李興玉 綜述 曹云濤 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科，貴州 遵義 563003

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)于1971 年從貧血羊血漿中發(fā)現(xiàn)并提純[1]，其后利用基因重組技術(shù)克隆出重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythrpoietin，rhEPO)[2]；EPO可促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的分化與成熟、促進(jìn)紅細(xì)胞生成，最先應(yīng)用于治療腎性貧血；兒科領(lǐng)域中EPO 已用于治療早產(chǎn)兒貧血。近來發(fā)現(xiàn)EPO除有促進(jìn)紅細(xì)胞生成作用外，還有廣泛的生物學(xué)活性，特別在神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用越來越受到重視。本文就EPO 及其受體的分布、神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，從分子機(jī)制、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)等方面的最新研究進(jìn)行綜述，以便更深入地了解EPO神經(jīng)保護(hù)作用。

1 EPO產(chǎn)生及分布

促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種分子量為30.4 kDa的糖蛋白，胚胎時(shí)期主要由胎兒肝臟產(chǎn)生，成年后EPO主要由腎臟血管周圍間質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，非造血組織如肝臟、大腦、視網(wǎng)膜也產(chǎn)生EPO，在除腎臟以外的器官中的表達(dá)約占整個(gè)生物體總產(chǎn)量的15%～20%[3]。EPO 通過刺激骨髓中紅細(xì)胞前體細(xì)胞上的EPO 受體(EPOR)來誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成，從而增加其存活、增殖和分化，最終增強(qiáng)攜氧能力。EPO 受體(EPOR)分布并不局限于紅細(xì)胞，在心臟、大腦、視網(wǎng)膜、胰腺和腎臟等許多器官表達(dá)，在這些器官中介導(dǎo)EPO發(fā)揮生物學(xué)作用。當(dāng)暴露于缺氧、創(chuàng)傷和其他刺激時(shí)，EPO 及其受體的表達(dá)上調(diào)，通過多種作用機(jī)制起重要的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。

2 EPO的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

2.1 促進(jìn)神經(jīng)再生、損傷修復(fù)和正常發(fā)育 在腦和血管系統(tǒng)的發(fā)育中EPO 已被證明具有促進(jìn)和刺激神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)功能。通過對小鼠腹腔內(nèi)注射重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)，模擬內(nèi)源性神經(jīng)元EPO/EPOR信號傳導(dǎo)可以增加錐體神經(jīng)元的樹突棘密度，增加成熟的海馬錐體神經(jīng)元的數(shù)量[5-6]。越來越多的研究認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞可以表現(xiàn)出不同的表型，并能對特定的微環(huán)境做出不同的反應(yīng)[7]。在損傷部位同時(shí)存在M1 和M2 兩種小膠質(zhì)細(xì)胞表型，M1 小膠質(zhì)細(xì)胞增加促炎介質(zhì)的分泌，從而損害軸突的再生，相反M2 小膠質(zhì)細(xì)胞可介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)功能并促進(jìn)神經(jīng)再生。EPO 處理后，在腦缺血后同側(cè)皮質(zhì)中M1 標(biāo)志物CD16 和CD11b 的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而M2 標(biāo)志物CD206 的表達(dá)顯著上升，EPO 可以阻止M2 向M1 的轉(zhuǎn)變并保持M2 小膠質(zhì)細(xì)胞表型，修復(fù)腦白質(zhì)完整性[8-9]。根據(jù)最近的一些研究顯示，Janus 激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[10-11]。非紅細(xì)胞生成突變體促紅細(xì)胞生成素(mutant erythropoietin，MEPO)通過JAK2/STAT3 和C/EBPβ信號通路促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向有益的M2 表型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了少突膠質(zhì)細(xì)胞的形成[12]。MEPO可以刺激腦缺血小鼠恢復(fù)期的神經(jīng)再生和血管生成，抑制過度的膠質(zhì)形成，這表明MEPO對非小膠質(zhì)細(xì)胞(包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)具有潛在的作用[13]。EPO通過激活JAK2-PI3K-NF-κB信號通路進(jìn)而上調(diào)神經(jīng)元中生長和分化因子10(Growth and differentiation factor 10，GDF10)的水平，促進(jìn)軸突形成，并呈劑量依賴性[14]。促紅細(xì)胞生成素可減輕樹突棘的損傷和海馬區(qū)的膽堿能功能障礙，通過刺激JAK2/STAT5/PI3K/Akt 信號通路抑制海馬GSK-3β的過度激活。此外，MA等[15]發(fā)現(xiàn)shRNA 對EPO 受體(EPO-R)的基因敲除阻斷了EPO對血管性癡呆(vascular dementia，VD)的神經(jīng)保護(hù)作用，推測促紅細(xì)胞生成素治療能夠通過刺激促紅細(xì)胞生成素受體來修復(fù)血管性癡呆的記憶損害。

