周慶梅，蔡永美，侯憲鵬

(1.濟(jì)南市婦幼保健院 口腔科，山東 濟(jì)南250001；2.濟(jì)南市婦幼保健院 兒童保健科，山東 濟(jì)南250001；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 腫瘤治療中心放療科，山東 濟(jì)南250021)

口腔癌通常包括口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上頜竇癌等，是頭頸部腫瘤中最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率近年來呈現(xiàn)上升趨勢，口腔癌發(fā)病原因尚不明確，但與吸煙、酗酒、嚼食檳榔、口腔衛(wèi)生等因素有關(guān)[1]?？谇话┏Ｒ姷陌Y狀為長期難以痊愈的口腔潰瘍，持續(xù)存在的口腔疼痛，臉頰有腫塊，牙齦、舌頭或口腔黏膜上有白色或紅色斑點等?？谇话┮虬l(fā)病初期癥狀不明顯，因此確診時多為中晚期。目前常用的治療方式為放療，但長期的放療容易產(chǎn)生抵抗性，降低治療效果[2]?？谇话┌l(fā)生與基因突變相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)[3]異常高表達(dá)的熱休克因子1(heatshockfactor1，HSF1)促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性行為并促進(jìn)血管新生?？谇话┑陌l(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因、多階段長期演變的過程。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor,TGF-β)具有抑制免疫應(yīng)答的作用，在腫瘤中通過該作用可促進(jìn)腫瘤惡性行為。Smad是TGF-β/Smad通路重要因子，參與生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)[4],TGF-β/Smad通路參與多種腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展過程。目前，關(guān)于HSF1對口腔癌的作用機(jī)制及其對轉(zhuǎn)化生長因子β相關(guān)通路的作用機(jī)制尚不明確，因此，本文基于TGF-β/Smad信號通路探究沉默HSF1基因誘導(dǎo)對口腔癌細(xì)胞放療抵抗的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞及動物

人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27購自上海富衡生物公司，18只雄性BALB/c裸鼠購自北京華阜康生物公司,鼠齡8-10 w，體質(zhì)量在18-20 g之間，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實驗。本此實驗已通過動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號：20200518)。

1.2 實驗試劑

流式細(xì)胞儀(上海三崴公司，型號：BDFACSViaSystem)；PCR儀(山東萊恩德公司，型號：LD-PCR)；HSF1一抗(武漢菲恩公司)；TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7一抗(上海優(yōu)寧維公司)；辣根過氧化物酶二抗(北京博爾希公司，貨號：BHR102)；HSF1引物序列合成(上海生工公司)；TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7引物序列合成(合肥知恩生物公司)。

1.3 口腔癌細(xì)胞培養(yǎng)

將人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27用RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)為80%～90%時胰酶消化，離心，1 250 r/min，共5 min，重懸，傳代，取第4代細(xì)胞進(jìn)行實驗，用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.4 口腔癌細(xì)胞放射線照射

將人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27接種于6孔板中(1.6×105)，接種2 d后，用6Mev直線加速器作為放射源，在室溫條件給予細(xì)胞6Gy劑量照射3天，同時觀察細(xì)胞活力，若細(xì)胞無明顯死亡，則取對數(shù)生長的細(xì)胞以8、10 Gy逐漸增加放療劑量，反復(fù)培養(yǎng)照射，直到細(xì)胞在10 Gy放射下能夠穩(wěn)定存活，即放療抵抗細(xì)胞株構(gòu)建完成，然后用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染

將放射抵抗CAL-27細(xì)胞分為抵抗組(放射抵抗CAL-27細(xì)胞)、NC組(放射抵抗CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體)、HSF1組(放射抵抗CAL-27細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSF1shRNA干擾慢病毒載體)。取放射抵抗CAL-27細(xì)胞，鋪于T-25培養(yǎng)瓶，細(xì)胞融合率達(dá)30%-40%時加入HSF1sh-NC和HSF1shRNA干擾慢病毒載體，0.5 d后更換培養(yǎng)基，3 d后鏡下觀察，轉(zhuǎn)染4 d后，加入嘌呤霉素(2 μg/mL)，培養(yǎng)2 w后進(jìn)行實驗。

1.6 動物實驗

取18只裸鼠，分為口腔癌抵抗組(注射口腔癌放療抵抗細(xì)胞)、沉默HSF1組(注射轉(zhuǎn)染HSF1慢病毒的口腔癌放療抵抗細(xì)胞)，每組9只。各組大鼠于腋下注射0.5 ml口腔癌細(xì)胞懸液建立模型，待肉眼可見瘤體，表示建模成功。

1.7 檢測指標(biāo)

1.7.1RT-PCR檢測HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7水平

TRIzol法提取總RNA，Primer5.0軟件設(shè)計合成引物。逆轉(zhuǎn)后的cDNA行熒光反應(yīng)實驗。PCR反應(yīng)條件：94℃3 min;95℃30 s、52～59℃30 s、72℃30 s，以GAPDH為參照，共30個循環(huán)，計算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析，引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.7.2流式細(xì)胞儀檢測各組口腔癌細(xì)胞凋亡情況

