法螺G型溶菌酶重組蛋白的原核表達(dá)及抑菌活性探究

賈慧霞, 張 華, 張成龍, 何毛賢, 劉文廣

法螺G型溶菌酶重組蛋白的原核表達(dá)及抑菌活性探究

賈慧霞1, 2, 張 華1, 3, 張成龍4, 何毛賢1, 3, 劉文廣1, 3

(1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州), 廣東 廣州 511458; 4. 三沙市海洋和漁業(yè)局, 海南 三沙 573199)

G型溶菌酶(G-type lysozyme,)是一種富含半胱氨酸的天然免疫因子, 在無脊椎動(dòng)物的免疫防御過程中起重要作用。本研究旨在通過揭示法螺() G型溶菌酶()重組蛋白的抑菌功能, 為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)法螺的分子免疫機(jī)理及病害防治提供新思路。首先對(duì)序列進(jìn)行了分析, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的組織分布, 然后以pGEX-4T-1為表達(dá)載體, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-, 進(jìn)行重組蛋白表達(dá), 并檢測(cè)了重組蛋白的抑菌活性。結(jié)果顯示: 1)cDNA的5′非翻譯區(qū)(UTR)為66 bp, 3′UTR為186 bp, 開放閱讀框?yàn)?89 bp, 編碼262個(gè)氨基酸, 有1個(gè)可溶性轉(zhuǎn)糖苷酶(SLT)結(jié)構(gòu)域(72～255 aa), 包含6個(gè)半胱氨酸殘基和3個(gè)酶活性催化位點(diǎn)(Glu72、Asp85、Asp96); 2) 多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析表明,與親緣關(guān)系較近的福壽螺G型溶菌酶氨基酸的同源性最高; 3)在所有被檢測(cè)組織中均表達(dá), 其中在肝臟、外套膜表達(dá)量較高; 4) 16 ℃, 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10 h后, 重組蛋白在上清液和包涵體均表達(dá)分子量約為51.91 kDa, 純化后得到濃度為1.2 mg/mL的重組蛋白; 5) 抑菌實(shí)驗(yàn)表明, 重組蛋白pGEX-4T-1-具有抗金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、施羅氏弧菌的活性, 對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌作用大于革蘭氏陰性細(xì)菌。研究結(jié)果為進(jìn)一步解析法螺免疫防御的分子機(jī)理提供了參考數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

法螺; G型溶菌酶; 原核表達(dá); 抑菌活性

溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子, 與抵御細(xì)菌感染的免疫功能密切相關(guān)[1]。在水產(chǎn)動(dòng)物抵抗外來病原細(xì)菌、真菌或病毒入侵時(shí), 溶菌酶能增強(qiáng)其他免疫因子的抗菌活性, 并協(xié)同抵制病原菌的入侵[2-3]。溶菌酶是一種天然的堿性抗菌蛋白, 通過水解肽聚糖β-1, 4糖苷鍵發(fā)揮溶菌功能[4-5]。根據(jù)來源、免疫特性、結(jié)構(gòu)及催化特征的不同, 動(dòng)物體內(nèi)的溶菌酶主要分為G型、C型和I型, 廣泛存在于免疫器官和細(xì)胞中[6]。C型溶菌酶主要存在于脊椎動(dòng)物中; I型溶菌酶主要分布在無脊椎動(dòng)物中; G型溶菌酶最早因從鵝蛋清(goose egg-white)中分離、鑒定而得名, 主要存在于鳥類、魚類及無脊椎的雙殼軟體動(dòng)物中[7]。近年來, 關(guān)于水生動(dòng)物G型溶菌酶的報(bào)道日漸增多, 如長牡蠣[8]()、櫛孔扇貝[9]()、紫貽貝[10]()和膨腹海馬[7]()等中發(fā)現(xiàn)G型溶菌酶在不同組織中發(fā)揮一定的免疫防御作用。然而, 其在腹足綱軟體動(dòng)物法螺()中的作用還未見有報(bào)道。

