微波預(yù)處理對(duì)油茶籽毛油抗氧化性的影響

王龍祥， 羅 凡， 許曉君， 杜孟浩， 方學(xué)智， 鐘海雁

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410004) (中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所2，杭州 311400)

關(guān)鍵字：油茶籽油；微波；總酚；美拉德產(chǎn)物；DPPH

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)常綠小喬木或灌木，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益俱佳的木本油料物種,廣泛種植于我國(guó)南方各省[1]，尤其是在湖南省,油茶籽油占湖南省植物用油的50%以上[2]。截止到2020年，我國(guó)油茶籽種植面積達(dá)6 800萬(wàn)畝，茶油產(chǎn)量約為62.7萬(wàn)t，油茶產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值達(dá)1 160億元。

油茶籽油是從油茶籽仁中提取出來(lái)的植物油，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多酚、角鯊烯[3]、甾醇[4]等多種天然抗氧物質(zhì)，且有些油茶籽油經(jīng)過(guò)高溫預(yù)處理時(shí)會(huì)產(chǎn)生美拉德產(chǎn)物等抗氧化物質(zhì)。茶油的抗氧化性一直是油茶研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前油茶籽油具有較好穩(wěn)定性的主要機(jī)理還未達(dá)成共識(shí)，油茶籽油的氧化穩(wěn)定性可能是多酚、美拉德產(chǎn)物等物質(zhì)的共同作用的結(jié)果[5]。

多酚是國(guó)內(nèi)外研究油茶籽油抗氧化性能時(shí)分析最多的一種抗氧化物，油茶籽油的保健功能與其有密切關(guān)系[6]。劉靂等[7]證實(shí)了油茶籽毛油中極性酚類物質(zhì)的存在，且確定該物質(zhì)與油茶籽油儲(chǔ)藏穩(wěn)定性有關(guān)。李志曉[8]發(fā)現(xiàn)多酚含量與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)陽(yáng)離子自由基清除能力和鐵離子還原能力(FRAP)極顯著相關(guān)。劉靜等[9]發(fā)現(xiàn)油茶籽油的抗氧化活性和防紫外輻射活性與多酚含量相關(guān)。這也與“極性悖論”假說(shuō)有相通之處，“極性悖論”認(rèn)為極性強(qiáng)的抗氧化劑往往在油脂體系中能表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性，因?yàn)橛椭w系中極性強(qiáng)的抗氧化劑容易被排斥到油氣界面從而保護(hù)油脂[10]。

美拉德反應(yīng)，即羰氨反應(yīng)，是由Hodge[11]提出的較為復(fù)雜的氨基化合物和糖基化合物之間的反應(yīng)。其反應(yīng)較為復(fù)雜，故產(chǎn)物也較多且有些產(chǎn)物具有一定的抗氧化性，如羥甲基糠醛[12]、α-羰基化合物[13]等等。5-羥甲基糠醛(5-HMF)是羥甲基糠醛的代表物質(zhì)之一，是美拉德反應(yīng)的重要中間產(chǎn)物，是褐變的指標(biāo)成分之一，且具有一定的抗氧化作用[14]。丙酮醛(MGO)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)是美拉德反應(yīng)中級(jí)階段產(chǎn)生的α-二羰基化合物，具有較高的活性。丙酮醛是一種小分子的高活性二羰基復(fù)合物，在美拉德反應(yīng)中其產(chǎn)生于中級(jí)階段Amadori重排后分解所產(chǎn)生，具有抗腫瘤[15]等活性作用。3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)是美拉德反應(yīng)中產(chǎn)出的一種高反應(yīng)性中間產(chǎn)物[16]。這幾種α-羰基化合物都是美拉德風(fēng)味和色澤的重要前體，具有活性高、穩(wěn)定性低的特點(diǎn)[17]。

在油茶籽預(yù)處理中，微波預(yù)處理是一種較為新的預(yù)處理方式，其是利用高頻電磁場(chǎng)快速改變產(chǎn)生能源，物質(zhì)吸收微波能量后通過(guò)分子的震動(dòng)摩擦將能量轉(zhuǎn)化為熱能。這種加熱的方式具有高效節(jié)能、清潔無(wú)污染的特點(diǎn)[18]。微波預(yù)處理后是否引起油茶籽油的抗氧化能力顯著變化，其內(nèi)部抗氧化物質(zhì)的含量及抗氧能力是否發(fā)生顯著改變，這對(duì)研究油茶籽油的氧化穩(wěn)定性具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以油茶籽仁為原料，經(jīng)微波預(yù)處理測(cè)定油茶籽毛油DPPH、總酚含量及抗氧化能力和美拉德產(chǎn)物的含量，分析微波預(yù)處理對(duì)油茶籽毛油中抗氧物質(zhì)的影響，為油茶籽毛油氧化穩(wěn)定性規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料處理與提取