取各組CAL-27口腔癌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，接種到培養(yǎng)基中過夜，24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗，100 μl接種于5 ml流式試管中，5 μl的IFITCAnnexinⅤ與5 μl PI混合后染色，無光孵育15 min后與結(jié)合緩沖液(400 μl)混勻，PBS清洗，流式細(xì)胞儀測定凋亡。

1.7.3Westernblot檢測HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7水平

取各組CAL-27口腔癌細(xì)胞，胰酶消化后離心5 min，取上清液，用上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中，按照4∶1的比例進(jìn)行，然后在沸水浴中煮沸5 min，采用BCA法測總蛋白濃度，每孔上樣蛋白量20 μg，SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后要放入4℃冰箱內(nèi)預(yù)冷，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在將脫脂奶粉加入其中，封閉1 h。加入HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7一抗(稀釋比例1∶500)后，TBST漂洗3次，每次10 min；4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶2 000)，37℃孵育45 min，TBST漂洗10 min×3次，用DAB試劑盒，在1 ml水中加A、B、C液各1滴，再加于膜上，ECL化學(xué)發(fā)光試劑后凝膠成像系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.7.4雙熒光素酶報告基因

構(gòu)建HSF1真核表達(dá)載體[5]，將人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將構(gòu)建好的TGF-β/Smad2/Smad3-3′-UTR-WT和TGF-β/Smad2/Smad3-3′-UTR-MUT質(zhì)粒與pcDNA3.1-HSF1、pcDNA3.1空載體共轉(zhuǎn)染至CAL-27細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.7.5檢測各組裸鼠瘤體體積

建模成功4 w后處死裸鼠，取出瘤體，游標(biāo)卡尺測瘤體長徑、短徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積=長徑×短徑2/2。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 射線照射對口腔癌細(xì)胞形態(tài)的影響

照射前，CAL-27口腔癌細(xì)胞形態(tài)無變化。放療后，放療抵抗口腔癌細(xì)胞株排列更加紊亂，且細(xì)胞數(shù)目明顯增加，提示CAL-27口腔癌細(xì)胞產(chǎn)生放療抵抗性。見圖1。

圖1 放射前后口腔癌細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2 HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7水平檢測結(jié)果

抵抗組CAL-27口腔癌細(xì)胞中HSF1mRNA、TGF-βmRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA、Smad7

mRNA水平與NC組比較無顯著差異(P>0.05)。與NC組相比，HSF1組CAL-27口腔癌細(xì)胞HSF1mRNA、TGF-βmRNA、Smad2mRNA、Smad3

mRNA水平降低，Smad7mRNA水平升高(P<0.05)，提示HSF1轉(zhuǎn)染成功，且沉默HSF1可抑制TGF-β、Smad2、Smad3表達(dá)。見表2、圖2。

表2 各組各指標(biāo)相對表達(dá)量對比

圖2 HSF1mRNA相對表達(dá)量

2.3 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

抵抗組、NC組及HSF1組CAL-27口腔癌細(xì)胞凋亡率分別為(12.34±0.17)%、(12.41±0.09)%及(54.26±4.25)%，抵抗組CAL-27口腔癌細(xì)胞凋亡率與NC組比較無顯著差異(t=0.891，P=0.394)，NC組細(xì)胞凋亡率低于HSF1組，組間比較差異顯著(t=24.110，P<0.001)。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況對比

2.4 HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7蛋白水平檢測結(jié)果

抵抗組與NC組CAL-27口腔癌細(xì)胞HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平較接近，組間比較無顯著差異(P>0.05)。與NC組相比，HSF1組CAL-27口腔癌細(xì)胞中HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平降低，Smad7蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見表3、圖4。

表3 各組各指標(biāo)蛋白水平對比

圖4 各組指標(biāo)蛋白水平對比

HSF1蛋白與TGF-β蛋白呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.623，P<0.001)，HSF1蛋白與Smad2蛋白呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.671，P<0.001)，HSF1蛋白與Smad3蛋白呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.592，P<0.001)，HSF1蛋白與Smad7蛋白呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(r=-0.654，P<0.001)，見圖5。

圖5 蛋白相關(guān)性分析

2.5 雙熒光素酶報告基因監(jiān)測結(jié)果

通過構(gòu)建含有TGF-β/Smad2/Smad3的野生型或突變型3’-UTR片段的熒光素酶報告質(zhì)粒，pcDNA3.1-HSF1與TGF-β/Smad2/Smad3的3’ UTR序列互補(bǔ)，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，與pcDNA3.1相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HSF1后野生型TGF-β/Smad2/Smad3活性升高，說明HSF1可靶向TGF-β/Smad2/Smad3表達(dá)，見表4。