法螺()隸屬于嵌線螺科(Rane-llidae)、法螺屬[11](Charonia)。法螺的殼有美麗的花紋, 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12-13]。法螺是珊瑚礁敵害生物——長棘海星的天然捕食者, 是珊瑚礁的衛(wèi)士, 在維持珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)平衡中具有重要作用。近年來, 法螺自然資源由于環(huán)境污染和過度捕撈被嚴(yán)重破壞[14-15], 在中國南海海域面臨滅絕的危險(xiǎn), 被列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[16], 因此亟需開展相關(guān)研究。在前期工作中, 團(tuán)隊(duì)在陸上水泥池對(duì)中法螺進(jìn)行了養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn), 在2020年6—7月, 法螺發(fā)生病害, 死亡嚴(yán)重。在感染初期, 我們對(duì)法螺足、外套膜、腮等組織進(jìn)行了細(xì)菌檢測(cè), 結(jié)果鑒定出的病原菌主要包括弧菌和葡萄球菌。由此, 我們推測(cè)法螺在飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)的病害可能是細(xì)菌感染引起的。因此, 本研究通過分析法螺溶菌酶基因的結(jié)構(gòu), 鑒定其為G型溶菌酶。同時(shí), 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在法螺不同組織中的表達(dá)情況, 并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)法螺G型溶菌酶重組蛋白、分析重組蛋白的抑菌功能, 為認(rèn)識(shí)法螺的免疫機(jī)理和病害防控提供資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

法螺組織: 法螺收集于南海海域, 暫養(yǎng)在廣東省雷州市養(yǎng)殖基地。取3只大小一致、生長狀況良好個(gè)體, 剖取其外套膜、足、觸手、長鼻、唾液腺、腸及肝臟組織立即于液氮速凍, 然后保存于–80 ℃超低溫冰箱。

菌株, 質(zhì)粒和試劑: 大腸桿菌DH5α和pGEX-4T-1載體由本實(shí)驗(yàn)室保存; 大腸桿菌(BL21)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司; 藤黃微球菌、腸炎沙門氏菌、溶藻弧菌、施羅氏弧菌由中國科學(xué)院南海海洋研究所宋永相老師惠贈(zèng); 金黃色葡萄球菌由中國科學(xué)院南海海洋研究所向志明老師惠贈(zèng)?？俁NA提取試劑盒購自Magen公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Toyobo公司; T4 DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI均購自TaKaRa公司; genefist三色預(yù)染蛋白marker 10-180KD(protein marker)購自廣州捷承科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析及所用軟件

使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)查找開放閱讀框(ORF); 利用ClustalX及CLC Main Workbench 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì); 氨基酸結(jié)構(gòu)域分析使用SMART(http:// smart.embl-heidelberg.de/)。通過ProtParam(https:// web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列各項(xiàng)理化性質(zhì); 通過SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)預(yù)測(cè)是否含有信號(hào)肽; 利用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域; 通過MEGA 6.0軟件, 用循環(huán)鄰接法Nei-ghbor joining構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹, 置信度檢驗(yàn)1 000次。

1.3 RNA提取、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用通用型RNA提取試劑盒(Magen)提取組織RNA, 用紫外可見光譜儀測(cè)定其濃度, 瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA條帶完整性。然后, 使用去除gDNA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo)進(jìn)行cDNA第一鏈合成。用384孔板配置反應(yīng), 每孔總反應(yīng)體系為10 μL, 包括: 5 μL qPCR反應(yīng)酶(Toyobo)、0.3 μL正向引物和0.3 μL反向引物(序列見表1)、3.4 μL雙蒸水及用雙蒸水稀釋的1 μL模板cDNA。反應(yīng)程序設(shè)置為94 ℃預(yù)變性3 min, 98 ℃變性10 s, 退火溫度根據(jù)引物TM值設(shè)置為59 ℃、25 s, 預(yù)變性循環(huán)1次, 變性退火延伸循環(huán)45次; 18S為內(nèi)參基因, 重復(fù)3次。根據(jù)2?ΔΔCt法計(jì)算的表達(dá)量, 用Prism 8.0的T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 本研究中所用引物

1.4 重組表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性檢測(cè)

