè)主要的健康問題，是單一感染源導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。及時(shí)予以適當(dāng)?shù)闹委煂?duì)結(jié)核病的控制以及減少其在社區(qū)中的傳播至關(guān)重要，而減少全球結(jié)核病負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵要求是尋找到更好的診斷方法和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的工具[2]。2021年WHO報(bào)告的全球新發(fā)的987萬例結(jié)核病患者中，41%的患者是未經(jīng)細(xì)菌學(xué)證實(shí)的[3]。這表明現(xiàn)有的診斷方法，存在一定的缺陷和不足[4-5]。因此，可改善結(jié)核病臨床診斷并用于結(jié)核病治療監(jiān)測(cè)的基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物鳥苷酸結(jié)合蛋白5(guanylate binding protein5,GBP5)、雙特異性磷酸酶3(dual specificity phosphatase3，DUSP3)、Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(Krüppel-like transcription factor2,KLF2)，具有一定的臨床價(jià)值，筆者從這3個(gè)基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展、臨床價(jià)值和局限性等方面進(jìn)行綜述。

一、 宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在結(jié)核病診斷中的價(jià)值

活動(dòng)性結(jié)核病(active tuberculosis，ATB)主要是根據(jù)患者的癥狀、體征、病理和細(xì)菌學(xué)證據(jù)進(jìn)行診斷的[1]?；顒?dòng)性結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)是從標(biāo)本中檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)。由于標(biāo)本獲取難度較大(如難以從癥狀已改善的患者中獲取合格的痰液標(biāo)本)以及實(shí)驗(yàn)室檢查方法在肺外結(jié)核中缺乏敏感度，僅約60%的患者能夠通過實(shí)驗(yàn)室檢查確診[6]。結(jié)核病分子生物學(xué)診斷方法GeneXpert MTB/RIF雖然在菌陽結(jié)核病患者中有著良好的效果，極大地提高了結(jié)核病的診斷能力，但其在菌陰結(jié)核病患者中敏感度較低，且不能用于監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療過程中的治療反應(yīng)[4, 7]。其次，這一方法依賴于痰標(biāo)本[7]，但痰標(biāo)本在患者癥狀改善后較難獲得。雖然可以使用支氣管肺泡灌洗液作為痰液的替代品，但其在資源有限的國(guó)家中較難普及，支氣管鏡在兒童中也較難實(shí)施[1, 7]。因此，尋求一種不依靠痰標(biāo)本即可監(jiān)測(cè)結(jié)核病治療反應(yīng)的檢測(cè)方法是必要的。而γ干擾素釋放試驗(yàn)雖然不使用痰標(biāo)本即可用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷，但其無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，并且在合并人類免疫缺陷病毒感染時(shí)其結(jié)果容易受影響。因此，目前存在的方法具有一定的局限性，人們迫切需要一種基于血標(biāo)本即可準(zhǔn)確診斷結(jié)核病的新型免疫學(xué)診斷方法，從而解決菌陰結(jié)核病，活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的診斷與鑒別診斷問題[4, 7]。基于血液宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的診斷方法正是一種潛在的解決方案。

研究表明，宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物可以區(qū)分不同的傳染病[8]。利用血液標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄的方法，人們能夠更好地了解宿主對(duì)疾病的反應(yīng)，有助識(shí)別用于診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。且這一檢測(cè)基于血液而不依賴痰，其標(biāo)本易于獲得，簡(jiǎn)單便捷，在應(yīng)用于結(jié)核病的診斷和治療監(jiān)測(cè)方面有很大的優(yōu)勢(shì)[1]。在低發(fā)病率和高發(fā)病率環(huán)境中的幾項(xiàng)研究均證實(shí)全血轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物可提供宿主對(duì)結(jié)核病反應(yīng)的廣泛視角，顯示出結(jié)核病與健康對(duì)照、結(jié)核與其他疾病、結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的準(zhǔn)確區(qū)別[5]。Zak等[9]對(duì)血液RNA標(biāo)志物預(yù)測(cè)結(jié)核病疾病風(fēng)險(xiǎn)的前瞻性隊(duì)列研究結(jié)果中也表明，在結(jié)核病出現(xiàn)前18個(gè)月的任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過全血基因表達(dá)檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)從潛伏感染到活動(dòng)性疾病的進(jìn)展。因此，這些研究都證實(shí)了宿主血液轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在結(jié)核病診斷和治療監(jiān)測(cè)中的重要價(jià)值，為研究可推廣的、廉價(jià)的診斷和治療監(jiān)測(cè)方法提供了新思路。近10年來，已經(jīng)提出了幾種基于宿主反應(yīng)的生物標(biāo)志物系統(tǒng)，以區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、健康對(duì)照者和其他疾病，并預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染到活動(dòng)性結(jié)核病的進(jìn)展[10]。這些轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的提出與驗(yàn)證，展現(xiàn)了其在結(jié)核病診斷與治療監(jiān)測(cè)方面的巨大潛力，人們可在臨床實(shí)施中推行基于宿主反應(yīng)的診斷方法[10]。

