超聲分子成像技術(shù)在靶向診療動(dòng)脈粥樣硬化中的進(jìn)展

閻文江 陳良 楊晶晶

(教育部、國(guó)家衛(wèi)健委、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院心血管重構(gòu)與功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 省部共建心血管轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250012)

心血管疾病是目前全球因疾病導(dǎo)致死亡的主要原因，其中85%的缺血性事件是心肌梗死和腦卒中，而動(dòng)脈粥樣硬化是這些缺血性事件的潛在原因。目前，動(dòng)脈粥樣硬化的治療主要包括控制危險(xiǎn)因素、溶栓和介入治療恢復(fù)阻塞相關(guān)血管的血流。盡管在預(yù)防、診斷和治療動(dòng)脈粥樣硬化方面取得了一些進(jìn)展，但臨床現(xiàn)狀仍任重道遠(yuǎn)。分子診斷和治療技術(shù)從20世紀(jì)80年代興起，近年來(lái)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的顯像和治療從單純的解剖學(xué)狹窄的嚴(yán)重程度，發(fā)展為斑塊生物學(xué)特性以及成分的診療水平。超聲技術(shù)具有超高的空間和時(shí)間分辨率，并且其具有無(wú)創(chuàng)、便捷和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，一直是臨床上最常用的影像學(xué)技術(shù)，尤其是近幾年納米顆粒以及微泡分子介質(zhì)的發(fā)展，使得超聲技術(shù)可對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展進(jìn)行靶向分子成像的診斷和治療，為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的診療提供了巨大的機(jī)會(huì)。

1 對(duì)比增強(qiáng)超聲技術(shù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯像的臨床應(yīng)用

歐洲超聲醫(yī)學(xué)和生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)在2017年對(duì)對(duì)比增強(qiáng)超聲(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)在血管系統(tǒng)的應(yīng)用中指出，在臨床實(shí)踐中推薦其用于區(qū)分頸動(dòng)脈和/或椎動(dòng)脈閉塞和狹窄的殘余血流；鑒別顱外頸動(dòng)脈、椎動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈及其主要分支的解剖；診斷疑為炎性大血管和腹主動(dòng)脈的輔助手段；應(yīng)用于主動(dòng)脈腔內(nèi)修復(fù)的隨訪等方面。而關(guān)于斑塊特征成像的推薦，CEUS可用于評(píng)估提示斑塊不穩(wěn)定性的頸動(dòng)脈斑塊血管新生，不過(guò)相關(guān)研究和應(yīng)用主要局限于頸動(dòng)脈[2]。CEUS技術(shù)檢測(cè)表明斑塊新生血管形成與組織學(xué)發(fā)現(xiàn)有很好的相關(guān)性，并且Saha等[3]總結(jié)了一個(gè)用于描述斑塊血管新生的分級(jí)系統(tǒng)，將其分為三級(jí)：(1)輕度，僅在外膜附近的斑塊邊界處存在移動(dòng)的微泡；(2)中度，微泡出現(xiàn)在斑塊的肩部和內(nèi)側(cè)，但不出現(xiàn)在頂端；(3)嚴(yán)重，整個(gè)斑塊(包括尖端)都存在微泡。盡管CEUS在評(píng)估血管新生方面有許多優(yōu)勢(shì)，但仍需一種最佳的定量方法以及標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)量方法[4]。與常規(guī)多普勒超聲相比，CEUS在評(píng)估斑塊纖維帽潰瘍的形成中也具有更高的敏感性和特異性。

從實(shí)際臨床應(yīng)用角度出發(fā)，CEUS具有成本低，成像的持續(xù)時(shí)間短(10 min)以及對(duì)目標(biāo)的空間分辨率和靈敏度相對(duì)平衡的特點(diǎn)，是非常適合基于人群篩查目的的成像方法[5]。但目前，只有少數(shù)造影劑被批準(zhǔn)并推薦用于臨床應(yīng)用，例如Definity/Luminity、SonoVue/Lumason或Sonazoid，因此造影劑的限制在某種程度上限制了CEUS在臨床實(shí)踐中的發(fā)展和應(yīng)用[6]。因此目前臨床在實(shí)際應(yīng)用中還是相對(duì)較少，將來(lái)隨著造影劑的進(jìn)一步改進(jìn)以及超聲技術(shù)的進(jìn)一步普及，臨床應(yīng)用空間會(huì)很大。

