周連仲 馮 勇 劉 瑋 周子寧 張建新

天津市第四中心醫(yī)院 南開大學附屬第四中心醫(yī)院 天津市耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 300000

軟骨調節(jié)素(ChM)是一族新的軟骨特異性蛋白，它的家族包括ChM-Ⅰ、ChM-Ⅱ、ChM-Ⅲ三種生物因子[1]，ChM-I是最早被明確的軟骨調節(jié)素。 ChM-I的生物學作用表現為刺激軟骨細胞DNA和基質合成，能夠促進軟骨細胞和體內軟骨的快速生長；抑制血管發(fā)生，能夠抑制血管長入軟骨內，進一步抑制軟骨內骨化和骨的形成。本文將對ChM-Ⅰ的研究進展加以概述。

1 ChM-I的結構

人們在研究刺激軟骨生長的因子的過程中發(fā)現一種軟骨提純物,其刺激軟骨細胞的活性和TGF完全不同。這種提純物為ChM-Ⅰ，是一種由121個氨基酸構成的糖蛋白，相對分子質量為25 000。其在胎牛軟骨細胞外基質中大量存在，具有促進軟骨細胞增生和蛋白多糖合成的作用。為了更好地研究ChM-Ⅰ的功能，人們對其蛋白結構進行了分析：成熟的ChM-Ⅰ蛋白質在其C末端帶有3個糖基化位點，由1個疏水區(qū)和8個半胱氨酸構成；其N端，具有很高的親水性。Yanagihar等[2]以人ChM-Ⅰ的cDNA作為探針，從人基因組粘粒文庫中篩選出兩組含有ChM-Ⅰ的cDNA的克隆，對其進行核苷酸序列分析，發(fā)現ChM-Ⅰ基因是由7個外顯子和外顯子—內含子邊界構成的。利用所獲得的克隆為探針，進一步研究，發(fā)現人的ChM-Ⅰ基因位于染色體13q14-21處，編碼334氨基酸Ⅱ型跨膜糖蛋白。

2 ChM-Ⅰ的表達與調控

2.1 ChM-Ⅰ在軟骨組織中的表達 ChM-Ⅰ最早是在骨骺軟骨中被發(fā)現并分離出來。人們在正在發(fā)育的牛尾椎軟骨組織中檢測到了ChM-Ⅰ的表達；而在牛的軟骨膜和肌肉等非軟骨組織中并未檢測到ChM-Ⅰ的表達。ChM-Ⅰ這種在軟骨組織中特異性表達的特性，提示其表達可能是軟骨細胞分化表型的一部分。 Shukunami等[3]采用Northern blot分析顯示，ChM-Ⅰ轉錄子的表達與胎齡11～17d時表達Ⅱ塑膠原的軟骨形成相關，此時軟骨骨基正在被骨替代。同時，ChM-Ⅰ的mRNA在眼及胸腺中有低水平的表達。原位雜交顯示ChM-Ⅰ在13.5～16d的小鼠胚中所有軟骨樣組織中均有大量的表達。在退化的軟骨組織中，ChM-Ⅰ的mRNA的表達是幾乎不存在的。并且轉錄子的表達隨著肥大軟骨細胞X型膠原的出現而下降。

2.2 不同種屬間ChM-Ⅰ的表達 研究發(fā)現，不同種屬間ChM-Ⅰ的表達是有所差異的。Shukunami等[4]對雞的ChM-Ⅰ的cDNA核苷酸序列進行分析：發(fā)現雞的成熟的ChM-ⅠN端親水區(qū)序列要比哺乳動物的長，其原因可能是由于多腺苷酸化信號的交替使用，使雞的胚胎可以表達多種不同大小的轉錄子(3.7、2.0和1.7kb)，但哺乳動物僅表達一種轉錄子(1.7kb)。在雞的胚胎發(fā)育早期，在體節(jié)、心臟、支氣管弓、視網膜和肢芽中可檢測到ChM-I的mRNA的表達；在發(fā)育后期，ChM-I的mRNA的表達僅局限于軟骨及眼。在雞的胚胎發(fā)育過程中，ChM-Ⅰ的表達并不是只局限在無血管的軟骨區(qū)，其轉錄子在脊索、神經管底板及頂板和軟骨前體組織如:體節(jié)生骨節(jié)、發(fā)育中的四肢及咽弓、耳道及鞏膜中也有表達。

2.3 ChM-Ⅰ的調控 Aoyama等[5]在骨肉瘤細胞系中研究ChM-Ⅰ基因表達的分子機制時發(fā)現，ChM-Ⅰ基因DNA甲基化與去甲基化作用和組蛋白的乙?；c去乙?；饔弥g的轉化,在ChM-Ⅰ的基因表達調控中也起著重要的作用。PI3K/AKT信號的下游缺陷可能會影響mTOR網絡，導致細胞凋亡。在顳下頜關節(jié)(TMJ)的穿孔盤中，血管生成似乎受NF-κB途徑的調控，與健康盤相比，ChM-Ⅰ在穿孔盤中的表達明顯較低，似乎在白細胞介素-1β(IL-1β)的存在下通過NF-κB途徑進行調控，將ChM-Ⅰ與受體介導的NF-κB信號和TMJ的病理血管生成聯系起來[6]。

