□ 傅婧潔

（海南師范大學(xué)，海南 ?？?571158）

作為一項(xiàng)全球化產(chǎn)業(yè)，食用菌具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展更是為食用菌發(fā)展提供了必要的支持。分子生物技術(shù)作為一門研究分析生物生命結(jié)構(gòu)的技術(shù)門類，不僅促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，更為食用菌的分析與應(yīng)用提供了技術(shù)保障。國(guó)外學(xué)者Devries在1972年最早分離除了裂褶菌，自此，分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食用菌領(lǐng)域。傳統(tǒng)食用菌多采用的是自然選育、雜交育種，無法滿足人們對(duì)食用菌產(chǎn)量及質(zhì)量的需求。分子生物技術(shù)的應(yīng)用機(jī)制建立在生物科學(xué)之上，其主要通過蛋白質(zhì)、核酸在分子水平上的研究分析，幫助研究者充分掌握住被研究目標(biāo)的生物性質(zhì)、分子構(gòu)成。尤其是近年來我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，分子生物技術(shù)中的DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種技術(shù)方法被人們廣泛關(guān)注。通過DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種分子生物技術(shù)在食用菌中的研究應(yīng)用，能夠?yàn)槭秤镁母咝вN、繁殖、生產(chǎn)等開拓出更廣闊的的前景。文章以DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種技術(shù)方法為例，提出分子生物技術(shù)在食用菌研究中的使用途徑與機(jī)制，從而彰顯出分子生物技術(shù)在食用菌研究中的價(jià)值作用。

一、分子生物技術(shù)的相關(guān)概述

分子生物技術(shù)是分子生物學(xué)范疇下的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。而分子生物學(xué)（molecularbiology）是生物學(xué)中的一個(gè)重要的分支，是研究細(xì)胞不同系統(tǒng)中生物分子之間生物活性的分子基礎(chǔ)，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)之間的相互作用與生物合成。分子生物學(xué)是生物學(xué)中的一個(gè)大門類，分子生物學(xué)下又涵蓋了多種分子生物學(xué)技術(shù)，如常見的分子克隆技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)、高分子印記和探針技術(shù)等等。分子生物技術(shù)是在分子水平上通過對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的研究，獲得研究對(duì)象的性質(zhì)，并利用其性質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行操作，實(shí)現(xiàn)人們對(duì)生物學(xué)的改造的一種技術(shù)方式。分子生物學(xué)技術(shù)的理論基礎(chǔ)來源于PCR（序列互補(bǔ)）和酶切（識(shí)別酶切特定序列），主要的分子生物技術(shù)有已知序列的基因合成、未知序列的全基因的合成、southern雜交、northern雜交等技術(shù)。分子生物技術(shù)主要用于重組蛋白的生產(chǎn)、基因改造物種、基因治療、基因改造及刑事案件的斷定、環(huán)境保護(hù)等等。

二、食用菌研究應(yīng)用中常用的分子生物技術(shù)類型

（一）DNA分子標(biāo)記

DNA分子標(biāo)記是分子生物技術(shù)中的主要技術(shù)種類之一，其主要研究生命物的分子構(gòu)成與DNA組成序列。從DNA分子標(biāo)記的基本機(jī)制上分析，分子標(biāo)記的概念本身可以分為廣義、狹義兩種說法。其中，廣義上的分子標(biāo)記主要是指可遺傳和可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。而狹義上的分子標(biāo)記是主要是指能夠反映單個(gè)生物或種群基因組某些差異的特定DNA片段。DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用形式與標(biāo)準(zhǔn)體現(xiàn)為：限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性；分子檢測(cè)表現(xiàn)的共顯性；數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性等等。其中，RAPD、RFLP、SCAR、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食用菌的檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)、研究之中，通過對(duì)食用菌中的分子組成及化學(xué)物質(zhì)提取，有效探測(cè)到生物體中的DNA序列。