二、 宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在結(jié)核病治療療效評(píng)估中的價(jià)值

Thompson等[11]研究證實(shí)，臨床上可應(yīng)用的宿主血液RNA標(biāo)志物可預(yù)測(cè)結(jié)核病的治療結(jié)果。結(jié)核分枝桿菌感染可誘導(dǎo)某些基因的轉(zhuǎn)錄[12]，使機(jī)體某些轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物發(fā)生變化。而在治療開始2周后，血液檢測(cè)很容易就發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物發(fā)生的顯著變化，這證明了血液轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物可以作為治療成功反應(yīng)的早期替代生物標(biāo)志物[13]，且結(jié)核病特異性基因表達(dá)標(biāo)志物會(huì)隨著抗結(jié)核方案的變化而發(fā)生變化[14]，意味著這些標(biāo)志物可能用于抗結(jié)核治療的監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)治療方案的制定。O’Garra等[15]觀察到活動(dòng)性結(jié)核病患者的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在治療2個(gè)月后開始減弱，并在治療12個(gè)月后完全消失，這表明血液中的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物與活動(dòng)性結(jié)核病患者的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，并可反映疾病部位的變化。一項(xiàng)用于結(jié)核病診斷和治療監(jiān)測(cè)的6個(gè)基因血液轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)志物(RISK6)的多國(guó)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者相比，活動(dòng)性結(jié)核病的基線RISK6標(biāo)志物評(píng)分更高，隨著治療的進(jìn)行，這一評(píng)分逐漸降低，并在治療結(jié)束時(shí)降至健康對(duì)照者的評(píng)分水平。此外，RISK6標(biāo)志物評(píng)分還能高精度區(qū)分未治療、治療開始的第2個(gè)月、治療結(jié)束時(shí)和治療完成后2個(gè)月臨床治愈的結(jié)核病患者[16]。已發(fā)表的10個(gè)基因標(biāo)志物也會(huì)隨著抗結(jié)核治療而發(fā)生變化，使其可能用于監(jiān)測(cè)結(jié)核病治療效果和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)[17-18]。Heyckendorf等[19]也指出基因標(biāo)志物指導(dǎo)的治療管理可能會(huì)大大縮短耐多藥結(jié)核病患者治療的持續(xù)時(shí)間。這些研究都表明活動(dòng)性結(jié)核病患者的血液轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物可作為監(jiān)測(cè)結(jié)核病治療效果的強(qiáng)大工具，并指導(dǎo)患者的個(gè)體化治療。