2.2 抗氧化活性，調(diào)節(jié)免疫 研究證實(shí)EPO的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1，HIF1)的調(diào)控。HIF1α是細(xì)胞對缺氧和氧化應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活因子和主要調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)過多的適應(yīng)性反應(yīng)，包括谷氨酸和丙酮酸脫氫酶激酶1 促進(jìn)糖酵解而抑制線粒體氧化磷酸化，血紅素氧合酶-1 (Heme oxygenase-1，HO1)和核因子樣2 (NRF2)用于減輕氧化應(yīng)激，減輕腦損傷[16]。腦內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子的上調(diào)、局部小膠質(zhì)細(xì)胞和系統(tǒng)性淋巴細(xì)胞(systemic lymphocytes)的激活以及白細(xì)胞的浸潤是缺血性腦損傷的重要原因，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells)可以拮抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-δ(IFN-δ)的產(chǎn)生，而TNF-α和IFN-δ的產(chǎn)生導(dǎo)致遲發(fā)性炎性腦損傷[17]。免疫系統(tǒng)也參與缺血再灌注損傷，組織修復(fù)和再生的證據(jù)表明EPO 的免疫調(diào)節(jié)作用也可能與其組織保護(hù)作用有關(guān)[18]。JM4是一種源自人類促紅細(xì)胞生成素的第一環(huán)的19'mer 環(huán)狀肽。該肽具有有益的免疫調(diào)節(jié)和組織保護(hù)作用，同時(shí)沒有促紅細(xì)胞生成素所致的血栓栓塞等不良副作用。JM4 進(jìn)行長期治療可延遲PS19 小鼠(一種tauopathy 的動(dòng)物模型)的神經(jīng)功能障礙的發(fā)作并延長其壽命。長期JM4 治療可減少PS19小鼠大腦中的IBA-1和MHC II誘導(dǎo)以及補(bǔ)體成分C3升高(神經(jīng)炎癥)，從而減少神經(jīng)元丟失(神經(jīng)變性)和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。通過慢性JM4 治療降低了包括IL1β和TNF-α在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[19]。