（二）分子轉(zhuǎn)化

分子轉(zhuǎn)化作為分子生物技術(shù)的主要手段之一，其在食用菌研究中的使用，關(guān)鍵在于對(duì)食用菌的化學(xué)物質(zhì)元素的轉(zhuǎn)換與構(gòu)建，通過相應(yīng)的化學(xué)技術(shù)手段及生物提取物，對(duì)食用菌中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行提取與檢測(cè)，從而獲取研究所需的標(biāo)志物，將檢測(cè)出的標(biāo)志物以相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)分析，從而得到生物體的化學(xué)檢測(cè)結(jié)果，為食用菌的培育、種植、生產(chǎn)及食用、藥用等提供化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，隨著我國(guó)對(duì)食用菌的廣泛研究與種植，分子轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為食用菌研究、培育、化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)等重要的技術(shù)手段之一，成為了基因工程、微生物遺傳、分子遺傳等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。食用菌的分子生物學(xué)研究之中，分子轉(zhuǎn)化往往分為啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記、PEG法、電激發(fā)、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合法等技術(shù)種類。

（三）基因克隆

基因克隆是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有革命性的研究技術(shù)，其技術(shù)內(nèi)容上可分為五大要素，即分、切、連、轉(zhuǎn)、選。其主要目的是對(duì)生物體中的基因制取與無性繁殖，即將生物體中的器官、細(xì)胞、組織等以人工合成的方式提取出基因，然后克隆或拼接到另一個(gè)生物體目標(biāo)上，從而實(shí)現(xiàn)生物體復(fù)制的目的?；蚩寺〉谋举|(zhì)目的是通過基因的復(fù)制進(jìn)行無性繁殖，從而將一個(gè)生命體的優(yōu)秀基因復(fù)制或轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生命體上，實(shí)現(xiàn)優(yōu)秀延伸拓展的目的。野生菌界本身有不少的菌類能夠進(jìn)行自主的無性繁殖，他們先天具備了克隆能力。而以食用菌為例，采用基因克隆技術(shù)將野生菌中的化學(xué)物質(zhì)提取出來，然后與其它菌類進(jìn)行基因重組，從而實(shí)現(xiàn)食用菌基因性質(zhì)上的互補(bǔ)，可更好地提高食用菌的產(chǎn)量、育種效果、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

三、各類分子生物技術(shù)在食用菌研究中的應(yīng)用方法

（一）DNA分子標(biāo)記：科學(xué)選取菌種樣品，分子標(biāo)記結(jié)合鑒定

DNA分子標(biāo)記能夠?qū)ξ锓N個(gè)體差異性予以反映，具有遺傳性，能夠?qū)NA序列及蛋白質(zhì)予以監(jiān)測(cè)。目前，在食用菌中常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要包括RAPD技術(shù)、SCAR、RFLP技術(shù)，目前DNA在食用菌中的應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，關(guān)于食用菌遺傳多樣性、雜交子鑒定及菌株鑒別方面的報(bào)道較多。DNA分子標(biāo)記技術(shù)在食用菌研究中的使用，無論是對(duì)食用菌DNA的水平遺傳變異性質(zhì)研究，還是對(duì)食用菌的種群鑒定及優(yōu)良品種選育都具有十分重要的意義。例如：以銀耳的菌屬分子鑒定，在鑒定的過程中，需要應(yīng)用到DNA分子標(biāo)記技術(shù)方式的應(yīng)用。首先，可采用常規(guī)PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，將銀耳的基因寡核苷酸點(diǎn)樣放置在芯片表面，確保實(shí)驗(yàn)材料的完整、有效。然后，對(duì)菌種樣品進(jìn)行處理，確保處理后的樣品還能夠滿足檢測(cè)的實(shí)際需求。其次，對(duì)經(jīng)過處理后的菌種進(jìn)行核算擴(kuò)增，并對(duì)菌種樣品的核算進(jìn)行有效提取，然后借助熒光素做好相應(yīng)的標(biāo)記。并將芯片上的寡核苷酸點(diǎn)樣與處理好的菌種樣品進(jìn)行雜交，再通過分析樣品熒光分析模式和掃描儀定量，實(shí)現(xiàn)對(duì)菌種分子性質(zhì)的化學(xué)分析。同時(shí)，目前隨著DNA條形碼鑒定技術(shù)的發(fā)展，也可采用該模式進(jìn)行銀耳的DNA特征提取與分析，如采用RFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)銀耳的化學(xué)物質(zhì)元素進(jìn)行標(biāo)記鑒定，由于該技術(shù)方式可廣泛適用于種內(nèi)與種間遺傳變異的鑒定，因此，其本身具備了標(biāo)記覆蓋性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。目前在食用菌核酸研究領(lǐng)域常用方法為熒光定量PCR、Southern等，主要被用于食用菌的質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)督、生產(chǎn)質(zhì)量控制。近年來新發(fā)現(xiàn)的ncRNA，其屬于具有特定功能的RNA小分子，具備轉(zhuǎn)錄功能，但對(duì)食用菌無編碼。通過DNA分子標(biāo)記技術(shù)的使用，幫助研究者有效明確食用菌的化學(xué)物質(zhì)構(gòu)建及其規(guī)律，為食用菌的化學(xué)提取與種根培育提供技術(shù)基礎(chǔ)。