油茶籽清理除去未成熟、破損和霉變粒后，經(jīng)測(cè)定[19]其含水率為(8.81±0.04)%，油茶籽仁含油率為(37.14±1.09)%。

油茶籽仁處理：油茶籽一定條件微波預(yù)處理后剝殼得到油茶籽仁，通過(guò)液壓榨取油茶籽毛油，冷藏備用。樣品處理?xiàng)l件如表1所示。各功率加熱最大時(shí)間時(shí)溫度依次為120、140、190、220 ℃。

表1 樣品處理?xiàng)l件

DPPH測(cè)定茶油全油樣品制備：參照文獻(xiàn)[20]方法，略做改動(dòng)：稱取0.5 g油茶籽毛油，乙酸乙酯定容。

總酚樣液提取：采用固相萃取提取油茶籽毛油中的總酚[21]。

美拉德產(chǎn)物提取[22]：稱取5 g油茶籽毛油，用甲醇萃取3次后定容至10 mL，冷藏備用。

1.2 試劑與儀器

二醇基固相萃取柱(500 mg·3 mL-1)，福林酚、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(96%，DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(99%，TPTZ)、2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(98%，ABTS)、丙酮醛(MGO)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、5-羥甲基糠醛(5-HMF)、水溶性維生素E(97%，Trolox)、過(guò)硫酸銨、無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸、乙酸乙酯、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、濃鹽酸、氯化鐵、鄰苯二胺、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇，均為分析純；正己烷、甲醇為色譜純。

S-114分析天平，Agilent LC1260Ⅱ液相色譜儀，P70F20L-DG(S0)微波爐，6YY-190自動(dòng)液壓榨油機(jī)，Q-101平行蒸發(fā)儀，Avanti J-E冷凍離心機(jī)，UV-2550紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

1.3 方法

油茶籽毛油DPPH測(cè)定：參考文獻(xiàn)[23]并略做改動(dòng)，定容后取1 mL，與3 mL DPPH乙酸乙酯溶液混合避光反應(yīng)2 h，517 nm測(cè)定吸光值，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，DPPH測(cè)定能力以μg TE/g表示[24]。

總酚測(cè)定：參考文獻(xiàn)[25]，并略作調(diào)整，取1 mL樣品于10 mL具塞試管內(nèi)，加入5 mL 10%福林酚試劑，反應(yīng)8 min 后再分別加入4 mL 7.5% Na2CO3，振蕩10 s后室溫下靜置1 h，765 nm 處測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度以沒(méi)食子酸濃度計(jì)算，以μg GAE/g表示。

總酚ABTS測(cè)定：參考文獻(xiàn)[26]，略作調(diào)整，移取樣品0.5 mL總酚樣液于10 mL刻度試管中，加入ABTS工作液3.5 mL，設(shè)置空白，空白中1 mL水代替樣液，30 ℃水浴6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，DPPH測(cè)定能力以μg TE/g表示。

總酚FRAP測(cè)定：參照文獻(xiàn)[27]，并略作調(diào)整，移取0.2 mL總酚樣液和3.8 mL FRAP溶液混合后，37 ℃水浴黑暗狀態(tài)下放置30 min，在593 nm處測(cè)定其吸光度值，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，DPPH測(cè)定能力以μg TE/g表示。

美拉德產(chǎn)物(5-羥甲基糠醛、丙酮醛、3-脫氧葡萄糖醛酮)測(cè)定：結(jié)合文獻(xiàn)[28，29]并參照課題組之前方法[30]，進(jìn)行測(cè)定。

5-羥甲基糠醛的高效液相色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相A：0.1%冰醋酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇，流速0.7 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，色譜柱型號(hào)：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)器：SPD紫外檢測(cè)器，時(shí)間程序如表2所示。

表2 5-羥甲基糠醛的液相色譜洗脫程序

3-脫氧葡萄糖醛酮、丙酮醛的高效液相色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相A：0.1%冰醋酸溶液，流動(dòng)相B：甲醇，流速：0.8 mL/min，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)314 nm，色譜柱型號(hào)：ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)器：SPD紫外檢測(cè)器，時(shí)間程序如表3所示。

表3 二羰基化合物的液相色譜洗脫程序

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007、SPSS 22、Origin 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽毛油的DPPH含量分析

