柳鴻敏，侯程程，楊顯達(dá)，吳東林，李 靜

(吉林省疾病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春130062)

人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)屬于腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬雙鏈DNA病毒[1]。最早發(fā)現(xiàn)于1953年。人腺病毒(HAdVs)可以引起多種疾病，常見的如上呼吸道或下呼吸道感染[2]。急性呼吸道感染是兒童高發(fā)病和常見病，其中90%是由病毒感染引起的[3]，目前HAdV在5歲以下兒童中急性下呼吸道感染率約為5%～10%[4]，近年來兒童腺病毒感染有逐年提高的趨勢(shì)[5-6]。本研究對(duì)2018年6月至2021年6月因呼吸道感染就診的兒童進(jìn)行呼吸道相關(guān)病毒檢測(cè)，對(duì)腺病毒陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，基因序列測(cè)定并分析其流行特征，以了解長(zhǎng)春市兒童感染腺病毒的情況，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象采集吉林大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童呼吸科，2018年6月至2021年6月具有發(fā)熱、咳嗽等呼吸道感染癥狀的172例兒童患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalvcoar lavage fluid,BALF)標(biāo)本。

1.2 標(biāo)本采集采用電子支氣管鏡到達(dá)病變局部位進(jìn)行灌洗，灌洗部位選擇病變重的肺段。0.9%氯化鈉溶液(體重≤20 kg每次灌洗1 ml/kg,體重>20 kg每次灌洗量1 ml/kg)進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，以負(fù)壓10～15 mmHg進(jìn)行抽取以獲取BALF，將采集到的BALF放置于4℃冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.3.1核酸提取與檢測(cè) 應(yīng)用MagNA Pure 96自動(dòng)核酸提取儀，使用MagNA Pure DNA and ViralNA Small Volume Kit試劑盒，按照儀器及試劑盒說明進(jìn)行操作提取核酸。采用Real-time PCR方法檢測(cè)流感病毒A、B型(Influenza virus,IFVA、IFVB)、副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial,RSV)、腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)、博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)、人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)、支原體(Mycoplasmal pneumonia,MP)、衣原體(Chlamydial pneumonia,CP)。

1.3.2病毒分離 ADV陽(yáng)性標(biāo)本使用青鏈霉素(終濃度青霉素G 100 U/mL，硫酸鏈霉素 100 μg/mL)進(jìn)行處理后接種于人喉癌上細(xì)胞系(Human epidermoid larynx carcinoma cell line，Hep-2)細(xì)胞中，加入血清含量為2%的細(xì)胞維持液，置于35℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞75%以上細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收獲。若無病變，培養(yǎng)至7日將細(xì)胞培養(yǎng)液置于-70℃冰箱內(nèi)反復(fù)凍融后傳代，盲傳3代。

1.3.3腺病毒分型檢測(cè) 采用巢式PCR方法擴(kuò)增HAdV六鄰體(Hexon)基因片段，具體序列如表1。

表1 引物序列

第1輪引物為AdhexF1和AdhexR1，第2輪引物為AdhexF2和AdhexR2，兩輪反應(yīng)條件相同均為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。理論擴(kuò)增片段第一輪長(zhǎng)度在764～896 bp，第2輪長(zhǎng)度在688～821 bp。將所得的目的擴(kuò)增片段送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.3.4序列分析 將所有Hexon基因PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果使用sequencer5.0軟件拼接后在GenBank上進(jìn)行BLAST比較分析。

1.3.5進(jìn)化分析 測(cè)序完成后，用 DNAStar 4.0 軟件對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行編輯,并進(jìn)行同源性分析，計(jì)算 Sequence Distances，再用 MEGA 7.0 軟件采用鄰位相臨法(NJ)繪制基因種系發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

2018年6月至2021年6月在吉林大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒童呼吸科采集支氣管肺泡灌洗液172份，其中男性91人，女性81人，男女性別比為1.12∶1；年齡上分布0～1歲組16人(9.3%)，1～5歲組89人(51.74%)，5～15歲組67人(38.95%)。年齡最大為15歲，最小為0.33歲(4個(gè)月)。

2.2 病原檢測(cè)結(jié)果

172份標(biāo)本中共檢出腺病毒陽(yáng)性標(biāo)本32份，陽(yáng)性率為18.6%(32/172)。其中男性15人，女性17人，男女性別比為0.88∶1；年齡上分布0～1歲組5人(15.63%)，1～5歲組18人(56.25%)，5～15歲組9人(28.12%)。年齡最大為15歲，最小為1歲。

32份腺病毒陽(yáng)性標(biāo)本混合感染檢出情況：腺病毒單獨(dú)感染6例，占18.75%(6/32)；二重感染14例，占43.75%(14/32)；三重感染8例，占25%(8/32)；四重感染4例，占12.5%(4/32)。與支原體、流感病毒混合感染情況居多，見表2。

