尹一帆，譚睿陟，王麗，劉建

1成都市第三人民醫(yī)院西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，成都 610014；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科

糖尿病腎?。―KD）是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥之一［1］，已成為導(dǎo)致終末期腎臟病的首位病因［2］。研究表明，炎癥是DKD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［3］。高血糖可觸發(fā)和維持多種信號(hào)通路激活，且腎小球系膜細(xì)胞相較于腎其他固有細(xì)胞更易受高糖環(huán)境影響［4］。大量臨床試驗(yàn)表明，鈉—葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（SGLT-2）抑制劑具有腎保護(hù)作用［5-6］。KDIGO指南和APSN指南均明確推薦SGLT-2抑制劑作為2型糖尿?。═2DM）伴DKD患者的一線用藥［7-8］。SGLT-2抑制劑可減輕腎臟炎癥及纖維化，改善腎血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)，減輕氧化應(yīng)激水平［9］。TGF-β/Smad3信號(hào)通路是導(dǎo)致DKD腎臟炎癥及纖維化的經(jīng)典途徑，其中Smad3被認(rèn)為是其中的關(guān)鍵因子［10］。2020年5月—2021年1月，本研究觀察了SGLT-2抑制劑卡格列凈對(duì)高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞的抗炎、抗凋亡作用，并基于TGF-β/Smad3信號(hào)通路探討作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要材料小鼠腎小球系膜細(xì)胞系SV40 MES13購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司，卡格列凈購(gòu)自MCE公司，葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自萬(wàn)類公司，鼠抗鼠Smad3單克隆抗體、HRP標(biāo)記鼠抗鼠IgG、鼠抗鼠TNF-α單克隆抗體、鼠抗鼠IL-6單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗鼠p-Smad3單克隆抗體、FITC-兔抗鼠IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京博奧森公司。MCP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛公司，TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自睿信生物公司，Annexin V-FIFC/PI試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司，轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Zata Life公司。

1.2 卡格列凈作用濃度篩選及分組處理將SV40 MES13細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中；采用CCK8法觀察不同濃度卡格列凈對(duì)細(xì)胞存活率的影響，篩選出卡格列凈的低劑量干預(yù)濃度為5μoml/L，高劑量干預(yù)濃度為15μoml/L。將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、高糖組、卡格列凈1組、卡格列凈2組。正常組在含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，高糖組、卡格列凈1組、卡格列凈2組在含35 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，卡格列凈1組、卡格列凈2組分別加入5、15μoml/L的卡格列凈。各組均培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清及細(xì)胞中炎癥因子檢測(cè)收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)MCP-1、TNF-α、IL-6。收集各組細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton破膜工作液室溫通透15 min；加入10%山羊血清封閉1 h，加入稀釋后的TNF-α一抗、IL-6一抗，4℃過(guò)夜；加入稀釋的二抗，室溫避光孵育1 h，加入DAPI工作液，室溫靜置10 min；熒光顯微鏡觀察，用Image J軟件分析各組免疫熒光圖像的平均熒光密度。

1.4 凋亡細(xì)胞檢測(cè)收集各組細(xì)胞，消化離心，參照Annexin V-FIFC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，在雙色流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖上，Annexin V-FIFC陽(yáng)性、PI陰性為早期凋亡或壞死細(xì)胞，Annexin V-FIFC、PI陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。計(jì)算早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞比例。

1.5 細(xì)胞中TGF-β1、p-Samd3、Smad3檢測(cè)采用Western blotting法。收集細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組樣品蛋白濃度后變性備用。上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，4℃搖床孵育一抗過(guò)夜；洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后用滴加化學(xué)發(fā)光液顯色并上機(jī)檢測(cè)。用Image J軟件對(duì)圖像灰度值進(jìn)行分析及處理，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 過(guò)表達(dá)Smad3對(duì)卡格列凈作用下高糖SV40 MES13細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及凋亡的影響觀察將SV40 MES13細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，分為NC組、HG組、HG+Can組、HG+Can+Smad3 OE組。NC組在含5.5 mmol/L葡萄糖的低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HG組、HG+Can組、HG+Can+Smad3 OE組在含35 mmol/L葡萄糖的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HG+Can組加入15μoml/L卡格列凈，HG+Can+Smad3 OE組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Smad3質(zhì)粒24 h后加入15μoml/L卡格列凈。培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)TGF-β1、p-Samd3、Smad3，方法同“1.5”；采用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞中的TNF-α、IL-6，方法同“1.3”；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，方法同“1.4”。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卡格列凈對(duì)高糖環(huán)境下SV40 MES13細(xì)胞的抗炎、抗凋亡作用

