劉璐琪，申艷紅，宋立琴，石天磊，武軍凱，張立彬

(河北科技師范學(xué)院 園藝科技學(xué)院，河北省特色園藝種質(zhì)挖掘與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066004)

桃果實(shí)是典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后迅速軟化、腐爛變質(zhì)，特別是有些桃品種果實(shí)縫合線局部早熟，主要表現(xiàn)是縫合線局部凸起、軟化、變色，當(dāng)整個果實(shí)達(dá)到適采成熟度時，因該部位過軟而無法運(yùn)輸銷售?？p合線軟化是當(dāng)今桃生產(chǎn)中存在的重要問題之一，有些品種發(fā)病率超過50%，嚴(yán)重影響品質(zhì)和商品價值[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，縫合線軟化部位的木質(zhì)部和韌皮部面積相對較大，維管束發(fā)達(dá)粗大，糖代謝和相關(guān)酶活性都較旺盛[3-4]。桃縫合線部位的生長素(IAA)和玉米素(ZT)含量與縫合線局部軟化具有相關(guān)性[5]。學(xué)者們對導(dǎo)致縫合線軟化的原因進(jìn)行了分析，有學(xué)者認(rèn)為屬于生理性障礙，與缺鈣有關(guān)[6]。劉志民等[2]認(rèn)為，與品種關(guān)系較大，‘大久保’、‘燕紅’等品種發(fā)病率較高，種仁充水、呼吸加強(qiáng)使其提早釋放乙烯，是縫合線軟化的主要原因。目前，關(guān)于桃縫合線早熟的相關(guān)研究大都局限于生理生化水平，相關(guān)分子機(jī)理研究還鮮見報道。

本課題組在‘京紅’桃中獲得了一個芽變。該芽變具有兩個特性，一是晚熟，突變體比野生型的成熟期約晚2周；二是芽變縫合線部位具有局部早熟特性，縫合線部位比果面部位提前兩周變紅，是研究縫合線局部早熟的好材料?；虿町惐磉_(dá)是調(diào)節(jié)桃果實(shí)不同部位成熟進(jìn)程差異的根本原因，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘重要功能基因已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。本研究以‘京紅’野生型果實(shí)為對照，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對芽變果實(shí)的縫合線和果面部位差異表達(dá)基因進(jìn)行比較，挖掘桃果實(shí)縫合線提前成熟相關(guān)基因，分析其表達(dá)規(guī)律，從分子水平上分析果實(shí)不同部位成熟調(diào)控分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及取樣

供試材料為桃品種‘京紅’[Prunuspersica(L.) Batsch. cv. Jinghong wild type，JHW]及其芽變(Jinghong mutant，JHM)的果實(shí)，采自河北省秦皇島市撫寧區(qū)桃園。在桃花后40、60、66、73、82和90 d進(jìn)行果實(shí)采樣，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。每份樣品選擇果實(shí)大小一致、無病蟲害、無損傷的9個果實(shí)進(jìn)行硬度測定。然后，將9個果實(shí)分為3組，將每組3個果實(shí)削去果皮后，將縫合線部位和果面部位的果肉分別切成小塊后混勻，樣品分別編號為WSP(JHW縫合線果肉)、WP(JHW果面果肉)、MSP(JHM縫合線果肉)、MP(JHM果面果肉)，后續(xù)用于花青素含量的測定以及轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 果實(shí)硬度的測定

桃果實(shí)硬度采用TA.XTC-18質(zhì)構(gòu)分析儀(上海保圣實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)進(jìn)行測量，選用TA/2N型號探頭，TPA模式，設(shè)定觸發(fā)點(diǎn)30 gf，目標(biāo)量30 gf，測試速度2 mm/s，得出測定參數(shù)。隨機(jī)選取9個果實(shí)測定縫合線和果面處硬度，用探頭在削去果皮后的果肉處進(jìn)行測定，每個部位測定3次。