2 超聲分子成像技術(shù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊特征顯像的臨床前期研究

分子成像需具有三個(gè)因素：靶向配體(抗體、抗原結(jié)合片段和肽)，成像工具(超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像/單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像和近紅外熒光成像)和檢測(cè)劑(微泡、碘化化合物、放射性核苷酸、超順磁性化合物和熒光染料)。分子成像是指對(duì)體內(nèi)的細(xì)胞和分子水平上生物過(guò)程的特征進(jìn)行描述和測(cè)定，可同時(shí)獲取分子成像數(shù)據(jù)以及形態(tài)或功能特征，而這些數(shù)據(jù)可詳細(xì)描述疾病的病理生理學(xué)狀態(tài)，從而為精準(zhǔn)治療開(kāi)辟了道路。超聲分子成像技術(shù)是基于由微泡組成的超聲特異性造影劑基礎(chǔ)的成像，用抗體和小肽等結(jié)合配體修飾的造影劑，這些功能化超聲造影劑，即靶向造影劑或靶向微泡，可與參與各種疾病過(guò)程的生物標(biāo)志物結(jié)合。目前關(guān)于臨床前期的研究，通過(guò)應(yīng)用超聲分子成像技術(shù)，在各種不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括小鼠、大鼠、兔和豬的頸動(dòng)脈、升主動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓中，進(jìn)行了很多有關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的不同階段的研究。

基于微泡的超聲造影劑有血池限制，其應(yīng)用僅限于與灌注相關(guān)或發(fā)生在血管腔內(nèi)皮表面的事件，是單純的血管內(nèi)制劑，不能被用于檢測(cè)那些血管腔外的動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)。所以超聲分子成像技術(shù)主要依賴于檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化部位內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的改變。在過(guò)去的數(shù)十年中，應(yīng)用配體修飾的微泡的超聲分子成像技術(shù)在動(dòng)脈粥樣硬化病變區(qū)域識(shí)別活化受損的內(nèi)皮細(xì)胞取得了很大的進(jìn)展，使用靶向成像可直接可視化動(dòng)脈粥樣硬化炎癥及免疫反應(yīng)的分子或細(xì)胞成分。

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)分子作為靶向檢測(cè)目標(biāo)

血管腔內(nèi)血流的變化產(chǎn)生的應(yīng)變導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是目前公認(rèn)的促動(dòng)脈粥樣硬化因素。連接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)被證明是對(duì)血流急性變化最敏感的生物標(biāo)志物，在依賴于血流變化動(dòng)脈粥樣硬化的好發(fā)部位的內(nèi)皮細(xì)胞上特異性上調(diào)，繼而促進(jìn)單核細(xì)胞在血管壁的募集和積累。Curaj等[7]應(yīng)用可與活化的內(nèi)皮細(xì)胞的JAM-A靶向結(jié)合的微泡MBJAM-A對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型進(jìn)行超聲分子成像，發(fā)現(xiàn)MBJAM-A可與活化的內(nèi)皮細(xì)胞上的JAM-A特異結(jié)合，從而早期識(shí)別動(dòng)脈粥樣硬化炎性內(nèi)皮功能障礙。血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面或潛在的血管脈管上表達(dá)，參與動(dòng)脈粥樣硬化初始階段單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的募集和黏附，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程的關(guān)鍵分子之一。因而VCAM-1是分子成像的理想靶標(biāo)。Kaufmann等[8]應(yīng)用靶向結(jié)合VCAM-1的納米微泡增強(qiáng)劑能快速量化在動(dòng)脈粥樣硬化不同階段發(fā)生的血管炎性變化。P選擇素也是調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中白細(xì)胞募集的關(guān)鍵內(nèi)皮黏附分子，在動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)病變部位早期出現(xiàn)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Kaufmann等[9]通過(guò)超聲分子成像技術(shù)同時(shí)靶向顯示VCAM-1和P選擇素，從而實(shí)現(xiàn)了在內(nèi)膜黃瘤(脂肪條紋)發(fā)生之前，炎性細(xì)胞進(jìn)入血管壁時(shí)檢測(cè)到動(dòng)脈粥樣硬化血管炎癥的存在和發(fā)生，早期檢測(cè)到動(dòng)脈粥樣硬化啟動(dòng)事件，為動(dòng)脈粥樣硬化的早期篩查和危險(xiǎn)分層提供了方法。