三、 GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

生物標(biāo)志物組合中標(biāo)志物數(shù)量的增加雖然可能提高診斷的準(zhǔn)確性，但幾乎所有可用于檢測(cè)宿主轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的商業(yè)平臺(tái)都受其可檢測(cè)的標(biāo)志物數(shù)量的限制，因此需要整合出一個(gè)在多重檢測(cè)中具有診斷準(zhǔn)確性高的生物標(biāo)志物組合，用作結(jié)核病診斷和治療監(jiān)測(cè)[1]。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的目標(biāo)產(chǎn)品配置(targetproductprofile，TPP)確定新的結(jié)核病診斷方法應(yīng)具備使用非痰樣本(如血液)、在人類免疫缺陷病毒合并結(jié)核分枝桿菌感染的患者中總體敏感度保持在80%以上、在菌陽兒童結(jié)核病患者中的敏感度超過66%以及操作相對(duì)簡(jiǎn)單等理想特征[7]。為滿足這些要求，應(yīng)尋找快速、準(zhǔn)確、便利的診斷準(zhǔn)確性高且可在商業(yè)平臺(tái)上檢測(cè)的生物標(biāo)志物組合，Sweeney等[7]對(duì)來自公共數(shù)據(jù)集的樣本進(jìn)行綜合多隊(duì)列分析，他們發(fā)現(xiàn)了可用來診斷活動(dòng)性結(jié)核病的3個(gè)基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物(GBP5、DUSP3和KLF2)，并驗(yàn)證了它們的診斷能力，證明GBP5、DUSP3和KLF2可以區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、健康對(duì)照者和其他疾病，且其表達(dá)不受HIV感染狀況、細(xì)菌耐藥性或是否進(jìn)行卡介苗接種的影響。同時(shí)，GBP5、DUSP3和KLF2與活動(dòng)性肺結(jié)核的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，它隨疾病嚴(yán)重程度的增加而增加，隨治療進(jìn)程的推進(jìn)而減少，在治療結(jié)束時(shí)恢復(fù)到與健康對(duì)照組相同的水平，因此，其不僅可用于監(jiān)測(cè)結(jié)核病的治療反應(yīng)[7]，還有助于新藥物的開發(fā)。因?yàn)樗幬锏拈_發(fā)一直受到缺乏可靠的反映疾病嚴(yán)重程度和治療效果的生物標(biāo)志物的阻礙[20]。隨后，F(xiàn)rancisco等[21]的研究也確定GBP5和KLF2可用作活動(dòng)性結(jié)核病的診斷工具，雙基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物也可作為監(jiān)測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病治療的替代生物標(biāo)志物，進(jìn)一步證實(shí)了3個(gè)基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中的可行性。