1.4.1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

PCR反應(yīng)擴(kuò)增(引物序列見表1, 下劃線堿基為EcoRI, NotI酶切位點(diǎn), 粗體堿基為保護(hù)基團(tuán)), 擴(kuò)增體系25 μL: 引物0.5 μL, 模板cDNA 1 μL, Ex Taq 保真酶12.5 μL, ddH2O 10.5 μL。循環(huán)參數(shù): 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃、15 s, 58 ℃ 15 s, 72 ℃、1 min, 32個(gè)循環(huán), 72 ℃終延伸1 min。將目的基因PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pGEX-4T-1經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI, NotI(TaKaRa 1611, 1623)進(jìn)行雙酶切反應(yīng), 后用T4 DNA酶(TaKaRa 2011A)低溫連接, 按1∶20比例將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取單菌落至LB(含氨芐)液體培養(yǎng)基, 經(jīng)菌落PCR測(cè)定后送華大基因測(cè)序鑒定, 重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-。將測(cè)序正確的pGEX-4T-1-轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。取50 μL已轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒菌株接種于含100 mg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中, 次日挑取單菌落至5 mL LB(含氨芐)液體培養(yǎng)基37 ℃, 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6; 加入IPTG至終物質(zhì)的量濃度1.0 mmol/L, 37 ℃, 200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)4 h后收菌。以未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒作為對(duì)照, SDS-PAGE法檢測(cè)全菌中目的蛋白表達(dá)情況。

1.4.2 重組蛋白的可溶性檢測(cè)

取3管20 mL OD600=0.4～0.6的pGEX-4T-1-菌液分別加入0.5 mmol/L IPTG(以未誘導(dǎo)菌液為對(duì)照)。分別在20 ℃、16 ℃誘導(dǎo)10 h后各收集5 mL菌液, 用PBS緩沖液重懸菌液并超聲破碎, 4 ℃, 6 000 g離心10 min, 分別收集上清和沉淀, 分別取100 μL上清液和沉淀高溫變性。SDS-PAGE電泳檢測(cè)破碎上清液(可溶性)和沉淀(包涵體)中重組蛋白表達(dá)情況。

1.5 重組蛋白的純化

收集400 mL誘導(dǎo)后的菌液, 用PBS洗滌菌體, 按1∶20比例重懸菌體, 冰浴超聲波破碎, 離心收集上清液。利用GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司P2262), 按產(chǎn)品說明書純化重組蛋白。收集的洗脫液即為純化的蛋白樣品, SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的重組蛋白。取純化后的蛋白樣品, 按5倍比例稀釋后用BCA法(BCA蛋白定量試劑盒上海雅酶生物科技有限公司ZJ101)測(cè)定純化后的蛋白濃度。樣品設(shè)置5個(gè)重復(fù), 以牛血清白蛋白BSA, 用PBS稀釋至終質(zhì)量濃度為2 mg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 用酶標(biāo)儀(Tecan infinite 200Pro)測(cè)定562 nm處標(biāo)準(zhǔn)品和純化重組蛋白的吸光度值, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

1.6 重組蛋白的抑菌活性鑒定

選取革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和革蘭氏陰性細(xì)菌腸炎沙門氏菌、溶藻弧菌及施羅氏弧菌劃線活化, 挑取活化后的單菌落過夜培養(yǎng), 次日按10%的接種量加到LB液體(弧菌另加2.5%海鹽)培養(yǎng)基中發(fā)酵至OD600為0.5備用。采用平板涂布法[17-19], 以1∶100(V∶V)與純化后的重組蛋白混合, 按各菌株的培養(yǎng)條件, 培養(yǎng)2 h后取100 μL涂布于LB(或含2.5%海鹽)平板, 以不加重組蛋白、用純化時(shí)收集的pGEX-4T-1-流穿液涂布作為對(duì)照。