2.1.1 各組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平比較高糖組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平低于高糖組，卡格列凈2組上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平低于卡格列凈1組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組細(xì)胞上清液MCP-1、TNF-α、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05；與卡格列凈1組相比，△P＜0.05。

組別卡格列凈1組卡格列凈2組高糖組正常組MCP-1 8 588.13±347.20#5 848.40±137.24#△18 207.20±769.58*8 341.93±573.04 TNF-α 390.01±22.55#290.73±11.37#△431.88±24.95*154.28±8.53 IL-6 89.90±3.00#79.03±0.94#△112.68±1.94*81.53±3.31

2.1.2 各組細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)比較高糖組細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組TNF-α、IL-6表達(dá)低于高糖組，卡格列凈2組細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)低于卡格列凈1組（P均＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)比較（±s）

表2 各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)比較（±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05，與卡格列凈1組相比，△P＜0.05。

組別卡格列凈1組卡格列凈2組高糖組正常組TNF-α 10.56±0.80#7.20±0.30#△20.12±0.68*5.66±1.05 IL-6 23.60±0.99#16.85±0.70#△37.52±0.89*9.89±0.25

圖1 卡格列凈1組、卡格列凈2組、高糖組、正常組細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)情況（免疫熒光法）

2.1.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較高糖組早、晚期凋亡細(xì)胞比例高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組早期凋亡細(xì)胞比例低于高糖組，卡格列凈2組早期凋亡細(xì)胞比例低于卡格列凈1組（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.1.4 各組細(xì)胞TGF-β1、p-Samd3/Smad3表達(dá)比較高糖組TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3高于正常組，卡格列凈1組、卡格列凈2組TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3低于高糖組（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡情況、TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3比較（±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡情況、TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3比較（±s）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05，與卡格列凈1組相比，△P＜0.05。

組別卡格列凈1組卡格列凈2組高糖組正常組早期凋亡細(xì)胞比例（%）9.47±1.52#5.80±0.56#△13.84±1.08*4.55±0.35晚期凋亡細(xì)胞比例（%）7.36±2.93 3.41±0.78 9.71±5.08*2.45±0.93 TGF-β1 0.95±0.48#0.59±0.23#1.71±0.36*0.92±0.34 p-Smad3/Smad3 0.81±0.32#0.48±0.05#1.60±0.41*0.75±0.31

2.2 過(guò)表達(dá)Smad3對(duì)卡格列凈作用下高糖SV40 MES13細(xì)胞炎癥因子表達(dá)及凋亡的影響

2.2.1 各組細(xì)胞TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3比較NC組、HG組、HG+Can組、HG+Can+Smad3 OE組TGF-β1相對(duì)表達(dá)量分別為0.66±0.09、1.07±0.02、0.84±0.03、1.00±0.08，p-Smad3/Smad3分別為0.30±0.01、1.00±0.01、0.83±0.03、0.91±0.02。HG組TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3高于NC組，HG+Can組TGF-β1表達(dá)及p-Smad3/Smad3低于HG組，HG+Can+Smad3 OE組TGF-β1表 達(dá) 及p-Smad3/Smad3高于HG+Can組（P均＜0.05）。

2.2.2 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)比較HG組TNFα、IL-6表達(dá)高于NC組，HG+Can組TNF-α、IL-6表達(dá)低于HG組，HG+Can+Smad3 OE組TNF-α表達(dá)高于HG+Can組（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較HG組早、晚期凋亡細(xì)胞比例高于NC組，HG+Can組早、晚期凋亡細(xì)胞比例低于HG組，HG+Can+Smad3 OE組早、晚期凋亡細(xì)胞比例高于HG+Can組（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 過(guò)表達(dá)Smad3對(duì)卡格列凈作用下高糖環(huán)境SV40 MES13細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)及凋亡的影響（±s）

表4 過(guò)表達(dá)Smad3對(duì)卡格列凈作用下高糖環(huán)境SV40 MES13細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)及凋亡的影響（±s）