表2 下呼吸道標(biāo)本病原檢測(cè)結(jié)果

2.3 腺病毒分型結(jié)果

32份腺病毒陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行處理后接種于Hep-2細(xì)胞，獲得腺病毒毒株13株。經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增Hexon基因產(chǎn)物后進(jìn)行測(cè)序，序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，7型11株，2型1株，3型1株。

對(duì)11株7型腺病毒的Hexon基因部分序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)所分離得到的11株7型腺病毒與國(guó)內(nèi)上海、陜西、河北、深圳等地分離得到的毒株，同源性高達(dá)99.9%～100.0%(見圖1)。

圖1 腺病毒7型Hexon基因序列進(jìn)化圖

對(duì)1株2型腺病毒的Hexon基因部分序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)所分離得到的1株2型腺病毒與國(guó)內(nèi)云南、西藏、陜西、河北、長(zhǎng)春等地分離得到的毒株，同源性高達(dá)99.8%～100.0%(見圖2)。

圖2 腺病毒2型Hexon基因序列進(jìn)化圖

對(duì)1株3型腺病毒的Hexon基因部分序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)所分離得到的1株3型腺病毒與國(guó)內(nèi)北京、長(zhǎng)春、浙江、上海等地分離得到的毒株，同源性高達(dá)99.5%～100.0%(見圖3)。

圖3 腺病毒3型Hexon基因序列進(jìn)化圖

3 討論

HAdV 在全球普遍流行，可引起呼吸道疾病、結(jié)膜炎、膀胱炎、胃腸炎和神經(jīng)性疾病等臨床疾病[7-11]，大多數(shù)感染是自限性的，臨床癥狀不明顯或僅引起輕度癥狀。但是少數(shù)型別可引起嚴(yán)重的、甚至是致命的感染，尤其在嬰幼兒、老年人和免疫系統(tǒng)缺陷人群。目前，國(guó)內(nèi)尚未有相關(guān)疫苗和特異性的治療藥物，因此，腺病毒常見型別的分型檢測(cè)顯得尤為重要。目前已經(jīng)鑒定至少103個(gè)型別，可分為7組，即A-G 型，其中，B 型(HAdV-3、7、11、14)、C型(HAdV - 1、2、5、6)和E 型(HAdV4)是引起呼吸道感染的主要病原體[12-13]。

本研究對(duì)2018-2021年長(zhǎng)春市兒童下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行腺病毒檢測(cè)，檢出率為18.6%，本省的HAdV優(yōu)勢(shì)流行株為7型。這一結(jié)果與上海徐匯區(qū)2012-2016年的檢出率18.68%相近[14]；1～5歲兒童腺病毒感染率為10.46%，較其他年齡組感染率高，與武漢市2012～2015年監(jiān)測(cè)結(jié)果2～5歲兒童腺病毒感染所占比例相似[15]。呼吸道腺病毒有較高的混合感染率[16]，本研究混合感染率為81.25%，與支原體、流感病毒混合感染情況居多。我國(guó)近十年不同地區(qū)主要呼吸道HAdV 型別的構(gòu)成比研究數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)北部、西北部和南部省份的檢出占比較高[17]。相較于其他型別，HAdV-7感染患兒更易罹患重癥肺炎[18]。本研究對(duì)13株腺病毒毒株進(jìn)行Hexon基因序列BLAST比對(duì)，其中7型11株，占84.61%，是長(zhǎng)春市兒童下呼吸道腺病毒感染的主要型別。近幾年，我國(guó)頻繁出現(xiàn)HAdV-7引起的聚集性爆發(fā)疫情，經(jīng)常發(fā)生在學(xué)校和部隊(duì)。2015 年某院校集中出現(xiàn)聚集性發(fā)熱伴呼吸道癥狀患者，經(jīng)采集鼻咽拭子進(jìn)行PCR 檢測(cè)為腺病毒B 組7 型陽(yáng)性[19]。2019 年某部士官學(xué)校學(xué)員崗前培訓(xùn)期間，出現(xiàn)聚集性發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例，發(fā)病率高達(dá)35.14%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診為腺病毒B 組7 型陽(yáng)性[20]。2018年安徽省安慶市某部隊(duì)發(fā)生了1起急性呼吸道疾病的聚集性疫情，共13人發(fā)病，經(jīng)證實(shí)這是一起腺病毒7型引起的聚集性疫情[21]。

近些年我國(guó)各地呼吸道HAdV 傳染病暴發(fā)疫情不斷出現(xiàn)，對(duì)本省HAdV 監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，可以提升HAdV 暴發(fā)疫情的早期應(yīng)急處置能力，及時(shí)有效控制并阻斷疫情播散，提出更有針對(duì)性的有效措施。