（二）分子轉(zhuǎn)化：注重菌根化學(xué)物質(zhì)提取，分子轉(zhuǎn)化結(jié)合物理鑒定

分子轉(zhuǎn)化技術(shù)是分子生物學(xué)中的重要技術(shù)方式之一，其目的就是將外源的DNA分子引入受體細(xì)胞之上，并通過化學(xué)檢驗(yàn)與化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)換的方式使生物體獲取新的遺傳性狀的一種技術(shù)方式。分子生物技術(shù)在塊菌中的研究應(yīng)用，主要是方便研究者更深一步探究出塊菌的化學(xué)物質(zhì)組成及特性，從而全面掌握到塊菌的繁殖與生長(zhǎng)機(jī)制，為塊菌的培育、種植提供資料支撐。例如以塊菌為例，塊菌也稱松露，是一種食用價(jià)值極高的食用菌類，素來有“黑色金剛石”之稱。首先，分子生物技術(shù)在塊菌中的使用，尤為注重塊菌的化學(xué)物質(zhì)分子的轉(zhuǎn)化，為了最大程度上確保分子生物技術(shù)分析的有效性及研究結(jié)果客觀性，研究者可以選取我國(guó)雷公山自然保護(hù)區(qū)的塊菌，該地區(qū)的塊菌常年生長(zhǎng)在野生環(huán)境中，能夠最大程度保證塊菌的化學(xué)物質(zhì)穩(wěn)定、原始、純粹。其次，對(duì)塊菌的化學(xué)物質(zhì)組成鑒定及其分子構(gòu)成的研究中，可使用PCR擴(kuò)增的方式進(jìn)行，即將保存于CTAB緩沖液中的塊菌菌根挑取2～3個(gè)根尖，然后采用CTAB法提取根尖中的DNA。其中，PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，PCR技術(shù)主要是通過運(yùn)用變性以及復(fù)性的原理，在特定的引物的引導(dǎo)下，使得DNA序列在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量的復(fù)制，所形成的DNA序列會(huì)在短時(shí)內(nèi)進(jìn)行快速、大量的擴(kuò)增。然后，再使用其它檢測(cè)技術(shù)與方法就可以及時(shí)得到食用菌化學(xué)物質(zhì)組檢測(cè)結(jié)果。最后，研究者在保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合標(biāo)準(zhǔn)的情況下，將提取出的總DNA以ITSIF、ITS4為引物進(jìn)行PCR。進(jìn)行PCR后得到凝膠電泳檢測(cè)標(biāo)志物，將標(biāo)志物以系統(tǒng)發(fā)育分析的技術(shù)方法進(jìn)行檢驗(yàn)分析，從而得到塊菌的化學(xué)分子構(gòu)成規(guī)律及菌類分類地位。電激法是分子轉(zhuǎn)化常用方法，其利用高壓脈沖作用，將外源DNA攝入原生質(zhì)體膜，經(jīng)過一系列改良操作能夠在帶壁細(xì)胞組織打孔，其所需的DNA含量少，但儀器昂貴，且電擊操作會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化子造成一定的損傷。