自由基氧化是常見(jiàn)的食用油氧化原因之一，DPPH自由基清除能力來(lái)評(píng)價(jià)抗氧活性已作為常用標(biāo)準(zhǔn)[31]。微波預(yù)處理油茶籽毛油DPPH含量變化如圖 1所示。油茶籽毛油中DPPH清除自由基能力受微波處理影響顯著。微波功率在420 W時(shí)DPPH隨時(shí)間變化不顯著(P>0.05)，但在245、560、700 W時(shí)，其含量隨著時(shí)間變化顯著增加(P<0.05)。DPPH含量最高為700 W 20 min處，為(337.08±6.07) μg TE/g，是初始含量(232.40±4.74) μg TE/g的1.45倍，最低為700 W、5 min處，為(204.55±9.63) μg TE/g，是初始含量的0.88倍。推測(cè)初始微波加熱時(shí)間較短，油茶籽油抗氧物質(zhì)以消耗為主，隨著時(shí)間和微波功率的增加，抗氧物質(zhì)逐漸從細(xì)胞中溶出，使得DPPH增加。此外，也可能有非抗氧物質(zhì)的轉(zhuǎn)化使DPPH逐漸升高。

圖1 油茶籽毛油中DPPH的含量變化

2.2 總酚含量及抗氧能力分析

2.2.1 總酚含量

微波預(yù)處理油茶籽毛油中總酚含量的變化情況如圖2所示。油茶籽毛油中總酚含量受微波功率影響顯著(P<0.05)。 推測(cè)短時(shí)微波加熱能夠直接破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使得油中酚類物質(zhì)更加容易溶出[32]，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)除了酚類的溶出還有可能一些其他非酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酚類物質(zhì)，使得總酚含量增加較快。由圖2可看出，最高值為700 W 20 min處，為(193.04±9.38)μg GAE/g，為初始(5.13±1.04)μg GAE/g的37.63倍；最低值為245 W 5 min處，(4.43±0.36)μg GAE/g，為初始的0.86倍，推測(cè)可能由于初始功率較低，總酚含量因多酚氧化消耗導(dǎo)致含量降低，但隨著酚類物質(zhì)溶出會(huì)使得總酚含量逐漸升高。245、420、560、700 W的功率下20 min處為最大值，含量分別為245 (12.25±0.86)、(37.66±0.85)、(137.89±6.22)、(193.04±9.38)μg GAE/g，最高與最低相差15.76倍。此外發(fā)現(xiàn)700 W 10 min處總酚的含量有降低再增加的過(guò)程，推測(cè)是由于功率較高，使得初期總酚的消耗較大，但隨著時(shí)間增加多酚物質(zhì)溶出和非酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化又使得總酚含量增加。這與羅凡等[33]研究結(jié)果相一致。

圖2 油茶籽毛油中總酚含量變化

2.2.2 總酚中ABTS分析

微波預(yù)處理油茶籽毛油總酚中ABTS含量變化如圖3所示。油茶籽毛油中總酚ABTS受微波功率影響顯著(P<0.05)。推測(cè)微波功率增加使得總酚溶出率增加導(dǎo)致ABTS增加[34]。ABTS含量最高值為700 W 20 min處，為(192.57±3.71)μg TE/g，是初始值(8.44±0.28)μg TE/g的22.82倍，最低為初始值。每個(gè)功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(26.95±1.18)、(75.24±8.97)、(187.15±4.41)、(192.57±3.71)μg TE/g，最高與最低相差7.14倍。此外發(fā)現(xiàn)700 W 10 min處含量有先降低再升高的現(xiàn)象，這與總酚含量變化類似，經(jīng)測(cè)定ABTS含量與總酚含量具有顯著相關(guān)性(P<0.05),線性相關(guān)系數(shù)為0.98，這與李志曉[8]研究結(jié)果相一致，因此總酚含量降低使得ABTS降低。

圖3 油茶籽毛油總酚中ABTS含量變化

2.2.3 總酚的FRAP分析

微波預(yù)處理油茶籽毛油總酚FRAP含量變化如圖4所示。油茶籽毛油中總酚FRAP受微波功率影響顯著(P<0.05)。推測(cè)微波預(yù)處理屬于內(nèi)部加熱方式，處理使得細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)直接破壞導(dǎo)致溶出率升高，進(jìn)而總酚含量升高，使得FRAP含量增加[35]。FRAP含量最高值為700 W 20 min處，為(295.32±14.11)μg TE/g，是初始含量(4.33±1.62)μg TE/g的68.2倍，最低值為初始值。每個(gè)功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W下含量分別為(23.57±0.32)、(72.92±1.47)、(225.98±16.93)、(295.32±14.11)μg TE/g，最高與最低相差12.53倍。且對(duì)比發(fā)現(xiàn)，總酚對(duì)FRAP的清除能力與ABTS清除能力存在差異，這也說(shuō)明多酚對(duì)不同抗氧化機(jī)制的影響程度也不同。