3 ChM-I 的生物學作用

3.1 在軟骨生長、軟骨損傷修復及軟骨、椎間盤退變中的作用 ChM-Ⅰ具有刺激軟骨細胞DNA和基質合成的作用，能夠促進軟骨細胞和體內軟骨的快速生長。ChM-Ⅰ與FGF-2具有協(xié)同作用，而且具有濃度依賴性，當ChM-Ⅰ的濃度達到200ng/ml時，ChM-Ⅰ刺激軟骨細胞生長的活性最強，這些發(fā)現表明ChM-Ⅰ在軟骨的生長過程中起著特殊的作用。研究表明[7]，正常發(fā)育成年鼠健康關節(jié)軟骨中可檢測到大量ChM-Ⅰ蛋白的表達；在骨關節(jié)炎早期，淺表關節(jié)軟骨中的ChM-Ⅰ蛋白表達有所減少；在骨關節(jié)炎進展期，所有關節(jié)軟骨中的ChM-Ⅰ蛋白表達均減少，血管內皮生長子的表達反而增加。據此筆者推測：在關節(jié)軟骨的正常生長和無血管特性的維持過程中ChM-Ⅰ起著重要的作用，其表達的下調可使血管侵入關節(jié)軟骨，并最終導致軟骨的骨化和骨關節(jié)炎的發(fā)生。研究發(fā)現[8]，退變初期的椎間盤中，ChM-I的表達反而有所升高。筆者推測ChM-Ⅰ在退變初期的增多是為了阻止椎間盤退變的進展，ChM-Ⅰ在維持軟骨組織的完整性中發(fā)揮著保護性作用。另有證據表明ChM-Ⅰ的表達與骨關節(jié)炎可能有關，在軟骨細胞分化和軟骨的調控中維持內穩(wěn)態(tài)。綜合以上研究結果，筆者發(fā)現ChM-Ⅰ在軟骨生長、軟骨損傷修復及軟骨、椎間盤退變中發(fā)揮著重要作用，但具體機制仍需進一步研究。

3.2 在心臟瓣膜中的作用 研究證明[9]：在維持心臟瓣膜正常功能的過程中，ChM-Ⅰ具有重要的作用。它阻止心臟瓣膜中新生血管的形成，而這一過程很可能導致心臟瓣膜病的發(fā)生。炎癥誘導的新血管重建是感染性心內膜炎(IE)發(fā)展的一個致病性特征。在IE早期的瓣膜組織中，ChM-Ⅰ的表達被下調，這可能導致血管重建和心內膜炎的進展，與 ChM-Ⅰ水平的降低引起的免疫介導的炎癥反應的結果。此外，缺氧相關的ChM-Ⅰ表達降低也可能是中晚期瓣膜疾病進展的一個因素。在植入過程中，ChM-Ⅰ被證明對滋養(yǎng)細胞的遷移和入侵有抑制作用，這意味著ChM-Ⅰ可能會影響胚胎發(fā)育過程中組織分化和血管生成的調節(jié)。還需要進一步的研究來促進我們對ChM-Ⅰ在感染性心內膜炎的發(fā)展和胚胎發(fā)生中作用的理解。

3.3 在抑制內皮細胞及血管形成中的作用 軟骨由于存在大量的抗血管形成因子，而表現出無血管化狀態(tài)。然而在軟骨內骨化過程中，其鈣化中心是允許血管長入的，這也是骨替代軟骨的開始。軟骨的血管化和無血管化的狀態(tài)改變，在軟骨內成骨過程中起關鍵的作用。在體外試驗中，觀察到ChM-Ⅰ具有抑制血管內皮細胞的增殖和管狀的形成。ChM-Ⅰ抑制血管形成的作用已得到廣泛的認同。 Shigenori Miura等[10]研究人重組軟骨調節(jié)素在小鼠角膜血管形成中有抵抗血管形成的作用。他們主要關注VEGF-A介導的血管內皮細胞的遷移這一步驟，此步驟是血管形成中關鍵的調控步驟。分別用VEGF、FGF-2和IGF-1介導人臍靜脈內皮細胞的超化性遷移，加人人重組軟骨調節(jié)素Ⅰ(rhChM-Ⅰ)濃縮液阻滯這一過程，并用改良后的趨化實驗裝置進行分析，發(fā)現ChM-Ⅰ的功能是建立在內皮細胞黏附的獨立性和專一性之上的。這一作用與細胞伸展的阻滯和在VEGF刺激下的肌動蛋白細胞骨架的斷裂重組有關。與這些觀察相一致，在細胞擴展期間，rhChM-Ⅰ明顯降低了Rac1/Cdc42的活力，在靜止期的細胞，VEGF 介導的Rac1活力并不是它的基本活力。綜上所述，目前的數據顯示，ChM-Ⅰ損傷了內皮細胞由VEGF-A刺激所產生的活力，進而阻止內皮細胞的生長。