1.3 果肉花青素含量的測定

果肉花青素含量的測定參照楊夫臣等[7]的方法。取1.0 g果肉樣品，液氮研磨成粉末后，置50 mL離心管中，加0.1 mol·L-1HCl溶液15 mL，置32 ℃溫箱中浸提8 h，期間搖動數(shù)次，離心，取上清液裝入光徑為1 cm的比色杯中，于530 nm下比色，記錄吸光度值(OD)。3次重復(fù)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因篩選

將花后66 d的4個果實(shí)樣品(WSP、WP、MSP、MP)送到廣州基迪奧生物科技有限公司，使用第二代高通量Illumina HiSeqTM2500測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到clean data后，將reads比對到參考基因組(基因組版本：GCF_000346465.2)上，并利用Cufflinks組裝轉(zhuǎn)錄本，得到已知轉(zhuǎn)錄本與新轉(zhuǎn)錄本。基因表達(dá)量的計算使用FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped reads)法，按照edgeR的一般過濾標(biāo)準(zhǔn)[log2|fold change(FC)| >1 & FDR (false discovery rate) <0.05]篩選差異表達(dá)基因，將篩選得到的差異表達(dá)基因做GO(gene nntology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。

1.5 差異表達(dá)基因的實(shí)時熒光定量表達(dá)分析

以北京博邁德生物技術(shù)有限公司的植物RNA提取試劑盒分別提取‘京紅’及其晚熟芽變果面及縫合線處的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照候選基因序列設(shè)計熒光定量引物(表1)，以桃PpTEF2為內(nèi)參，20 μL熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2.0 μL cDNA，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)，7.0 μL滅菌水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃退火30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，39次循環(huán)。使用購自美國伯樂有限公司的熒光定量PCR儀(Bio-Rad CF CONNECTTMReal-Time System)檢測基因的表達(dá)量。2-ΔΔCT法[8]分析基因表達(dá)的相對變化。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)測定，采用Excel軟件作圖。

表1 熒光定量引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 桃果實(shí)形態(tài)、硬度及花青素含量隨發(fā)育期變化特征

‘京紅’野生型(JHW)及其芽變(JHM)不同發(fā)育時期的果實(shí)形態(tài)比較可以看出，芽變果實(shí)具有晚熟特性，比野生型果實(shí)晚成熟約2周；除此之外，芽變果實(shí)縫合線部位比果面部位局部早成熟。在花后66 d，野生型果實(shí)約為七成熟，此時果皮已轉(zhuǎn)白，縫合線部位和部分果面均為紅色；而花后66 d的突變體果實(shí)，果面仍為綠色，縫合線部位為紅色，此時其果面與縫合線部位成熟度差異較大，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序(圖1，A)。隨著果實(shí)的生長發(fā)育，JHW和JHM果肉硬度均逐漸降低，尤其在花后66 d開始明顯下降；同時，兩種材料果面硬度均大于相應(yīng)時期縫合線部位的硬度，芽變果面和縫合線硬度基本大于同期的野生型(圖1，B)。另外，如圖1，C所示，隨著桃果實(shí)的逐漸成熟，野生型和突變體果實(shí)果面以及縫合線部位的花青素含量均呈上升趨勢；在花后66 d開始明顯上升，且野生型始終高于突變體，突變體中又表現(xiàn)為縫合線始終高于果面。

WP. 野生型果面；WSP. 野生型縫合線；MP. 突變型果面；MSP. 突變型縫合線；下同

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析與基因注釋

將花后66 d的‘京紅’野生型及其芽變果實(shí)的果面和縫合線4個樣品(WP、WSP、MP、MSP)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝和注釋情況見表2。其中，去除接頭、Ploy A、低質(zhì)量序列以及核糖體RNA后，4個樣品WP、WSP、MP、MSP的干凈讀長(Clean Reads)分別為56 527 760、50 253 068、54 834 138、54 811 850，GC含量分布在45.79%～46.06%之間，并且Q20均大于98%，表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)良，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。對所有樣品檢測基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，共檢測到20 108個基因，占桃參考基因組基因總數(shù)(23 128)的86.94%。