在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展階段，識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊對(duì)于指導(dǎo)管理和預(yù)防嚴(yán)重的心血管事件的發(fā)生至關(guān)重要。血小板聚集和黏附是通過(guò)血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅰb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物與已經(jīng)構(gòu)象激活的血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的A1域相互作用。vWF的活化是通過(guò)黏附于基質(zhì)蛋白、高剪切應(yīng)力或vWF多聚化失調(diào)來(lái)促進(jìn)的。因此，活化vWF的靶向成像可檢測(cè)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化血栓并發(fā)癥的首發(fā)事件，或檢測(cè)炎癥環(huán)境，因?yàn)槎虝旱难“屦じ酱龠M(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化。GPⅠb與vWF之間的相互作用是血栓形成早期的高親和力事件，即使在高剪切應(yīng)力的情況下也能促進(jìn)細(xì)胞的募集。McCarty等[10]應(yīng)用可與血管內(nèi)皮上活化的vWF靶向結(jié)合的含重組GPⅠbα微泡的超聲造影劑靶向檢測(cè)不穩(wěn)定斑塊。他們?cè)贚DLR-/-/Apobec-1-/-基因敲除小鼠中，驗(yàn)證了靶向結(jié)合活化vWF的分子成像技術(shù)可檢測(cè)高危的晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。該研究提供了vWF作為動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)分層的分子影像學(xué)靶點(diǎn)的證據(jù)，并可用于預(yù)測(cè)斑塊不穩(wěn)定血栓形成等高危事件的發(fā)生。Moccetti等[11]通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子特異性結(jié)合的小分子肽配體進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的靶向超聲成像，在晚期動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型中，通過(guò)靶向結(jié)合斑塊內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物(包括P選擇素、VCAM-1、氧化型低密度脂蛋白受體-1和vWF)進(jìn)行超聲分子成像，證明其檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)的晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的可行性。而為了克服在大動(dòng)脈血管中靶向微泡的細(xì)胞黏附不足，Yan等[12]通過(guò)將VCAM-1和細(xì)胞間黏附分子-1抗體以及合成的聚合sialyl Lewis X同時(shí)整合到微泡的表面，設(shè)計(jì)了同時(shí)與VCAM-1/細(xì)胞間黏附分子-1/P選擇素結(jié)合的微泡MBVIS。MBVIS與炎性內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的親和力，使其具有比單靶標(biāo)或雙靶標(biāo)以及對(duì)照微泡更加顯著的優(yōu)勢(shì)，可監(jiān)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展或評(píng)估藥物干預(yù)成效。

急性冠狀動(dòng)脈綜合征或不穩(wěn)定型心絞痛患者血小板聚集率及循環(huán)血小板表面GPⅡb/Ⅲa表達(dá)均高于穩(wěn)定型心絞痛或健康志愿者。因此，GPⅡb/Ⅲa受體是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中聚集血小板的潛在標(biāo)志物。含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)序列的肽對(duì)GPⅡb/Ⅲa具有高度的黏附性。Guo等[13]研制了一種cRGD修飾的微泡(MB-cRGD)，它能與活化血小板上的GPⅡb/Ⅲa特異性地結(jié)合。他們應(yīng)用MB-cRGD微泡靶向顯示黏附和聚集在內(nèi)皮細(xì)胞表面的活化的血小板，證明GPⅡb/Ⅲa受體可作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的生物標(biāo)志物，用于超聲分子成像檢測(cè)。

2.2 通過(guò)靶向檢測(cè)血管新生的超聲分子成像

作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展和不穩(wěn)定性的先決因素，斑塊內(nèi)血管新生和滋養(yǎng)血管已引起廣泛的關(guān)注，并且已被確定為斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)膜下通常存在大量的新生血管，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展并引起臨床癥狀。對(duì)斑塊內(nèi)新生血管的成像可顯示斑塊的生物學(xué)特性，有助于動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)分層。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是由血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌的參與血管新生和血管通透性的主要分子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用的主要受體，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展。Liu等[14]使用可與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2靶向結(jié)合的微泡成功地檢測(cè)到兔腹主動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊，證明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為靶向分子在超聲分子成像技術(shù)中評(píng)估動(dòng)物模型易損斑塊的可行性。玻璃粘連蛋白受體整聯(lián)蛋白αvβ3是內(nèi)皮活化的潛在標(biāo)志物，在新生血管和易損斑塊中多見(jiàn)，與斑塊的外膜滋養(yǎng)血管以及斑塊內(nèi)血管新生明顯相關(guān)。Daeichin等[15]使用抗avβ3整合素的生物素化抗體的靶向微泡無(wú)創(chuàng)地評(píng)估ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊部位外膜滋養(yǎng)血管的特征。與血管新生相關(guān)的炎癥以及此過(guò)程中涉及的炎癥因子被廣泛認(rèn)為是衡量動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的指標(biāo)，而白介素-8是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥因子，它是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變部位與炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要的血管生成因子，可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。Lu等[16]合成了帶有白介素-8多克隆抗體的SonoVue微泡檢測(cè)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，證明該分子診斷技術(shù)更容易檢測(cè)到斑塊的存在以及斑塊的特征，尤其是斑塊滋養(yǎng)血管的情況，有望成為一種非常有價(jià)值的診斷方法。目前動(dòng)物模型研究成功通過(guò)靶向結(jié)合活化內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的黏附分子或炎癥因子的超聲分子成像，檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展以及識(shí)別易損斑塊。