2.3 防止細(xì)胞凋亡，減輕炎癥 Bcl-2家族蛋白，包括促凋亡成員(如Bax)和抗凋亡成員(如Bcl-2)在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。已知裂解的Caspase-3在Bax/Bcl-2的下游起作用，在凋亡的執(zhí)行中也起著關(guān)鍵作用。通過體外氧-葡萄糖剝奪(OGD)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，模擬了體外HIE的狀況[20]。OGD處理可增加Bax 的蛋白表達(dá)并切割Caspase-3。相反，OGD 后Bcl-2 的蛋白表達(dá)以及Bcl-2/Bax 比值降低。與OGD處理相比，EPO 處理可逆轉(zhuǎn)Bcl-2、Bax 和裂解的Caspase 3的蛋白質(zhì)表達(dá)，以及Bcl-2/Bax比[21]。OGD后細(xì)胞凋亡率增加[22]，越來越多的證據(jù)表明EPO可以保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受OGD 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[23-26]。在OGD后源自低溫星形膠質(zhì)細(xì)胞的液體培養(yǎng)基ACM的存在下，裂解的Caspase 3 和TdT 介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記陽性的凋亡神經(jīng)元的數(shù)量要比OGD后從常溫星形膠質(zhì)細(xì)胞存在的ACM 的數(shù)量要少。OGD 后，使用抗EPO 中和抗體阻斷EPO 信號傳導(dǎo)會減弱源自低溫星形膠質(zhì)細(xì)胞的ACM 的抗凋亡作用[27]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重程度與小膠質(zhì)細(xì)胞激活和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的牢固性密切相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞在急性或慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)中起著重要介質(zhì)的作用，過度活化會加劇炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)細(xì)胞變性，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，EPO預(yù)處理可以減弱脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，包括體內(nèi)的形態(tài)學(xué)變化、體外的吞噬作用以及體內(nèi)和體外炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[28]。EPO可通過多種機(jī)制減輕神經(jīng)炎癥，包括減少小膠質(zhì)細(xì)胞活性以及iNOS 和COX-2 的表達(dá)。另外，還調(diào)節(jié)了磷酸化AKT、mTOR和凋亡指示劑(如BAX，BCL-2和裂解的Caspase-3)的表達(dá)。EPO 抑制AKT-mTOR途徑，以減輕燒傷誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞活化[29]。缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)損傷會嚴(yán)重?fù)p害大鼠的神經(jīng)行為表現(xiàn)，包括感覺運(yùn)動(dòng)、自發(fā)運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力。HI 損傷還會在大鼠的白質(zhì)、紋狀體、皮質(zhì)和海馬區(qū)導(dǎo)致腦部炎癥和神經(jīng)元死亡。rhEPO預(yù)處理(對幼鼠進(jìn)行HI 并腹膜內(nèi)注射前1 h 加入rhEPO)和后處理(低氧暴露后1 h，對幼鼠進(jìn)行HI注射rhEPO)均顯著改善了神經(jīng)行為表現(xiàn)，并防止了HI誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，小膠質(zhì)細(xì)胞活化(OX42+)以及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(APC-CC1+)和海馬神經(jīng)元(Nissl+)的丟失。Fluoro-Jade B是一種聚陰離子熒光素衍生物，能敏感且特異性地結(jié)合退化神經(jīng)元，OX42 是小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志CD11b。與用rhEPO 進(jìn)行后處理相比，用rhEPO進(jìn)行預(yù)處理提供了更好的抗炎和抗凋亡作用，通過減少OX42染色(小膠質(zhì)細(xì)胞)和Jade B染色(退化的神經(jīng)元)來表明[30]。

2.4 抗神經(jīng)毒性 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLT-1)和谷氨酸天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLAST)是陽離子依賴性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不僅將谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，而且還可以在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境中維持適當(dāng)?shù)墓劝彼崽荻?。在腦缺血缺氧期間，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放會導(dǎo)致腦損傷。來自動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)的大量證據(jù)表明，高濃度的細(xì)胞外谷氨酸與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。細(xì)胞外谷氨酸誘導(dǎo)的過度神經(jīng)毒性可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[31]。目前的結(jié)果表明，腦缺血再灌注降低了GLT-1 和GLAST 的mRNA 和蛋白水平，而EPO 預(yù)處理顯著提高了缺血再灌注后的這些水平。這表明由于EPO 預(yù)處理而導(dǎo)致的針對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能部分歸因于GLT-1和/或GLAST表達(dá)的上調(diào)[32]。在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)中，β淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)產(chǎn)生和清除平衡障礙導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ過度沉積是AD 主要的發(fā)病原因。Aβ淀粉樣肽的積累與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)，AD中的Aβ肽負(fù)責(zé)離子穩(wěn)態(tài)的丟失，因?yàn)樗軌虼┩讣?xì)胞膜，形成一個(gè)孔，允許陽離子，尤其是鈣離子大量進(jìn)入，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ATP 失衡[33]。促紅細(xì)胞生成素變體(EPOL)具有不同的糖基化模式，其特征是中性的、雙觸角的和α-唾液酸化的結(jié)構(gòu)，保留了神經(jīng)保護(hù)作用，但沒有造血活性。EPOL 對Aβ誘導(dǎo)的毒性具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制涉及EPOR、活性氧的減少和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的減少。此外，EPOL 治療還可以減少由于長期暴露于Aβ而導(dǎo)致的鈣超載。EPOL 還對慢性Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有神經(jīng)保護(hù)作用，其濃度比EPO低10倍[34]，促紅細(xì)胞生成素衍生物有望成為各種神經(jīng)疾病的治療劑。

