陳 蕊 朱建波 馬 南

1 濱州醫(yī)學(xué)院在職研究生，山東省煙臺市 264003； 2 煙臺市蓬萊人民醫(yī)院； 3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬濱州市人民醫(yī)院

結(jié)核病(TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的、嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染性疾病，是全世界十大死因之一，也是單一傳染源的主要死因。世界上大約1/4的人口感染了結(jié)核分枝桿菌。在2019年，約有1 000萬人患有結(jié)核病，140萬人死亡。結(jié)核病可以在任何地方影響任何人。當(dāng)結(jié)核病患者將細(xì)菌排到空氣中時(shí)(例如咳嗽等)，結(jié)核分枝桿菌就會傳播。結(jié)核病通常會影響肺部(肺結(jié)核)，但也會影響其他部位(肺外結(jié)核)[1]。WHO期望至2035年的患病率減少90%，死亡率減少95%[2]。因此，早期診斷結(jié)核病，減少傳染源，預(yù)防結(jié)核病傳播顯得尤為重要。

結(jié)核病具有發(fā)病緩慢隱匿、易于傳染等特點(diǎn)，但是常規(guī)的影像學(xué)檢查具有特異性低、與其他肺部疾病難以鑒別的特征，而結(jié)核病細(xì)菌學(xué)的診斷方法中痰涂片的檢出率較低(雖操作簡單，但結(jié)核菌數(shù)目需>5 000條/ml才能得到陽性結(jié)果)、痰培養(yǎng)耗時(shí)長(常用的固體培養(yǎng)通常需要4～8周的時(shí)間才能得到結(jié)果，且需要專門的實(shí)驗(yàn)室和高技能的工作人員)。此外，有學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)我國的結(jié)核病傳播以近期傳播為主，而1/3的近期傳播由涂陰培陽結(jié)核病患者所致[3]，因此，在取得痰培養(yǎng)結(jié)果之前，涂陰肺結(jié)核的快速診斷對控制結(jié)核病的傳播有著重要的意義。

近幾年分子檢測技術(shù)取得了相當(dāng)程度的進(jìn)展，WHO分別于2010年、2017年推出Xpert及Xpert Ultra，這對診斷涂陰肺結(jié)核、提高病原學(xué)陽性率起著重要的作用。

1 結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)的臨床應(yīng)用

1.1 Xpert的檢測原理及推廣 結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增(Xpert Mycobacte-riumtuberculosis/Rifamfampin，Xpert MTB/RIF,簡稱“Xpert”)技術(shù)是由美國Cepheid公司開發(fā)一種有助于結(jié)核病診斷及利福平耐藥性的快速分子檢測方法，其實(shí)現(xiàn)了診斷過程的自動化，操作簡便，檢測周期短[4]。有研究顯示[5-6]，Xpert 技術(shù)檢測痰標(biāo)本中MTB僅需要5個(gè)純化的基因片段或131菌落形成單位(cfu)/ml，2h內(nèi)即可報(bào)出結(jié)果，并且可以檢出利福平耐藥基因(ropB突變基因)，即針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設(shè)計(jì)引物、探針，檢測其是否發(fā)生突變。2010年，世衛(wèi)組織批準(zhǔn)了Xpert MTB/RIF檢測法，用于對疑似耐多藥結(jié)核病或HIV相關(guān)結(jié)核病患者進(jìn)行初步診斷檢測。2014年，世衛(wèi)組織將這一建議擴(kuò)大到所有患者[7]。WHO十分認(rèn)可Xpert MTB/RIF，并認(rèn)為這種檢測方法可能對結(jié)核病的治療和控制帶來革命性變化，是全球結(jié)核診斷和治療方面的一個(gè)重要里程碑。Laura Maynard-Smith等[8]于2014年時(shí)提出，Xpert對大約2/3的涂片陰性樣本具有較高的特異性。Dorman SE等[7]在其研究中也提到，在2013年2月7日之前2 000名受試者中，Xpert對痰涂片鏡檢陰性的肺結(jié)核患者的敏感性為67%。利福平耐藥性的表現(xiàn)特征為95%的敏感性和98%的特異性，證明了Xpert在涂陰肺結(jié)核患者中,檢測是否為結(jié)核分枝桿菌感染及對利福平耐藥具有較高的效能[9]。

1.2 Xpert的不足之處 作為新型肺結(jié)核檢測手段，Xpert對肺結(jié)核的快速診斷起著日益重要的作用，但隨著Xpert的應(yīng)用更加廣泛，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其有相對不足之處。首先，Xpert同時(shí)檢測出活的和死的細(xì)菌[10]，這導(dǎo)致Xpert不能對治療后的療效進(jìn)行評價(jià)，同時(shí)對肺結(jié)核的復(fù)發(fā)情況的提示意義也受限。其次，有研究表明Xpert檢測野生型與突變型菌株混合標(biāo)本的利福平耐藥相關(guān)突變的能力有限[11]。