四、GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的發(fā)展

最初，Sweeney等[7]提出這3個(gè)生物標(biāo)志物，并使用RT-qPCR算法計(jì)算，將3個(gè)基因TB評(píng)分(簡(jiǎn)稱“TB評(píng)分”)定義為: 3-gene TB score=(GBP5+DUSP3)/2-KLF2，Warsinske等[22]利用嵌套式病例對(duì)照研究分析了3個(gè)隊(duì)列中的TB評(píng)分，假設(shè)在 4% 的患病率下，TB 評(píng)分診斷活動(dòng)性結(jié)核病患者的敏感度為90%、特異度為70%、陰性預(yù)測(cè)值為99.3%。在參與研究的隊(duì)列中，TB評(píng)分均能準(zhǔn)確診斷出活動(dòng)性結(jié)核病患者，且該評(píng)分與患者痰檢結(jié)果轉(zhuǎn)陽的前6個(gè)月從結(jié)核分枝桿菌潛伏感染發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的進(jìn)展顯著相關(guān)。TB評(píng)分還與活動(dòng)性結(jié)核病患者肺部炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。在確診時(shí)，TB評(píng)分高于中位數(shù)的患者發(fā)生持續(xù)性肺部炎癥的可能性是低于中位數(shù)患者的3倍，并且在治療結(jié)束時(shí)，發(fā)生持續(xù)性肺炎患者的TB評(píng)分也較高。這些結(jié)果表明，TB評(píng)分在監(jiān)測(cè)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染個(gè)體、結(jié)核病的進(jìn)展、活動(dòng)性結(jié)核病的診斷、患者肺部的病理變化以及評(píng)估治療反應(yīng)方面有很大的潛力[22]。Zimmer等[23]的前瞻性評(píng)估中TB評(píng)分于治療的第1個(gè)月內(nèi)快速增加[TB評(píng)分的中位數(shù)增加倍數(shù)：1.08(IQR：0.54～1.52)]，并在治療4個(gè)月后趨于平穩(wěn)[TB評(píng)分中位數(shù)：1.97(IQR：1.03～2.33)]。在治療的第1個(gè)月，TB評(píng)分快速和大幅增加，有望早期識(shí)別對(duì)結(jié)核病治療有反應(yīng)的患者。4個(gè)月時(shí)TB評(píng)分變?yōu)槠脚_(tái)期可能表明疾病的早期清除，可用于指導(dǎo)縮短治療療程。肺結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)方案治療包括2個(gè)月的異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RPM)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamid，PZA)聯(lián)合應(yīng)用的強(qiáng)化期和4個(gè)月異煙肼、利福平的鞏固期。肺外和播散性肺結(jié)核有時(shí)則需要更長(zhǎng)時(shí)間的治療：(1)淋巴結(jié)結(jié)核6個(gè)月；(2)關(guān)節(jié)或骨性結(jié)核9個(gè)月；(3)中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核12個(gè)月[24]。結(jié)核病的治療最少需要6個(gè)月的時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間的治療會(huì)降低患者的依從性，而治療依從性是結(jié)核病治療成功的一個(gè)重要組成部分[25]。TB評(píng)分的平臺(tái)期則有望指導(dǎo)縮短治療的療程，從而增加結(jié)核病患者的依從性，提高治愈率。為了將這3個(gè)基因標(biāo)志物規(guī)?；珻epheid(Sunnyvale, CA, USA)開發(fā)了一種基于試劑盒的原型測(cè)試(“Xpert MTB Host Response”或Xpert-MTB-HR-Prototype)，將其整合到一個(gè)測(cè)試平臺(tái)中，利用GeneXpert檢測(cè)全血中標(biāo)志物的表達(dá)水平[23]，量化患者全血樣本中3個(gè)基因標(biāo)志物的相對(duì) mRNA 水平，直接分析指尖血[26]，滿足了Sweeney等[7]對(duì)這3個(gè)基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物可在低功耗設(shè)備和利用少量的PCR靶點(diǎn)即可運(yùn)行的預(yù)期。S?dersten等[26]的研究也確定了3個(gè)基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在該原型測(cè)試系統(tǒng)中實(shí)施的可行性，證實(shí)了該試劑盒系統(tǒng)中標(biāo)志物的性能，并再次表明其在分診測(cè)試中能夠滿足世界衛(wèi)生組織最低的目標(biāo)產(chǎn)品配置。該試劑盒也特別適用于某些難以提供痰標(biāo)本的患者，如人類免疫缺陷病毒感染者(PLHIV)，其在人類免疫缺陷病毒感染合并活動(dòng)性結(jié)核病的患者中，敏感度為 90%。

五、GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值和不足

Warsinske等[10]對(duì)已提出的16個(gè)用于診斷活動(dòng)性結(jié)核病的基因標(biāo)志物進(jìn)行系統(tǒng)比較，他們發(fā)現(xiàn)，一個(gè)生物標(biāo)志物組合中標(biāo)志物數(shù)量的增加并不能提高組合的準(zhǔn)確性。在眾多標(biāo)志物組合中，只有GBP5、DUSP3和KLF2基因標(biāo)志物組合的標(biāo)志物少于10個(gè)，符合世界衛(wèi)生組織的目標(biāo)產(chǎn)品配置，且已證明其可在痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為陽性的前6個(gè)月預(yù)測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病的進(jìn)展、可在主動(dòng)篩查中區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病、跟蹤治療反應(yīng)，以及對(duì)診斷時(shí)患有活動(dòng)性結(jié)核病且治療后出現(xiàn)亞臨床活動(dòng)性結(jié)核病可能性較高的患者進(jìn)行分層。Turner等[27]人在系統(tǒng)評(píng)價(jià)確定的 27 個(gè)符合條件的標(biāo)志物中，GBP5、DUSP3和KLF2基因標(biāo)志物組合獲得了最高的診斷準(zhǔn)確度，與年齡、性別、HIV 狀態(tài)、既往結(jié)核病史或痰涂片結(jié)果無關(guān)[27]。Hoang等[5]的研究也證實(shí)，GBP5、DUSP3和KLF2基因標(biāo)志物組合在檢測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核、培養(yǎng)陽性肺結(jié)核、高度可能肺結(jié)核和肺外結(jié)核方面表現(xiàn)最好。這些研究都表明了3基因標(biāo)志物在結(jié)核病診斷和治療監(jiān)測(cè)方面的重要價(jià)值。