3 超聲分子靶向治療方面的進(jìn)展

超聲分子治療，通過(guò)微泡進(jìn)行藥物和基因遞送是最新研究的熱點(diǎn)。通過(guò)藥物和微泡的共注射或通過(guò)將試劑摻入微泡，應(yīng)用超聲脈沖控制微泡的破壞，聲孔效應(yīng)和空化效應(yīng)能提高細(xì)胞膜的通透性，從而使藥物或治療基因可精確高效地在靶組織釋放，提高了藥物的利用率或基因干預(yù)的有效率。目前很多臨床前研究成功地證實(shí)靶向微泡破壞技術(shù)在改善心肌梗死后心功能、促進(jìn)心肌細(xì)胞再生和減少心肌組織的再灌注損傷等治療方面的可行性。也有部分研究[17-19]通過(guò)靶向微泡破壞技術(shù)基因治療高血壓以及糖尿病心肌病。在急性血管事件的抗栓治療方面，Wang等[20]設(shè)計(jì)了一種新型的治療性微泡，將重組纖溶藥物、回聲增強(qiáng)微泡和活化血小板特異性單鏈抗體結(jié)合在一起。他們?cè)谑褂寐然F誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓模型中，測(cè)試了這種治療性微泡在超聲微泡成像以及靶向溶栓治療中的效果。證明了這種技術(shù)能同時(shí)進(jìn)行血栓的診斷和治療，以及溶栓成敗的監(jiān)測(cè)。但目前為止，尚無(wú)靶向微泡破壞技術(shù)在抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展、促進(jìn)斑塊消退以及穩(wěn)定易損斑塊方面的相關(guān)研究。

4 超聲分子成像技術(shù)靶向診療動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展方向和應(yīng)用前景

動(dòng)脈粥樣硬化通常是一種慢性炎癥性疾病，早期病變通常是無(wú)癥狀的，且檢測(cè)困難。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，研發(fā)新的策略以便更敏感地檢測(cè)和早期預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，以及早期識(shí)別不穩(wěn)定斑塊阻止其進(jìn)一步糜爛破裂是未來(lái)的發(fā)展方向。目前動(dòng)脈粥樣硬化的治療并不能有效地消除或逆轉(zhuǎn)斑塊[21]，同樣在動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成后，也需探索新的無(wú)嚴(yán)重副作用的藥物治療方式，以迅速有效地溶解血栓。近年來(lái)通過(guò)對(duì)分子影像學(xué)診斷和治療相結(jié)合方法的研究，為解決動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供了潛在的機(jī)會(huì)。超聲靶向分子治療可將治療藥物精準(zhǔn)地運(yùn)送到病變部位，與全身給藥相比，減少藥物劑量從而減少全身用藥時(shí)經(jīng)常發(fā)生的副作用。Wang等[22]研究顯示應(yīng)用與活化的血小板特異性結(jié)合的GPⅡb/Ⅲa靶向微泡的超聲分子成像可動(dòng)態(tài)觀察急性動(dòng)脈血栓形成的圖像，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)藥物溶栓的成功或失敗。超聲分子診療法有望成為治療心血管疾病的個(gè)性化藥物的解決方案。

5 目前臨床轉(zhuǎn)化的局限性

超聲分子診療具有巨大潛力，在臨床前的研究中，微泡可與不同的靶向配體結(jié)合，用來(lái)檢測(cè)心肌缺血、血栓形成，并評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化不同階段的斑塊在細(xì)胞水平的生物學(xué)特征。但臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化還是面臨很多困難，微泡在人體循環(huán)系統(tǒng)的作用時(shí)間限制了微泡與目標(biāo)結(jié)合的時(shí)間跨度，由于動(dòng)脈內(nèi)的生理性高血流速度，微泡在作用靶點(diǎn)的滯留時(shí)間相對(duì)較短，超聲很難探測(cè)到較大的血管部位。目前仍缺少有效的可安全使用的臨床傳遞系統(tǒng)，需開(kāi)發(fā)可安全用于人體的可結(jié)合化學(xué)分子和配體的相關(guān)造影劑等。另外仍需優(yōu)化治療參數(shù)，因?yàn)閲X動(dòng)物中已描述了許多不良事件，例如微血管滲漏、心臟內(nèi)溶血、毛細(xì)血管破裂或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。