2 超敏結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥基因檢測技術(shù)的推出

2.1 Xpert Ultra的改進(jìn)原理及臨床應(yīng)用 2017年3月世界衛(wèi)生組織(WHO)于世界防治結(jié)核病日推薦新一代超敏結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥基因檢測技術(shù)(Xpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)，可替代目前的Xpert MTB/RIF試劑盒。相較于Xpert，Xpert Ultra試劑盒內(nèi)的變化包括一個(gè)更大的DNA擴(kuò)增倉室(意味著更大量的標(biāo)本用于DNA的擴(kuò)增和檢測)和兩個(gè)額外的分子靶標(biāo)來檢測結(jié)核菌(Xpert Ultra整合了兩種不同的多拷貝擴(kuò)增靶點(diǎn)，即IS6110和IS1081[12])。Xpert Ultra在基本不改變Xpert操作步驟的同時(shí)，通過改善檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步提高檢測水平，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)Xpert Ultra進(jìn)一步縮短了檢測時(shí)間：由原來Xpert所需要的110min縮短至66min(報(bào)陽時(shí)間)、77min(報(bào)陰時(shí)間)，提高了檢測效率；(2)Xpert Ultra增強(qiáng)了檢測低數(shù)量細(xì)菌的能力：最低檢出限由Xpert所需的131cfu/ml下降為11.8cfu/ml，從而增加Xpert Ultra檢測的敏感性；(3)Xpert Ultra也做出了有關(guān)于耐藥性的檢測方面改善。Xpert Ultra修復(fù)了Xpert檢測ropB基因突變類型中沉默突變時(shí)錯(cuò)誤報(bào)陽的情況[6]。Xpert Ultra通過重新設(shè)計(jì)一組ropB基因的稀松分子信標(biāo)來提高第553 號密碼子突變(此密碼子與利福平耐藥相關(guān))的檢測質(zhì)量，尤其是突變型與野生型DNA混合時(shí)。此外，Xpert Ultra還修復(fù)了另一個(gè)ropB基因的稀松分子信標(biāo)，從而能夠?qū)⒊聊蛔僎513Q和F514F與其他利福平耐藥相關(guān)的決定區(qū)域的突變區(qū)分開來。通過以上兩種方式，Xpert Ultra改善了對沉默突變菌株的檢測水平，提高了利福平耐藥檢測的準(zhǔn)確性[12]。

Dorman SE等[7]于2017年總結(jié)世衛(wèi)組織的結(jié)論，Xpert Ultra克服了Xpert檢測肺結(jié)核的敏感性和檢測利福平耐藥的準(zhǔn)確性，作為Xpert的替代品，可以用于對有結(jié)核病癥狀或體征的成人進(jìn)行初步檢測。并且通過一項(xiàng)包括2 368名參與者的前瞻性多中心研究結(jié)果表明，Xpert Ultra對涂片陰性(但培養(yǎng)陽性標(biāo)本)的敏感性為63%(相同條件下Xpert敏感性為46%)，進(jìn)一步證實(shí)了Xpert Ultra在檢測肺結(jié)核方面比Xpert更為敏感，尤其是對于貧桿菌標(biāo)本(即可用檢測效果最差的涂片陰性標(biāo)本)。Chakravorty S等[12]、Opota O等[13]也在其研究中得到相似的結(jié)論。同時(shí)也提示我們在臨床實(shí)踐中，對于涂陰肺結(jié)核等死亡率較高的人群，Xpert-Ultra的高靈敏度有助于對其早期診斷[7]，可以顯著減少肺結(jié)核(包括利福平耐藥的肺結(jié)核)等待時(shí)間，減少了治療的延遲(對于耐藥結(jié)核可以快速啟動耐藥治療[14])，減少因延遲診斷治療導(dǎo)致的死亡。

2.2 Xpert Ultra的缺陷 盡管Xpert Ultra的敏感性較Xpert增加，但是仍不能克服Xpert的某些缺點(diǎn)，最重要的就是仍然不能區(qū)分活的和死的桿菌[13]，這使得Xpert Ultra對既往有結(jié)核病史的患者診斷提示意義較局限。除此之外，Dorman SE[7]、Horne DJ等[14]均在其文章提到，Xpert Ultra敏感性的提高是以特異性喪失為代價(jià)的。Chen X等[15]在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)也總結(jié)出類似的結(jié)論，Xpert Ultra比Xpert有更好的敏感性和略低的特異性，而且也指出Xpert Ultra的假陽性結(jié)果通常出現(xiàn)在以前接受過結(jié)核病治療的成人身上。這與Opota O等[13]的結(jié)論相呼應(yīng)。我們?nèi)孕枰龠M(jìn)一步的研究，以闡明敏感性增加和特異性降低之間的權(quán)衡關(guān)系，并確定Xpert Ultra陽性和培養(yǎng)陰性結(jié)果的生物學(xué)基礎(chǔ)[7]。

綜上所述，Xpert及Xpert Ultra可以快速、準(zhǔn)確地診斷出少菌型肺結(jié)核并同時(shí)檢測其耐藥性，這對涂陰肺結(jié)核的早期診治具有重要意義。通過減少患者多次反復(fù)檢查的時(shí)間及花費(fèi)、減少對痰培養(yǎng)及傳統(tǒng)耐藥檢查的等待時(shí)間來縮短診斷的時(shí)間，Xpert及Xpert Ultra明顯提高了涂陰肺結(jié)核的診治率，為我們完成WHO提出的“終結(jié)結(jié)核流行、自由健康呼吸”的目標(biāo)提供了巨大幫助，對減少結(jié)核病在社會傳播、維護(hù)良好的公共衛(wèi)生環(huán)境具有重要意義。盡管Xpert Ultra目前在國內(nèi)未推廣應(yīng)用，但是鑒于對Xpert在國內(nèi)外的廣泛應(yīng)用的研究及其對結(jié)核診斷帶來的便利，Xpert Ultra的推廣應(yīng)用值得期待。