王榕林 馬珮翔 花 蕾 楊 成 郭永東 李俊強(qiáng) 蘇海川

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科，陜西西安 710038

鐵死亡作為一種新型細(xì)胞死亡方式，其誘因主要包括細(xì)胞內(nèi)異常的鐵代謝、脂質(zhì)代謝及谷胱甘肽代謝過程[1]。不同于凋亡自噬及壞死，鐵死亡細(xì)胞線粒體體積變小，線粒體嵴減少及線粒體膜密度增高。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分，其主要包括細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），樹突狀（dendritic，DC）細(xì)胞，自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T（T regulatory，Treg）細(xì)胞，髓源性抑制細(xì)胞（myeloid derived suppressor cell，MDSC），以及腫瘤相關(guān)巨噬（tumor-associated macrophage，TAM）細(xì)胞等細(xì)胞類型。既往研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡參與調(diào)控TIL 的增殖、激活及耗竭等生命進(jìn)程，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，影響免疫檢查點抑制劑的療效，最終參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[2]。為了進(jìn)一步理解鐵死亡對TIL 的調(diào)控作用，現(xiàn)對鐵死亡發(fā)生機(jī)制及其在TIL 中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行綜述，期待能加深對腫瘤發(fā)病機(jī)制的理解，同時為增敏腫瘤免疫治療提供新策略。

1 鐵死亡及其發(fā)生機(jī)制

2003 年，一種新的化合物Erastin 被發(fā)現(xiàn)可以殺死Ras 基因突變的腫瘤細(xì)胞。2008 年，一種類似Erastin的化合物RSL3 可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵代謝及氧化應(yīng)激相關(guān)的死亡方式。2012 年，Valashedi 等[3]首次將這種鐵依賴的細(xì)胞死亡方式命名為鐵死亡。鐵死亡的發(fā)生機(jī)制為胞內(nèi)過載的鐵離子通過芬頓反應(yīng)生成過量羥基自由基。這些自由基通過過氧化細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引起細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時，細(xì)胞自身通過利用谷胱甘肽還原脂質(zhì)過氧化物來抵抗鐵死亡。當(dāng)胞內(nèi)的谷氨酸-胱氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及氧化還原功能發(fā)生紊亂時，細(xì)胞容易發(fā)生鐵死亡[4]。

1.1 鐵離子代謝影響鐵死亡

食物中的鐵離子在近端小腸被吸收入血[5]。鐵離子在血中與轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）結(jié)合。通過與細(xì)胞膜表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFR）結(jié)合形成TF-TFR 復(fù)合物，鐵離子被轉(zhuǎn)運入組織細(xì)胞內(nèi)[6]。鐵離子可與胞內(nèi)的鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)ER）結(jié)合形成儲存鐵[7]。游離的鐵離子也可在鐵轉(zhuǎn)運蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）的協(xié)助下運輸?shù)郊?xì)胞外。病理狀態(tài)下胞內(nèi)游離Fe2+與過氧化氫反應(yīng)生成大量羥基自由基。這些羥基自由基過氧化細(xì)胞膜磷脂雙分子層上的不飽和脂肪酸，降低細(xì)胞膜流動性，引起細(xì)胞膜破裂，誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[8]。

1.2 脂質(zhì)代謝調(diào)控鐵死亡

細(xì)胞膜上含有豐富的多聚不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），其在維持細(xì)胞膜流動性及細(xì)胞基本功能中發(fā)揮重要作用。因為PUFAs 上存在雙烯丙基，所以其很容易被氧化[9]。在脂氧化酶家族（lipoxygenases，LOXs），細(xì)胞色素P450 氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，POR）及羥基自由基作用下，PUFAs 容易被過氧化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[10]。

1.3 谷胱甘肽代謝干預(yù)鐵死亡

細(xì)胞膜上的Xc-系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)將胞外的胱氨酸和胞內(nèi)谷氨酸以1∶1 的比例分別轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)及胞外。進(jìn)入胞內(nèi)的胱氨酸經(jīng)過酶促反應(yīng)最終生成谷胱甘肽[11-12]。在谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的作用下，谷胱甘肽還原胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物，減少細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[13-14]。