3.4 在抗腫瘤中的作用 研究表明[11]，ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可以抑制腫瘤的生長、傳播和轉移，這表明ChM-Ⅰ功能的喪失可能會誘導腫瘤的發(fā)生。ChM-Ⅰ已被證明可以抑制體內人骨肉瘤細胞的生長和增殖，并抑制體外人骨肉瘤細胞的侵襲和遷移。研究發(fā)現[12]ChM-Ⅰ在胃癌中的表達下調，ChM-Ⅰ似乎是一種潛在的腫瘤抑制劑，這也可能成為胃癌治療和預后的重要生物標志物。ChM-Ⅰ在多種內分泌腫瘤(MEN)中有所表達，在多形性腺瘤的發(fā)病機制研究過程中，也檢測到ChM-Ⅰ的表達，這表明它有可能參與了多形性腺瘤的低血管性和軟骨體的形成。在細胞水平上，ChM-Ⅰ似乎能夠通過以劑量依賴關系促進細胞增殖和抑制腫瘤細胞的生長來表現出雙重作用。低濃度的ChM-Ⅰ似乎可以促進成骨細胞的生長，而高濃度的ChM-Ⅰ抑制了腫瘤細胞的生長和遷移，如人宮頸癌(HeLa)細胞和人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞，并抑制了人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的增殖和血管生成[13]。ChM-Ⅰ通過抑制STAT信號通路來發(fā)揮直接的抗腫瘤作用。ChM-Ⅰ還能夠通過調節(jié)細胞周期相關基因的表達水平來抑制乳腺癌細胞的生長，因此可能對治療乳腺癌有潛在的臨床應用[14]?？偟膩碚f，這些發(fā)現提示ChM-Ⅰ在各種癌癥的發(fā)病機制中起作用，與ChM-Ⅰ調節(jié)軟骨細胞分化和抗血管生成特性有關。ChM-Ⅰ在癌癥發(fā)病機制中的作用需要進一步的研究，以開發(fā)其作為癌癥治療的新靶點。

3.5 在軟骨組織工程中誘導骨髓間充質干細胞的作用 骨髓間充干細胞因其具有多向分化潛能，在組織工程中的應用前景越來越好，受到越來越多的學者的關注。因生物因子對誘導種子細胞向軟骨細胞分化、增殖的關鍵作用而成為軟骨組織工程的一個重要研究方向。翟立杰所帶領的課題組在這方面做了大量的工作。他們利用基因芯片篩選大鼠MSCs和透明軟骨及彈性軟骨細胞差異表達基因，發(fā)現ChM-Ⅰ基因在MSCs中低表達，而在透明軟骨及彈性軟骨細胞中高表達[15]。通過生物信息學檢索結果提示，ChM-Ⅰ可能在誘導MSCs向軟骨細胞方向分化過程中起關鍵作用。Western blot發(fā)現在透明軟骨細胞和彈性軟骨細胞中ChM-Ⅰ的表達明顯高于MSCs，推測ChM-Ⅰ可能成為誘導MSCs向軟骨細胞分化的一個重要的生物因子。

4 展望

ChM-Ⅰ是軟骨源性的生長因子，同時也是一種血管生成抑制劑，其可以調控軟骨的形成，刺激軟骨細胞的生長，對軟骨的無血管化的維持起重要作用。ChM-Ⅰ在抵抗軟骨退化方面的研究也有很多報道，但關于其分子機制，如ChM-Ⅰ作用的受體、受體結構及理化性質以及生長因子介導的細胞內信號傳遞過程的研究很少。ChM-Ⅰ抑制血管生成的作用，在實體腫瘤的治療中展示了很好的應用前景，同時也有ChM-Ⅰ直接抑制腫瘤細胞生長方面的研究及相關作用機制的探討，但仍缺乏更廣泛深入的研究。另外，對ChM-Ⅰ在軟骨組織工程領域的應用也有學者開展了相關的研究，具有很好的研究前景?，F代分子生物學技術迅猛發(fā)展，ChM-Ⅰ的基因及蛋白質結構的研究也在不斷深入，已提純得到了ChM-Ⅰ重組蛋白，并在體內及體外實驗中驗證了其功能的有效性。相信在不遠的將來，對ChM-Ⅰ的研究必將有更進一步的發(fā)展，其在臨床應用方面的價值也會不斷展現，最終為相關臨床疾病的治療帶來新的方法。