表2 測序數(shù)據(jù)組裝和注釋統(tǒng)計表

2.3 差異基因數(shù)目統(tǒng)計與Pathway功能顯著性富集分析

以FDR<0.05且|log2FC|>1為條件篩選差異基因。如圖2所示，WSP相對于WP、MSP相對于MP的差異表達(dá)基因分別為1 297和1 889個；其中，WSP相對于WP的差異表達(dá)基因中561個基因上調(diào)表達(dá)，736個基因下調(diào)表達(dá)；MSP相對于MP的差異表達(dá)基因中1 308個基因上調(diào)，581個基因下調(diào)。由此可見，突變體縫合線與果面之間差異表達(dá)基因數(shù)目遠(yuǎn)多于野生型，尤其是上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量大大增加，這些基因在縫合線與果面之間的差異表達(dá)促進(jìn)了縫合線部位的提早成熟。另外，對突變體縫合線與果面的1 889個差異基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其共參與112種代謝通路，其中Top 20的代謝通路見圖3，主要富集在代謝途徑(metabolic pathways)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction)、苯丙素的生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)等代謝通路。因此，‘京紅’桃突變體果實(shí)縫合線比果面提早軟化和變紅，與這些代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素的生物合成有關(guān)。

圖2 差異基因數(shù)目統(tǒng)計

圖3 MSP與MP之間KEGG富集前20代謝途徑氣泡圖

2.4 桃縫合線部位提前成熟相關(guān)候選基因的篩選與分析

比較突變體桃果面與縫合線部位間差異基因的表達(dá)，篩選出24個縫合線提前成熟相關(guān)的候選基因，包含5個細(xì)胞壁降解相關(guān)基因、9個色素合成相關(guān)基因、5個乙烯合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、3個生長素應(yīng)答基因、2個NAC轉(zhuǎn)錄因子(表3)。

表3 桃果實(shí)縫合線和果面的差異表達(dá)基因

首先，細(xì)胞壁降解相關(guān)基因中包括4個果膠降解酶基因和1個纖維素降解酶基因，分別為果膠酯酶(pectinesterase domain-containing protein，PME)、果膠裂解酶(pectate lyase 5，PL5)、內(nèi)聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase，PG)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase protein，BGAL)和木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 33，XTH33)基因，它們在突變體縫合線部位的表達(dá)量顯著高于果面中的表達(dá)量。

其次，色素合成相關(guān)基因包含2個卟啉葉綠素合成途徑基因，分別為血紅素加氧酶(heme oxygenase 1，HO1)和原葉綠素酸酯氧化還原酶(protochlorophyllide reductase，PORA)基因；5個花青素合成途徑基因，分別為查爾酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(chalcone flavonone isomerase，CHI)、黃烷酮3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)、二氫黃酮還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、原花色素雙加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，ANS)基因；2個花青素合成調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，分別為MYB轉(zhuǎn)錄因子(R2R3 MYB transcription factor 10，MYB10)、bHLH轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor bHLH111-like isoform X1，BHLH)。葉綠素合成途徑關(guān)鍵基因PORA在突變體縫合線部位表達(dá)量低于果面部位，而5個花青素合成途徑基因與2個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)趨勢則與PORA相反，在縫合線部位表達(dá)量顯著高于果面處，這與縫合線部位紅色、果面部位綠色密切相關(guān)。

再次，乙烯在桃果實(shí)成熟的過程中起關(guān)鍵作用，共篩選出5個乙烯合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因。2個乙烯合成關(guān)鍵基因分別為ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS1)、ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase，ACO1)基因，在突變體縫合線部位表達(dá)量是果面部位的數(shù)倍，說明縫合線部位乙烯合成速率顯著高于果面；3個乙烯轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因分別為1個乙烯受體(ethylene receptor 2，ETR2)、2個乙烯應(yīng)答因子(ethylene-responsive transcription factor，ERF)，它們在突變體縫合線部位和果面部位的表達(dá)差異也達(dá)到顯著水平。