采用液體生長抑制法[20], 用無菌的PBS溶液將純化后的法螺溶菌酶重組蛋白稀釋至終濃度為120、140、204、220 μg/mL, 各取100 μL培養(yǎng)至OD600為0.5的金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、腸炎沙門氏菌、溶藻弧菌及施羅氏弧菌菌液備用, 與各取100 μL稀釋至所需濃度的重組蛋白混合均勻, 加入至96孔板中, 重復(fù)3次, 以不加重組蛋白用PBS代替的孔作為對(duì)照, 37 ℃、28 ℃過夜培養(yǎng), 用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔與對(duì)照孔中各菌株的生長情況判斷, 當(dāng)菌液吸光值沒有明顯增加且肉眼觀察無明顯細(xì)菌增長時(shí)[21], 該孔對(duì)應(yīng)的蛋白濃度即為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 法螺溶菌酶基因CtG.lys序列特征

全長cDNA編碼1 041 bp cDNA, 855 bp CDS序列, 其中5′UTR為66 bp, 3′UTR為186 bp, ORF為789 bp, 編碼262個(gè)氨基酸。ProtParam預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子式C1098H1703N333O354S21, 相對(duì)分子質(zhì)量25.91 kDa, 理論等電點(diǎn)(PI)是7.95; 氨基酸含量較高的有: Gly(14.3%)、Ser(9.4%)、Ala(9.0%)、Asn(6.9%)、Leu(5.3%); 含16個(gè)帶負(fù)電氨基酸(Asp + Glu)、含18個(gè)帶正電氨基酸(Arg + Lys); 脂肪系數(shù)60.20, 總平均親水性為–0.372, 屬于親水性蛋白。

SignaIP 5.0分析結(jié)果表明該蛋白有信號(hào)肽存在, 且位于17與18位氨基酸之間, 該蛋白為分泌蛋白。SMART分析表明該成熟肽有1個(gè)轉(zhuǎn)糖苷酶(SLT)結(jié)構(gòu)域, 位于72～255 aa; TMHMM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL對(duì)氨基酸序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè), 用同源建模法進(jìn)行模型創(chuàng)建, 非洲鴕鳥()(GenBank No.: 3wyh_A)為模板。建模的結(jié)果如圖1所示: 預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)符合G型溶菌酶蛋白結(jié)構(gòu), 包含7個(gè)α螺旋,的催化位點(diǎn)氨基酸殘基(Glu72、Asp85、Asp96)與模板蛋白(Glu73、Asp86、Asp97)的空間位置幾乎一致, 含有6個(gè)半胱氨酸殘基。

2.2 法螺溶菌酶CtG.lys系統(tǒng)進(jìn)化

NCBI氨基酸一致性分析顯示法螺氨基酸序列與海蝸牛(登錄號(hào): XP_012944836.1)、福壽螺(登錄號(hào): XP_025083688.1)氨基酸一致性較高, 分別為45.11%和45.95%。與斑馬魚(登錄號(hào): NP_001076289.1)和原雞(登錄號(hào): XP_040517238.1)的一致性較低, 分別為39.67%和32.43%; 多序列比對(duì)顯示,與海蝸牛同源性較為一致(圖2)。不同物種系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示, 福壽螺和海蝸牛首先聚為一支, 其次與法螺聚為一支, 表明法螺與福壽螺和海蝸牛親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖1 法螺CtG.lys(紅色)與非洲鴕鳥的溶菌酶G.lys (綠色)三維結(jié)構(gòu)

圖2 法螺CtG.lys與多物種同源蛋白序列比對(duì)

注: 黑色背景堿基保守性≥50%, 灰色代表堿基相似

圖3 法螺CtG.lys與其他物種溶菌酶G.lys的鄰接法(N-J)系統(tǒng)進(jìn)化分析(置信度檢驗(yàn)1 000次)

2.3 法螺CtG.lys基因在不同組織表達(dá)分析

qRT-PCR檢測(cè)在法螺不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示表達(dá)具有明顯的組織差異性, 在肝臟表達(dá)量最高, 外套膜、唾液腺、腸次之, 與其他組織相比差異顯著(圖4)。

圖4 法螺CtG.lys在不同組織的表達(dá)

注: 各組間含有不同字母表示差異顯著(0.05), 含相同字母表示無差異

2.4 重組蛋白pGEX-4T-1-CtG.lys原核表達(dá)及可溶性檢測(cè)