注：與NC組相比，*P＜0.05；與HG組相比，#P＜0.05；與HG+Can組相比，△P＜0.05。

組別HG+Can+Smad3 OE組HG+Can組HG組NC組TNF-α 49.37±5.37△43.70±0.88#60.96±1.58*37.12±0.75 IL-6 51.20±2.06 47.33±2.63#63.56±2.35*47.97±5.18早期凋亡細(xì)胞比例（%）6.46±0.46△2.62±0.13#8.30±0.42*0.69±0.16晚期凋亡細(xì)胞比例（%）4.96±0.58△2.16±0.15#6.97±0.34*0.46±0.06

3 討論

據(jù)報(bào)道，30%～50%的T2DM患者會(huì)發(fā)展為DKD，尋找有效防治DKD的方法一直是目前研究的熱點(diǎn)［11］。SGLT-2抑制劑是一種新型的口服降糖藥，大量臨床研究已證實(shí)其具有腎保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍不明確［12］。

高血糖可引起腎小球基底膜增厚、系膜擴(kuò)張、系膜細(xì)胞增生肥大等，最終導(dǎo)致腎小球彌漫性硬化［13］。上述病理改變提示，在糖尿病腎損傷中，對(duì)腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)可能是防治DKD的有效策略。

持續(xù)的高糖環(huán)境能誘發(fā)炎癥，而炎癥能直接破壞腎臟結(jié)構(gòu)，形成惡性循環(huán)，造成不可逆的腎損傷。炎癥因子種類繁多，如趨化因子、促炎細(xì)胞因子和黏附因子等［14］。本研究選取MCP-1、IL-6、TNF-α觀察高糖環(huán)境對(duì)腎小球系膜細(xì)胞分泌炎癥因子的影響，結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下，腎小球系膜細(xì)胞合成分泌MCP-1、TNF-α、IL-6明顯增加，并促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，證實(shí)高糖環(huán)境介導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)加速細(xì)胞凋亡。

TGF-β被認(rèn)為是DKD的重要致病因子［15］，其中TGF-β1是導(dǎo)致腎損傷最重要的細(xì)胞因子［16］。TGF-β1可激活下游Smad3，誘導(dǎo)分泌各種炎癥因子、促纖維化因子，從而介導(dǎo)腎臟炎癥、纖維化的發(fā)生發(fā)展。TGF-β/Smad3信號(hào)通路被認(rèn)為是系膜細(xì)胞激活的主要通路［17］。湯夏蓮等［18］研究發(fā)現(xiàn)，高糖可引起系膜細(xì)胞缺失和凋亡，并上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。ZHANG等［19］研究表明，在DKD模型中調(diào)控TGF-β/Smad3信號(hào)通路可介導(dǎo)MCP-1的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下，SV40 MES13細(xì)胞中TGF-β1及p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)水平明顯增加，說(shuō)明TGF-β/Smad3信號(hào)通路可能在高糖介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用。

SGLT-2抑制劑通過(guò)選擇性抑制SGLT-2對(duì)葡萄糖和鈉的重吸收，促進(jìn)尿糖、尿鈉排泄，并降低腎小球高濾過(guò)狀態(tài)，從而達(dá)到降糖目的，還具有抗炎、抗氧化等作用［20-21］。SGLT-2抑制劑可用于DKD患者，其抗炎作用也被越來(lái)越多的研究所證實(shí)。TERAMI等［22］發(fā)現(xiàn)，對(duì)db/db小鼠進(jìn)行12周的達(dá)格列凈治療后，可改善腎小球系膜擴(kuò)張并減少小鼠腎臟中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；另外，體外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，達(dá)格列凈可抑制高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及MCP-1、TGF-β等表達(dá)。ALI等［23］研究表明，卡格列凈在腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠CKD模型中具有抗炎、抗氧化作用。VALLON等［24］通過(guò)糖尿病小鼠模型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)恩格列凈可介導(dǎo)NF-κB通路抑制其下游CCL2、IL-6等表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，6種不同的SGLT-2抑制劑治療糖尿病小鼠均可降低體內(nèi)IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α水平［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，卡格列凈可減少高糖環(huán)境下SV40 MES13細(xì)胞炎癥因子分泌及細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Smad3可使卡格列凈作用下的高糖SV40 MES13細(xì)胞p-Smad3/Smad3、TGF-β1、TNF-α表達(dá)增高并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，卡格列凈可抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路激活。由此推測(cè)，卡格列凈抑制高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子分泌及細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。上述研究結(jié)果為卡格列凈治療DKD的機(jī)制研究提供了新的理論基礎(chǔ)。