3 EPO的神經(jīng)保護(hù)作用

3.1 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) GYETVAI 等[35]證實(shí)通過培養(yǎng)野生型中樞神經(jīng)膠質(zhì)4(CG4)細(xì)胞，促紅細(xì)胞生成素可能通過誘導(dǎo)胰島素樣生長因子和增加脂質(zhì)代謝來增加少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘再形成。WENKER 等[36]通過神經(jīng)元細(xì)胞(SH-SY5Y)在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞EOC-2 或巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)生了較多的凋亡，而EPO通過激活EPO/EPOR受體來消除這一效應(yīng)，表明EPO增加了神經(jīng)元對促炎劑造成的損傷的抵抗力。

3.2 體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn) LIU 等[37]誘發(fā)的小鼠早產(chǎn)兒宮內(nèi)感染可導(dǎo)致氨基酸受體NMDA過度活化，然后介導(dǎo)氨基酸的興奮性毒性，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。用重組人促紅細(xì)胞生成素治療后，可以通過抑制氨基酸的興奮性毒性來抑制NMDA 過度活化，促進(jìn)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，對宮內(nèi)感染引起的早產(chǎn)小鼠腦損傷具有一定的治療作用。GOVINDAPPA 等[38]在嚴(yán)重坐骨神經(jīng)擠壓傷小鼠模型(SSCI)中證實(shí)：在輕度至中度坐骨神經(jīng)擠壓傷后，單劑量促紅細(xì)胞生成素治療可促進(jìn)功能恢復(fù)并增強(qiáng)神經(jīng)再生。JUENEMANN 等[39]在建立短暫性中腦動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型中得出：rhEPO 5 000 IU/kg 的單劑量預(yù)處理可顯著減少大鼠短暫MCAO 后24 h 缺血半影區(qū)域的缺血性病變體積并增加局部腦血流。

3.3 EPO 臨床試驗(yàn) 在美國對中度至重度HIE的足月新生兒進(jìn)行的Ⅱ期，多中心、雙盲對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量的EPO 低溫治療缺氧缺血性腦病可降低MRI 腦損傷，特別是在皮層下區(qū)域并改善1 年運(yùn)動(dòng)功能[40]。薈萃分析對四項(xiàng)接受預(yù)防性rhEPO治療的隨機(jī)對照試驗(yàn)中的1 133 名極早產(chǎn)嬰兒(約32 周妊娠)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明經(jīng)校正的18～24個(gè)月大的MDI評估，預(yù)防性rhEPO 改善了早產(chǎn)兒的認(rèn)知發(fā)育，但對其他神經(jīng)發(fā)育結(jié)局無影響[41]。JUUL等[42]在對窒息和腦病試驗(yàn)進(jìn)行的一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EPO在臨床前研究中具有神經(jīng)保護(hù)作用，Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)表明，多次高劑量的EPO可能為足月兒提供抗腦損傷的神經(jīng)保護(hù)。圍產(chǎn)期HIE 新生兒使用EPO 可降低腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)、腦癱和認(rèn)知障礙[43]。但最近有研究表明，從生后24 h 至32 周，對極早產(chǎn)兒進(jìn)行的高劑量rhEPO 隨機(jī)、雙盲試驗(yàn)對2 歲時(shí)嚴(yán)重神經(jīng)發(fā)育障礙或死亡的風(fēng)險(xiǎn)沒有影響[44]。目前促紅細(xì)胞生成素生成素的神經(jīng)保護(hù)作用大多通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人體實(shí)驗(yàn)方面的研究較少，甚至有部分實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)rhEPO沒有神經(jīng)保護(hù)作用，仍需要大量的臨床研究去證實(shí)。

4 結(jié)語

rhEPO 是一個(gè)有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的神經(jīng)保護(hù)劑，其經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，在治療腎性貧血中臨床應(yīng)用多年。然而，關(guān)于EPO在新生兒神經(jīng)保護(hù)中的許多問題仍無確切結(jié)論，還有待進(jìn)一步研究最佳劑量、給藥間隔和時(shí)間等。部分實(shí)驗(yàn)認(rèn)為大劑量的促紅細(xì)胞生成素有相關(guān)的副作用，如血栓形成、紅細(xì)胞增多癥、繼發(fā)性梗死等，促紅細(xì)胞生成素的衍生物應(yīng)運(yùn)而生，具有有益的免疫調(diào)節(jié)和組織保護(hù)作用，同時(shí)缺乏促紅細(xì)胞生成素的不良副作用，研究證實(shí)其同樣存在神經(jīng)保護(hù)作用，這為日后腦損傷治療提供新的藥物選擇。