重組工程菌大腸桿菌BL21-pGEX-4T-1-經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量約為51.91 kDa的融合蛋白, 以蛋白分子量10～180 kDa Maker(Genefist GF6616)為參考, 而對(duì)照組未誘導(dǎo)的DE3-pGEX- 4T-1-(圖5泳道1)則無此特異性條帶。由于法螺溶菌酶的蛋白分子量約為25.91 kDa, 且pGEX-4T-1包含的GST標(biāo)簽蛋白分子量約為26 kDa, 故全菌中重組蛋白大小約為51.91 kDa(圖5泳道2～9), 說明增加的蛋白條帶就是重組菌株被誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白產(chǎn)物。

圖5 pGEX-4T-1-CtG.lys重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

注: 1: 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(pGEX-4T-1-)全菌蛋白; 2～9: IPTG誘導(dǎo)的BL21(pGEX-4T-1-)全菌蛋白; M: 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker; 箭頭指示條帶為重組蛋白

重組工程菌大腸桿菌BL21-pGEX-4T-1-經(jīng)20 ℃、16 ℃, 0.5 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h后, 收集菌體, PBS洗滌重懸。經(jīng)超聲波破碎后, 離心收集上清液和包涵體沉淀。將蛋白分子量10～180 kDa Maker(Genefist GF6616)、破碎上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 檢測(cè)pGEX-4T-1-重組蛋白的可溶性。結(jié)果顯示, 20 ℃, 0.5 mmol/L誘導(dǎo)10 h重組蛋白只以包涵體的形式存在(圖6a泳道6), 而16 ℃, 0.5 mmol/L誘導(dǎo)10 h時(shí)重組蛋白同時(shí)在上清(圖6b泳道5～8)和包涵體中表達(dá)(圖6b泳道1～4)。

圖6 pGEX-4T-1-CtG.lys重組蛋白可溶性SDS-PAGE分析

注: a: 1. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(pGEX-4T-1-)全菌蛋白; 2～5. IPTG誘導(dǎo)的BL21(pGEX-4T-1-)上清液; 6. IPTG誘導(dǎo)的BL21(pGEX-4T-1-)包涵體; M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker; 箭頭指示條帶為重組蛋白; b: 1～4. IPTG誘導(dǎo)的BL21(pGEX-4T-1-)包涵體; 5～8. IPTG誘導(dǎo)的BL21 (pGEX-4T-1-)上清液; 9. 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21 (pGEX-4T-1-)全菌蛋白; M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker; 箭頭指示條帶為重組蛋白

2.5 重組蛋白pGEX-4T-1-CtG.lys的純化

通過親和層析柱去除未結(jié)合的蛋白, 收集此時(shí)的流穿液。用裂解液洗脫親和層析柱, 收集洗脫液; 再用含GST的洗脫緩沖液, 將GST融合蛋白從樹脂上洗脫下來, 即得到純化的融合蛋白。將蛋白分子量10～180 kDa Maker(Genefist GF6616)、流穿液(圖7a泳道1)、洗脫液(圖7a泳道2～3)、純化的融合蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定, 均可見到明顯的目的蛋白, 表示純化成功結(jié)果見(圖7a 泳道4～10)。測(cè)定純化重組蛋白濃度繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7b。

圖7 pGEX-4T-1-CtG.lys重組蛋白SDS-PAGE純化分析及BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線

注: M: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. 上樣流穿液; 2～3. 洗滌液; 4～10. 洗脫純化后的蛋白; 箭頭指示條帶為純化后的重組蛋白