表4 雙熒光素酶報告基因監(jiān)測

2.6 瘤體體積檢測結(jié)果

口腔癌抵抗組裸鼠瘤體體積(0.28±0.02)cm3明顯高于沉默HSF1組裸鼠瘤體體積(0.17±0.04)cm3，組間比較差異顯著(t=7.379，P<0.001)，見圖6。

圖6 各組裸鼠瘤體體積對比

3 討論

根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，我國2018年口腔癌新發(fā)病例近5萬人次，預(yù)估死亡病例近2.3萬[6]。常見的口腔癌治療方式為放療，但放療容易產(chǎn)生抵抗性，因此，減少放療抵抗性、尋找新的治療靶基因至關(guān)重要。

HSF1具有調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，參與腫瘤產(chǎn)生及發(fā)展的過程。研究顯示[7]，HSF1在癌癥的發(fā)展中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，通過調(diào)控細(xì)胞功能參與腫瘤發(fā)展。越來越多的研究證明HSFl在肝癌[8]、乳腺癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]等癌癥中異常高表達(dá)，并隨著癌癥的嚴(yán)重程度加重而升高。研究表明，高表達(dá)的HSF1是多種腫瘤不良預(yù)后的標(biāo)志，HSFl通過促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色[11]。本研究通過對口腔癌細(xì)胞進(jìn)行照射后建立口腔癌放療抵細(xì)胞，并將該細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSF1shRNA干擾慢病毒載體，抑制其表達(dá)，通過裸鼠瘤體實驗發(fā)現(xiàn)在HSF1表達(dá)下調(diào)后，移植瘤生長受到抑制，且體積明顯減小，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示沉默HSF1表達(dá)口腔癌放療抵抗細(xì)胞的凋亡增加，說明抑制HSF1可降低腫瘤細(xì)胞的活性，促進(jìn)其凋亡。這與王瓊[12]的研究結(jié)果相似，即通過降低HSF1水平后，可抑制口腔癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移能力。

TGF-β被認(rèn)為是一種促癌因子，它可以促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型，另外TGF-β可通過自分泌和旁分泌機(jī)制，激活其相關(guān)通路表達(dá)，從而參與腫瘤的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移。Smads是TGF-β通路下游因子，可將TGF-β介導(dǎo)的信號傳至細(xì)胞核內(nèi)。Smads家族蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同可分為3類：受體調(diào)節(jié)型Smad(Smad1、2、3、5、8)、共同型Smad(Smad4)、抑制型Smad(Smad6、7)。研究表明[13]，TGF-β/Smad信號通路與細(xì)胞凋亡聯(lián)系密切,在細(xì)胞凋亡過程中，TGF-β激活Ⅱ型受體(TβRII),隨后磷酸化Ⅰ型跨膜受體(TβRI),促進(jìn)R-Smad(Smad2和Smad3)表達(dá),Smad2、Smad3是TGF-β1/Smads信號通路上的正向調(diào)節(jié)因子，其C端功能域末端含有保守的磷酸化點位，可與TGF-β受體直接作用并被磷酸化之后形成異三聚體，轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，通過與DNA結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為。Smad7是抑制型Smad，其抑制作用主要表現(xiàn)在為：一方面阻止TGF-β依賴的Smad2/4復(fù)合體的形成，從而抑制Smad2向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運；另一方面，Smad7通過與活化的TGF-β型受體穩(wěn)定結(jié)合，關(guān)閉了受體與其他配體結(jié)合的通道，直接影響磷酸化和Smad2的活化。

研究表明[14]，HSF1在多種腫瘤中均為高表達(dá)。HSFl通過促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，參與腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展。有報道[15]，HSF1 參與腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝，推動腫瘤的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)移，在該代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默HSF1后，與口腔癌放療抵抗細(xì)胞相比較，TGF-β、Smad2、Smad3水平明顯降低，Smad7水平明顯升高，且HSF1與TGF-β、Smad2及Smad3表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)性，與Smad7表達(dá)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。周昊[16]等研究提示，熱療對口腔鱗癌具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能是通過提高Smad7水平，促使Smad2、Smad3表達(dá)受到抑制，從而抑制了腫瘤的生長。研究表明[17]，高表達(dá)的HSF1可通過提高TGF-β水平，促進(jìn)膽囊癌的增殖，加快其病情發(fā)展。本研究與上述研究結(jié)果相似，在口腔癌放療抵抗細(xì)胞中，沉默HSF1水平后，通過降低TGF-β水平促進(jìn)Smad7表達(dá)，從而抑制了Smad2、Smad3水平，抑制了TGF-β/Smad通路的激活，從而增加了口腔癌放療抵抗細(xì)胞的凋亡。通過雙熒光素酶報告基因監(jiān)測結(jié)果證實TGF-β/Smad2/Smad3可能是HSF1的靶向基因。

綜上所述，沉默HSF1表達(dá)可促進(jìn)口腔癌放療抵抗細(xì)胞凋亡，降低裸鼠瘤體體積，其作用機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β/Smad有關(guān)，可提高口腔癌放療敏感性。