圖4 油茶籽毛油中FRAP的含量變化

2.3 美拉德產(chǎn)物含量分析

2.3.1 5-HMF含量分析

微波預(yù)處理油茶籽毛油5-HMF含量變化如圖5所示。油茶籽毛油中5-HMF受微波功率影響顯著(P<0.05)。這與江姍姍等[36]研究相一致。5-HMF含量最高為560 W 20 min 處，為(26.76±1.46)μg/g，是初始含量(4.21±0.03)μg/g的6.36倍，最低值為420 W 10 min 處，為(3.99±0.01)μg/g，為初始含量的0.95倍。每個(gè)功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(4.60±0.02)、(10.49±0.10)、(26.76±1.46)、(21.34±0.32)μg/g，最高與最低相差5.82倍。推測(cè)微波預(yù)處理初期，油茶籽細(xì)胞壁較難破壁，5-HMF較難溶出，隨著微波功率增加和時(shí)間延長(zhǎng)，5-HMF逐漸溶出和一些其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成使得其含量增加。但在微波功率為700 W 20 min時(shí)發(fā)現(xiàn)，其含量小于560 W，推測(cè)高功率下，5-HMF隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步反應(yīng)生成糖醛或者類黑素使其含量降低[37]。因此，5-HMF的最適條件為560 W 20 min。

圖5 油茶籽毛油中5-HMF的含量變化

2.3.2 MGO含量分析

微波預(yù)處理油茶籽毛油MGO含量變化如圖6所示。油茶籽毛油中MGO受微波功率影響顯著(P<0.05)。MGO含量最高為700 W 20 min處，為(13.60±2.18)μg/g，是初始含量(1.22±0.01)μg/g的11.15倍，最低為245 W 5-15 min、420 W 10 min處，低于檢測(cè)限；每個(gè)功率下在20 min處具有最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(1.60±0.08)、(4.04±1.16)、(6.72±0.27)、(13.60±2.18)μg/g，最高與最低相差8.5倍。推測(cè)MGO作為美拉德反應(yīng)中級(jí)階段strecker裂解的二羰基產(chǎn)物之一[38]，初期微波頻率較低時(shí)間較短，MGO參與美拉德下一步反應(yīng)生成醛醇類或脫氮聚合物等使得含量降低[39]，隨著功率增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，MGO含量伴隨美拉德反應(yīng)逐漸增加[40]。因此，MGO的最適功率為700 W 20 min。

2.3.3 3-DG含量分析

圖6 油茶籽毛油中MGO的含量變化

微波預(yù)處理油茶籽毛油3-DG含量變化如圖7所示。油茶籽毛油中3-DG受微波功率影響顯著(P<0.05)。3-DG含量最高值在700 W 20 min處，為(75.46±3.79)μg/g，是初始值(2.52±0.12)μg/g的29.94倍，最低為245 W 15 min處，為(2.00±0.26)μg/g，是初始值的0.79倍。每個(gè)功率下20 min處為最大值，245、420、560、700 W條件下的含量分別為(4.34±0.14)、(24.44±6.49)、(73.16±3.69)、(75.46±3.79)μg/g，最高與最低相差17.39倍。推測(cè)3-DG作為美拉德反應(yīng)中高反應(yīng)性中間產(chǎn)物，由于初期微波功率較低和時(shí)間較短，3-DG參與美拉德下一步反應(yīng)生成酮亞胺類使得含量降低，隨著功率增加和時(shí)間延長(zhǎng)，3-DG隨著美拉德反應(yīng)含量逐漸增加[41]。因此，3-DG的最適功率為700 W 20 min。

圖7 油茶籽毛油中3-DG的含量變化

3 結(jié)論

以油茶籽仁為原料，研究微波預(yù)處理對(duì)油茶籽毛油抗氧物質(zhì)的影響。結(jié)果表明微波預(yù)處理對(duì)油茶籽油抗氧能力具有顯著性影響。油茶籽油DPPH自由基清除能力在700 W 20 min處有最大值，為(337.08±6.07)μg TE/g。微波預(yù)處理對(duì)總酚含量及其抗氧化性具有顯著影響，多酚對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力小于鐵離子還原能力。在700 W 20 min時(shí)多酚含量及抗氧能力最高，為(193.04±9.38)μg GAE/g，總酚ABTS為(192.57±3.71)μg TE/g，F(xiàn)RAP為(295.32±14.11)μg TE/g。微波預(yù)處理對(duì)美拉德產(chǎn)物含量具有顯著影響，美拉德產(chǎn)物隨著微波功率增加而增加。5-HMF在560 W 20 min處有最大值(26.76±1.46)μg/g，二羰基產(chǎn)物在700 W 20 min有最大值MGO 為(13.60±2.18)μg/g，3-DG為(75.46±3.79)μg/g。

油脂抗氧化機(jī)制是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，油茶籽油的氧化穩(wěn)定性可能是多酚、美拉德產(chǎn)物、甾醇和角鯊烯等抗氧物質(zhì)共同作用的成果，但如何相互作用需進(jìn)一步研究。