另外，有研究表明，生長素可能是桃果實(shí)成熟期乙烯釋放的先決因素，篩選的3個Aux/IAA家族基因在縫合線部位表達(dá)量顯著高于果面部位。此外，還篩選了2個參與果實(shí)成熟調(diào)控的NAC轉(zhuǎn)錄因子——NAC2和NAC72，二者具有相似的表達(dá)趨勢，在縫合線部位的表達(dá)量均低于果面部位，NAC2在縫合線部位的表達(dá)量約為果面部位的1/2。

進(jìn)一步對差異表達(dá)基因進(jìn)行了熱圖分析(圖4)可知， 24個差異表達(dá)基因的表達(dá)模式聚類為三大組。一組是PORA、NAC72、NAC2和ERF105，這4個基因在野生型縫合線和果面的表達(dá)量相當(dāng)，而在突變體縫合線部位的表達(dá)量顯著高于果面；一組是花青素合成相關(guān)基因BHLH、MYB10、ANS、CHI、CHS、F3H、DFR，以及細(xì)胞壁降解基因BGAL、XTH33，這一大組基因在野生型桃果實(shí)的縫合線和果面表達(dá)量較低且無顯著差異，而在突變體縫合線部位大量表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于果面；另一組是剩余的11個基因，它們在野生型桃果實(shí)中的表達(dá)量較高，在突變體縫合線與果面中差異表達(dá)。

圖4 差異表達(dá)基因的熱圖分析

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

對12個差異表達(dá)候選基因進(jìn)行了熒光定量驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，對比熒光定量與RNA-seq兩種技術(shù)獲得的差異基因表達(dá)趨勢，二者基本一致，這進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

圖5 用熒光定量PCR分析12個差異表達(dá)基因的相對表達(dá)量

3 討 論

纖維素和果膠的降解是導(dǎo)致果實(shí)軟化的直接原因。劉志民等[2]發(fā)現(xiàn)，縫合線易軟桃品種在果實(shí)成熟初期縫合線部位的果膠酶活性較高，說明果膠降解在縫合線軟化中起作用。通過比較‘京紅’突變體縫合線與果面部位基因的差異表達(dá)，篩選了5個細(xì)胞壁降解相關(guān)基因，其中PME、PL5、PG和BGAL參與果膠降解，在縫合線部位的表達(dá)量顯著高于果面數(shù)倍，尤其是PG基因在突變體縫合線的_fpkm值高達(dá)360，是突變體果面_fpkm(44)的8倍，說明縫合線提前軟化與PG基因的高表達(dá)密切相關(guān)，PG在多種果實(shí)軟化中的重要作用已經(jīng)被證實(shí)[9-10]。另外，纖維素降解酶基因XTH33在縫合線中的表達(dá)量也顯著高于果面，超過了10倍，說明在縫合線果膠降解的同時也伴隨著纖維素降解。

桃果實(shí)顏色與葉綠素、類胡蘿卜素和花青素含量相關(guān)[11-12]。在桃果實(shí)成熟過程中，綠色逐漸褪去，紅色逐漸出現(xiàn)，說明桃果實(shí)轉(zhuǎn)色伴隨著花青素含量增加和葉綠素的減少。本研究篩選出了9個色素合成相關(guān)基因。其中，HO1和PORA為卟啉與葉綠素代謝途徑基因，隨著果實(shí)成熟葉綠素合成關(guān)鍵基因PORA表達(dá)量降低，減少了葉綠素合成；同時，CHS、CHI、F3H、DFR、ANS為花青素合成途徑基因，在突變體縫合線處表達(dá)量為果面處的2倍以上，其中CHS與DFR基因的MSP/MP_fpkm倍數(shù)最高，分別為17和10，說明CHS和DFR基因的高表達(dá)促進(jìn)了桃縫合線部位提早變紅，這與Tsuda等[13]的CHS和DFR為花青素合成關(guān)鍵基因的結(jié)果一致。另外，前人已經(jīng)證實(shí)，R2R3-MYB和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在花青素合成中具有重要調(diào)控作用[14-15]。在本研究中，MYB10與bHLH在‘京紅’野生型縫合線與果面部位的表達(dá)量相當(dāng)，而在突變體的兩部位間表達(dá)量差異顯著，變化趨勢與花青素合成途徑基因一致，推測它們是桃花青素合成調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子。