2 腫瘤免疫微環(huán)境中的主要免疫細(xì)胞

腫瘤免疫微環(huán)境不僅包括腫瘤細(xì)胞，還包括免疫細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）、信號分子和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。其中，免疫細(xì)胞主要包括CTL 細(xì)胞、DC 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、MDSC 細(xì)胞，以及TAM 細(xì)胞。其中，NK 細(xì)胞主要在腫瘤早期殺傷腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體預(yù)防和殺傷腫瘤的第一道防線。通過其表面的活化受體或抑制性受體識別腫瘤細(xì)胞表面非特異性抗原，直接殺傷腫瘤細(xì)胞[15]。其次，CD8+T 細(xì)胞在抗原呈遞細(xì)胞協(xié)助下激活分化為CTL 細(xì)胞。CTL 細(xì)胞通過分泌穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞因子，殺傷腫瘤細(xì)胞。CTL細(xì)胞是殺傷腫瘤的主力免疫細(xì)胞。除了抗腫瘤免疫細(xì)胞外，機(jī)體同樣存在抑制性免疫細(xì)胞。Treg 細(xì)胞是目前研究最為深入的抑制性免疫細(xì)胞之一。通過分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10、IL-4 等負(fù)性細(xì)胞因子，或者通過CTLA4 及轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等靶標(biāo)直接與目標(biāo)免疫細(xì)胞結(jié)合，抑制目標(biāo)免疫細(xì)胞的增殖與功能，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[16]。類似于Treg，MDSC 同樣發(fā)揮免疫抑制作用。通過分泌精氨酸酶，活性氧和一氧化氮合成酶抑制CTL 及NK 的功能[17]。TAMs 可以分為M1 型（經(jīng)典型巨噬細(xì)胞）和M2 型（替代性活化巨噬細(xì)胞）。其中，M1 型在初生腫瘤中水平較高，具有抗腫瘤作用。隨著腫瘤進(jìn)展，M1 型在腫瘤微環(huán)境中逐漸向M2 型轉(zhuǎn)化。研究證實M2 型TAMs 促進(jìn)腫瘤血管生成，發(fā)揮促腫瘤進(jìn)展作用[18]。

3 鐵死亡對免疫細(xì)胞功能及表型的影響

3.1 鐵死亡在CTL 中的免疫調(diào)節(jié)作用

一項研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點抑制劑激活并誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞分泌γ 干擾素。γ 干擾素負(fù)向調(diào)控腫瘤細(xì)胞表面Xc-系統(tǒng)組成蛋白SLC3A2 和SLC7A11 的表達(dá)，減少胱氨酸的胞內(nèi)運輸和胞內(nèi)谷胱甘肽的生成，加劇胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。人為降低腫瘤細(xì)胞胱氨酸和半胱氨酸水平，可以協(xié)同增強(qiáng)T 細(xì)胞的抗腫瘤作用[19]。另一項研究提示，鐵死亡誘導(dǎo)劑可以增強(qiáng)放療的抗腫瘤效果[20]。過表達(dá)GPX4 或FSP1 可以增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞對鐵死亡的抵抗性，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤免疫作用[21]。相反，在T 細(xì)胞中敲除GPX4，則會加劇T 細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)氧化過程，抑制T 細(xì)胞的增殖能力與免疫功能。這些研究證實鐵死亡參與調(diào)控CTL 的活性與功能，且CTL 影響腫瘤細(xì)胞的鐵死亡水平。然而，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞和CTL 對鐵死亡的敏感性強(qiáng)弱問題存在爭論。有的研究認(rèn)為鐵死亡誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，但對CTL 的影響較小，即鐵死亡誘導(dǎo)劑具有增敏腫瘤免疫治療的效果[22]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，GPX4 抑制劑在體外模型中可以選擇性誘導(dǎo)CTL 發(fā)生鐵死亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存[23]。該問題有待進(jìn)一步的研究與探索。

3.2 鐵死亡在TAM 中的免疫調(diào)節(jié)作用

TAM 主要分為抗腫瘤的M1 型巨噬細(xì)胞和促腫瘤的M2 型巨噬細(xì)胞。既往研究證實，M1 型和M2 型對鐵死亡的敏感性不同。相較于M2 型，M1 型巨噬細(xì)胞表達(dá)更高的誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶，并生成更多的NO 自由基。NO 自由基通過與脂質(zhì)自由基反應(yīng)，減少胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化并抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[24]。胰腺癌中，M2 型巨噬細(xì)胞比例明顯高于M1 型巨噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞以外泌體形式向胞外分泌KRASG12D 蛋白。KRASG12D 蛋白能被巨噬細(xì)胞吞噬，并在胞內(nèi)通過STAT3 介導(dǎo)的方式促進(jìn)脂肪酸過氧化，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型分化，促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸[25]。鑒于M1 的抗腫瘤功能及比例，越來越多的研究者開始研究如何將M2 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1型巨噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，通過聯(lián)用鐵元素有機(jī)納米骨架顆粒和鐵死亡誘導(dǎo)劑，或零價鐵納米顆粒（zero-valent-iron nanoparticle，ZVI-NP），可以誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化[26]。