2.6 重組蛋白pGEX-4T-1-CtG.lys的抑菌活性

平板涂布法的抑菌活性測(cè)定結(jié)果顯示, 純化后的重組蛋白(圖8實(shí)驗(yàn)組)與革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌; 革蘭氏陰性細(xì)菌腸炎沙門氏菌、溶藻弧菌及施羅氏弧菌作用后, 菌落數(shù)明顯少于對(duì)照組(圖8對(duì)照組)。其中法螺溶菌酶重組蛋白作用后金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、施羅氏弧菌與對(duì)照組相比菌落數(shù)明顯減少; 腸炎沙門氏菌、溶藻弧菌的菌落數(shù)與對(duì)照組相比數(shù)量較少不明顯(圖8)。這表明法螺溶菌酶重組蛋白對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌作用大于革蘭氏陰性細(xì)菌。采用液體生長抑制法測(cè)定重組蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、施羅氏弧菌的最小抑菌濃度, 結(jié)果表明, 重組蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為70 μg/mL; 對(duì)藤黃微球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為104 μg/mL; 對(duì)施羅氏弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為110 μg/mL。

圖8 法螺G型溶菌酶重組蛋白的抑菌效果

3 討論

溶菌酶能誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答, 具有抗菌、抗炎癥特性[22], 是一種天然的內(nèi)源性抗生素[23]。水生動(dòng)物溶菌酶較陸生動(dòng)物溶菌酶具有更廣的抗菌譜, 能溶解革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[24], 使其在病害防治中有很好的應(yīng)用前景。本研究利用同源建模法構(gòu)建的蛋白三維結(jié)構(gòu)表明, 法螺的SLT結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)酶活性催化位點(diǎn), 即: Glu72、Asp85、Asp96。這與G型溶菌酶的典型代表-鵝蛋清溶菌酶[25](goose egg-white lysozyme)中的催化位點(diǎn)略有差異。據(jù)報(bào)道, 斑馬魚[26]、大黃魚和金魚[27]等G型溶菌酶的酶活性催化位點(diǎn)與鵝蛋清溶菌酶相比也存在位置差異情況[28]。在魚類G型溶菌酶中, 第1位Glu和第3位Asp殘基是其發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵位點(diǎn)[29]。由此推測(cè), 法螺G型溶菌酶發(fā)揮抑菌活性的關(guān)鍵可能是Glu和Asp殘基與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖底物結(jié)合[30], 從而破壞N-乙酰葡糖胺和乙酰胞壁酸之間的糖苷鍵。

半胱氨酸是形成二硫鍵的前提, 二硫鍵的存在可使溶菌酶蛋白結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定, 從而有助于增強(qiáng)水生動(dòng)物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性及在高滲透條件下的穩(wěn)定性[31]。但是, G型溶菌酶的二硫鍵數(shù)目因物種不同存在較大的變化[32]。大西洋鮭魚G型溶菌酶中存在3個(gè)半胱氨酸殘基[6], 鯉魚和條石鯛中不存在半胱氨酸殘基[33-34]。本研究中, 法螺G型溶菌酶蛋白含有6個(gè)半胱氨酸殘基, 能形成三對(duì)二硫鍵使其空間結(jié)構(gòu)更緊密, 推測(cè)其可能在抵御細(xì)菌感染時(shí)能更穩(wěn)定與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖底物相結(jié)合。溶菌酶的組織分布與其功能密切相關(guān), 如魚類中發(fā)揮免疫功能的G型溶菌酶基因, 在免疫組織脾臟中的表達(dá)量較高[3, 35]。本研究中, 法螺基因被檢測(cè)到在肝臟和外套膜中高表達(dá)。外套膜能分泌具有抑菌和殺菌作用的黏液, 是軟體動(dòng)物免疫防御的第一道防線[1, 36]; 肝臟作為主要的解毒器官也參與免疫反應(yīng)[37]。由此推斷, 法螺基因在其免疫防御中發(fā)揮了一定的作用。

原核重組表達(dá)菌株經(jīng)低溫誘導(dǎo)能有效地增加可溶性蛋白的比例, 提高可溶性蛋白的表達(dá)量。葉星等[35]采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出草魚G型溶菌酶; 楊梅等[4]利用原核表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)低溫誘導(dǎo)獲得小菜娥溶菌酶重組蛋白, 且表達(dá)產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌活性強(qiáng)于革蘭氏陰性細(xì)菌; 王秀霞及徐永平等[38-39]在大腸桿菌中對(duì)刺參溶菌酶進(jìn)行了表達(dá), 表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多種海洋致病菌均具有抑菌活性是表達(dá)譜很廣的免疫效應(yīng)分子。本研究中, 純化后的法螺G型重組蛋白對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑菌活性, 對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌作用較弱, 這可能與不同細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分有關(guān)[19, 40]。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁組分主要是肽聚糖, 對(duì)溶菌酶敏感度高易被水解; 革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的肽聚糖含量較低, 且位于內(nèi)層對(duì)溶菌酶的敏感度低不易被水解[41-42]。