（三）基因克?。壕惣?xì)胞化學(xué)性質(zhì)分析，功能基因結(jié)合分子特征

在基因轉(zhuǎn)移、基因編輯技術(shù)支持下，食用菌的蛋白質(zhì)、脂肪及淀粉等營(yíng)養(yǎng)要素含量、性質(zhì)的改變成為可能，可幫助食用菌向有益于人們身體健康的方面發(fā)展?；蚩寺〖夹g(shù)方式在食用菌的使用，不僅可以用以食用菌的功能基因定位，還可以用以食用菌的化學(xué)物質(zhì)提取及其復(fù)制。通過基因克隆技術(shù)在食用菌中的應(yīng)用，能夠?qū)y帶突變基因的等位基因菌株特性進(jìn)行鑒定，有利于對(duì)食用菌品種的培育，從而復(fù)制培育出更優(yōu)質(zhì)的菌種。例如以猴頭菌為例，猴頭菌俗稱猴頭菇、刺猬菌等，是一種藥食功能兼具的食用菌類，在我國(guó)的河北、吉林、四川、遼寧等地廣泛種植。生物科學(xué)界對(duì)猴頭菌的功能基因定位及食用菌的基因克隆培育研究中，通常使用到基因克隆的技術(shù)手段。首先，對(duì)猴頭菌進(jìn)行生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)之前，明確猴頭菌的基本性狀、特征、基因特點(diǎn)，如猴頭菌的菌絲生長(zhǎng)速度、酶活性及產(chǎn)量等等，采用分子生物化學(xué)技術(shù)的方式了解猴頭菌菌絲生長(zhǎng)特征、酶活性、分子細(xì)胞等基礎(chǔ)構(gòu)成特點(diǎn)基礎(chǔ)上，采用基因克隆技術(shù)的手段，對(duì)猴頭菌中的DNA序列及化學(xué)物質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行提取，從而初步獲取到猴頭菌的基因分子。其次，采用構(gòu)建遺傳連鎖譜的方法，尋找猴頭菌中的與分子檢測(cè)目標(biāo)相似的及數(shù)量相對(duì)的狀位點(diǎn)緊密連鎖分析，對(duì)生物體的分子及化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記而提取，從而方便用于其它菌類的合成上。最后，采用基因克隆的技術(shù)手段，對(duì)猴頭菌木質(zhì)素降解酶基因全長(zhǎng)cDNA的分子序列和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中所需的分子生物技術(shù)對(duì)猴頭菌錳過氧化物酶（MnPs）基因進(jìn)行轉(zhuǎn)換與復(fù)制，研究乙醇脫氫酶啟動(dòng)子alcA基因?qū)χ亟M表達(dá)菌株細(xì)胞活性的調(diào)控機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)猴頭菌基因功能的精準(zhǔn)定位與優(yōu)質(zhì)分子化學(xué)物質(zhì)的提取復(fù)制，并且為篩選重組MnPs高效表達(dá)量的工程菌株提供理論基礎(chǔ)。

四、結(jié)語

綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)作為生物科學(xué)界的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，是研究者充分分析與了解生物體基本構(gòu)造與化學(xué)物質(zhì)組成、生命體構(gòu)成的主要技術(shù)渠道。尤其是分子生物學(xué)范疇下的DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種技術(shù)方法，其被廣泛應(yīng)用于我國(guó)食用菌的研究之中，為食用菌的菌種培育、種植及生產(chǎn)等提供了主要的科學(xué)技術(shù)手段，促進(jìn)食用菌的高效生產(chǎn)。基于DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種技術(shù)方法的應(yīng)用，我國(guó)生物科學(xué)界對(duì)其研究較為廣泛，因此，結(jié)合著我國(guó)對(duì)DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種技術(shù)方法的研究理論，以各類食用菌為例，更進(jìn)一步梳理出DNA分子標(biāo)記、分子轉(zhuǎn)化、基因克隆三種技術(shù)方法的使用方式，從而促進(jìn)分子生物技術(shù)在食用菌中的研究應(yīng)用。