桃是呼吸躍變型果實(shí)，乙烯含量增加會促進(jìn)果實(shí)迅速成熟衰老[16-17]。在桃縫合線易軟品種中，縫合線處的乙烯含量明顯高于果面處[18-19]。ACC合成酶(ACS1)與ACC氧化酶(ACO1)是乙烯合成過程中的限速酶，本研究中ACS1與ACO1在突變體縫合線部位的表達(dá)量是果面部位的3倍，顯著提高了縫合線部位的乙烯合成速率；同時還檢測到差異表達(dá)的乙烯受體基因ETR2，以及2個乙烯應(yīng)答因子ERF1B和ERF105。研究表明，有些ERF參與了果實(shí)成熟過程，甜橙CitERF6通過上調(diào)葉綠素降解基因CitPPH的表達(dá)促進(jìn)果實(shí)褪綠；桃PpeERF2、番木瓜CpERF9通過抑制相關(guān)細(xì)胞壁降解酶基因的表達(dá)，推遲果實(shí)軟化[20-21]。本研究篩選的ETR2與ERF基因在桃突變體縫合線成熟過程中的具體作用還需進(jìn)一步研究。除了以上基因，有些生長素相關(guān)基因也通過調(diào)控乙烯釋放量參與果實(shí)成熟調(diào)控。在桃果實(shí)成熟過程中，ACS1與生長素合成限速酶基因YUCC11的表達(dá)趨勢相同[22]；生長素原初響應(yīng)基因(Aux/IAA)與ACS1、YUCC11基因共表達(dá)，可能參與了桃果實(shí)成熟調(diào)控[23]。本研究中的3個Aux/IAA家族基因在突變體縫合線部位的表達(dá)量高于果面，與ACS1和ACO1表達(dá)趨勢一致，這與前人研究結(jié)果相符。

此外，桃縫合線部位的早熟也與其特殊的結(jié)構(gòu)相關(guān)。桃果實(shí)為真果，由單心皮雌蕊發(fā)育而成，雌蕊由葉子演化而來，縫合線相當(dāng)于葉子的葉緣位置，發(fā)育為種子的胚珠著生在縫合線上。在縫合線易軟桃品種中縫合線部位維管束粗大發(fā)達(dá)，韌皮部和木質(zhì)部面積也相對較大，腺腔發(fā)達(dá)[3]。

綜上所述，‘京紅’桃芽變縫合線部位比果面部位局部早成熟約2周，在花后66 d，縫合線與果面部位差異表達(dá)基因1 889個，從中篩選到24個縫合線早熟相關(guān)基因，包含5個細(xì)胞壁降解相關(guān)基因，9個色素合成、調(diào)控相關(guān)基因，5個乙烯合成與轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，3個生長素應(yīng)答基因和2個NAC轉(zhuǎn)錄因子。通過分析這些基因的差異表達(dá)推測縫合線部位局部早熟的原因。桃種仁產(chǎn)生的乙烯從縫合線向周圍擴(kuò)散，促進(jìn)ACS1和ACO1等基因的轉(zhuǎn)錄，合成了較多乙烯，乙烯又進(jìn)一步調(diào)控該部位PG、XTH33、CHS、DFR等細(xì)胞壁降解與色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致該部位的提前成熟。