4 結(jié)論

本研究中法螺溶菌酶基因與其他腹足綱雙殼軟體動(dòng)物的G型溶菌酶序列同源性最高、結(jié)構(gòu)特征最為相似, 據(jù)此判定法螺中溶菌酶基因類型為G型。另外, 成功誘導(dǎo)表達(dá)出法螺G型溶菌酶重組蛋白, 純化后的重組蛋白具有廣譜的抑菌活性, 能明顯抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的活性。這將為深入研究由細(xì)菌感染引起的法螺病害防治及免疫防御機(jī)制提供參考依據(jù)。

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G-type lysozyme prokaryotic expression and antibacterial activity of therecombinant protein

JIA Hui-xia1, 2, ZHANG Hua1, 3, ZHANG Cheng-long4, HE Mao-xian1, 3, LIU Wen-guang1, 3

(1. Key Laboratory of Tropical Marine Biological Resources and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Guangdong Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), Guangzhou 511458, China; 4. Sansha Marine and Fisheries Bureau, Sansha 573199, China)

G-type lysozyme (is a natural immune factor with rich cysteine content, which plays an important role in invertebrate immune defense. This study aimed to further understand the molecular immune mechanism ofand to provide new ideas for preventing disease inby studying the antibacterial function of recombinant protein G-type lysozyme in()The sequence characteristics ofwere analyzed, and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction analysis was used to detect thetissue distribution. Next, the pGEX-4T-1-CtG.lys recombinant plasmid was constructed using the pGEX-4T-1 expression vector to express the recombinant protein and detect its antibacterial activity. The results showed: 1) The 5′ untranslated region (UTR) was 66 bp, the 3′ UTR was 186 bp ofthecDNA; the open reading frame was 789 bp and encoded 262 amino acids;contained one soluble transglycosidase (SLT) domain (72–255 aa), six cysteine residues, and three enzyme active catalytic sites (Glu72, Asp85, and Asp96); 2) multiple sequence alignment and phylogenetic analyses showed that theamino acids had the highest homology with a closely related G-type lysozyme; 3)was expressed in all tissues tested and was highly expressed in the liver and mantle; 4) after 10 hours of induced expression with 0.5 mM IPTG at 16℃, the average molecular weight of the recombinant protein expressed in the supernatant and inclusion bodies was 51.91 kDa. A1.2 mg/mL recombinant protein concentration was obtained after purification; 5) the antibacterial activity test showed that the pGEX-4T-1-CtG.lys recombinant protein hadantibacterial activities against,, and, and the bacteriostatic effect on the Gram-positive bacteria was greater than that of Gram-negative bacteria. The results of the study will provide a reference and a scientific basis for further analysis of the molecular mechanism of immune defense in.

; G-type lysozyme; prokaryotic expression; antibacterial activity

Sep. 26, 2021

S968

A

1000-3096(2022)10-0032-11

10.11759/hykx20210926001

2021-09-26;

2021-11-22

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(42176129); 中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)研究項(xiàng)目(XDA13020206); 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)人才團(tuán)隊(duì)引進(jìn)重大專項(xiàng)(GML2019ZD0402)

[National Natural Science Foundation of China, No. 42176129; Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No. XDA13020206; Key Special Project for Introduced Talents Team of Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), No. GML2019ZD0402]

賈慧霞(1994—), 女, 河南省開封市人, 碩士研究生, 主要從事貝類遺傳與育種, E-mail: jiahuixia19@mails.ucas.ac.cn; 劉文廣(1978—),通信作者, 副研究員, 碩士生導(dǎo)師, 研究方向?yàn)樨愵愡z傳與育種, 電話: 020-89023144, E-mail: lwg@scsio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)