3.3 鐵死亡在Treg 中的免疫調(diào)節(jié)作用

Treg 是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細(xì)胞亞群，其主要由胸腺來源的天然Treg 和外周性誘導(dǎo)的Treg 組成。Treg 在維持機(jī)體免疫耐受中發(fā)揮重要功能。然而在腫瘤微環(huán)境中，Treg 通過分泌IL-10、TGF-β 等細(xì)胞因子，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[27]。研究發(fā)現(xiàn)，GPX4 對維持Treg 免疫抑制功能至關(guān)重要。敲除Treg 中的GPX4 雖然不影響Treg細(xì)胞的生存，但會增加細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)氧化與鐵死亡水平，抑制Treg 的免疫調(diào)節(jié)功能。敲除GPX4 的Treg 細(xì)胞通過分泌IL-1β 增強(qiáng)TH17 細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫功能[28]。

3.4 鐵死亡在MDSC 中的研究

MDSC 來源于骨髓祖細(xì)胞和未成熟髓細(xì)胞，它是單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體。在腫瘤患者體內(nèi)，腫瘤來源的炎癥因子激活MDSC，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸。既往研究提示，N-酰基鞘氨醇氨基水解酶（N-acylsphingosine amidohydrolase，ASAH2）在MDSC 細(xì)胞中高表達(dá)。通過負(fù)向調(diào)控p53 蛋白水平，ASAH2 抑制HMOX1 蛋白表達(dá)，最終減少活性氧生成，抑制MDSC 發(fā)生鐵死亡[29]。同時，MDSC 掠奪性吸收細(xì)胞間質(zhì)的胱氨酸，抑制抗原呈遞細(xì)胞向間質(zhì)分泌半胱氨酸。這些原因?qū)е耇 細(xì)胞難以從細(xì)胞間質(zhì)獲取足夠的半胱氨酸，T 細(xì)胞功能被顯著抑制[30]。

3.5 鐵死亡在DC 中的研究

DC 攝取處理腫瘤相關(guān)抗原，并以MHC-腫瘤抗原復(fù)合物形式呈遞抗原，激活并促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤。同時DC 也可以通過促進(jìn)NK 細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。既往研究提示，腫瘤組織浸潤的DC 含有更多的脂質(zhì)，因此更容易發(fā)生鐵死亡，從而抑制其抗原呈遞功能[31]。另外，GPX4 抑制劑RSL3 處理可以誘導(dǎo)DC 功能失調(diào)，而PPARG 敲除可以逆轉(zhuǎn)DC功能失調(diào)，維持其抗腫瘤作用[32]。在另一項研究中，Sestrin2 被證實可以抑制LPS 誘導(dǎo)的DC 鐵死亡，進(jìn)而促進(jìn)DC 的生存和功能[33]。

3.6 鐵死亡在NK 細(xì)胞中的作用

NK 細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞，通過穿孔素/顆粒酶途徑，F(xiàn)as 與FasL、TNF-α 與TNFR-1 作用途徑及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤的NK 細(xì)胞中含有更高水平的鐵死亡及脂質(zhì)氧化相關(guān)蛋白。相應(yīng)地，腫瘤浸潤的NK 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯升高，葡萄糖代謝能力顯著降低，NK 細(xì)胞發(fā)生功能紊亂。而在NK 細(xì)胞中激活NRF2 蛋白功能，則可以逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境對NK 細(xì)胞的抑制作用，重新激活NK 細(xì)胞的抗腫瘤功能[34]。

4 小結(jié)

綜上所述，鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式、鐵離子代謝、脂質(zhì)代謝及谷胱甘肽代謝是調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵機(jī)制。TIL 是腫瘤免疫微環(huán)境最重要的組成成分，其決定機(jī)體抗腫瘤免疫活性，調(diào)控腫瘤免疫治療反應(yīng)性。本綜述主要總結(jié)了幾種常見的TIL，歸納了其對鐵死亡的敏感性，并總結(jié)了調(diào)控其敏感性的關(guān)鍵基因。目前，鐵死亡在腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中的研究越發(fā)深入。通過該綜述，旨在進(jìn)一步理解鐵死亡對腫瘤免疫的調(diào)節(jié)作用與潛在機(jī)制，為腫瘤免疫治療提供潛在的增敏靶點。