GBP5、DUSP3和KLF2基因標(biāo)志物組合符合WHO分診測(cè)試的最低目標(biāo)產(chǎn)品概況(敏感度90%，特異度70%)，但其沒有符合結(jié)核病分診測(cè)試的最佳標(biāo)準(zhǔn)(敏感度95%，特異度80%)，或符合確診性試驗(yàn)的最低標(biāo)準(zhǔn)(敏感度65%，特異度98%)。在符合條件的標(biāo)志物中，GBP5、DUSP3和KLF2基因標(biāo)志物組合雖然具有最高診斷準(zhǔn)確性，但其缺乏特異性，無法用于確診結(jié)核病[27]。Hoang等[5]對(duì)臨床實(shí)踐中診斷結(jié)核病的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的一項(xiàng)前瞻性、多中心隊(duì)列研究中，發(fā)現(xiàn)所有已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物(包括GBP5、DUSP3和KLF2)在臨床實(shí)踐中均缺乏診斷準(zhǔn)確性、敏感度和特異度。在常規(guī)的實(shí)踐環(huán)境中，當(dāng)結(jié)核病必須與其他臨床表現(xiàn)相似的疾病區(qū)分開時(shí)，轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物不能表現(xiàn)出足夠的診斷準(zhǔn)確性，不可用于臨床。這與Turner等[27]的研究結(jié)果是一致的。GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物的診斷特異性不足以提供足夠可靠的陽性結(jié)果來啟動(dòng)結(jié)核病治療。這些發(fā)現(xiàn)，表明了GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物在臨床上的應(yīng)用還面臨著許多挑戰(zhàn)，它并不是在所有的條件下均有較高的性能。

六、 問題與展望

目前可用于診斷結(jié)核病的宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物是多樣的，而現(xiàn)有的研究表明，GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物組合在所有已提出的標(biāo)志物中表現(xiàn)得最好[5,10]，雖然其在臨床常規(guī)實(shí)踐中無法用于確診結(jié)核病，但其在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的個(gè)體、結(jié)核病的進(jìn)展以及評(píng)估治療反應(yīng)的潛力是不可否認(rèn)的，且其已經(jīng)開發(fā)出可以使用的試劑盒(Xpert-MTB-HR-Prototype)將其整合到測(cè)試平臺(tái)中檢測(cè)其在全血中的表達(dá)水平，使其在臨床中應(yīng)用成為可能。未來，我們對(duì)其研究可致力于將TB評(píng)分與其他的診斷方法結(jié)合起來，從而增加其診斷的性能。且現(xiàn)有的研究已證實(shí)GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物組合可在痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為陽性的前6個(gè)月預(yù)測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病的進(jìn)展，表明其有望成為一種篩查的手段，在人群中篩查出可能進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者，從而指導(dǎo)提前進(jìn)行干預(yù)，阻斷結(jié)核病發(fā)展進(jìn)程。但這一設(shè)想，必定受Xpert-MTB-HR-Prototype的價(jià)格、穩(wěn)定性、對(duì)檢測(cè)人員的要求等限制。因此，控制成本及其操作難度，是GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物組合廣泛應(yīng)用面臨的難題。雖然GBP5、DUSP3和KLF2基因宿主轉(zhuǎn)錄標(biāo)志物組合的研究結(jié)果令人鼓舞，但其在臨床應(yīng)用的實(shí)際性能、其測(cè)試平臺(tái)的開發(fā)、以及在實(shí)踐過程中的實(shí)用性仍需不斷的進(jìn)行探索。

利益沖突聲明所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)韓婷婷：查閱文獻(xiàn)，撰寫論文；陳秋奇：審閱修改；鄧國(guó)防：審閱修改，指導(dǎo)撰寫