賀焱 杜娟 胡晨琳 楊玲 劉艷群 黃昶荃

1.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000

2.綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽(yáng) 621000

3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016

骨骼系統(tǒng)通過(guò)骨重建的方式維持其骨量及生理結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，一旦骨重建失衡則易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)。硬化蛋白被認(rèn)為具有負(fù)向調(diào)節(jié)骨重建的作用，在骨質(zhì)疏松的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。硬化蛋白單克隆抗體(Scl-Ab)的出現(xiàn)在治療骨質(zhì)疏松上向前邁出了一大步，在已經(jīng)完成的幾項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)中證明了羅莫單抗(Romosozumab，ROMO)在目前常用的抗骨質(zhì)疏松藥物中具有更好的作用。ARCH試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在具有高骨折風(fēng)險(xiǎn)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性中，ROMO治療12個(gè)月繼以阿侖膦酸鈉治療后發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)顯著低于單獨(dú)使用阿侖膦酸鈉[1]。FRAME臨床試驗(yàn)比較了ROMO與特立帕肽對(duì)接受雙膦酸鹽治療后的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女骨密度的影響，發(fā)現(xiàn)ROMO能促進(jìn)髖骨骨密度增加，而在特立帕肽中未觀察到[2]。但由于對(duì)硬化蛋白認(rèn)識(shí)不足，硬化蛋白抗體的研究受限，同時(shí)對(duì)其不良反應(yīng)還存在擔(dān)憂[3-4]，因此硬化蛋白還有深入研究的價(jià)值與突破空間，本文將對(duì)硬化蛋白及其對(duì)骨代謝的作用機(jī)制進(jìn)展作一綜述。

1 硬化蛋白

1.1 硬化蛋白的結(jié)構(gòu)與來(lái)源

硬化蛋白是SOST基因表達(dá)的一種含190個(gè)氨基酸的分泌型糖蛋白[3]，主要在骨骼系統(tǒng)中表達(dá)，通過(guò)阻斷典型Wnt/β-catenin信號(hào)通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)發(fā)揮作用。硬化蛋白是胱氨酸結(jié)家族的一個(gè)非典型成員，它包含其他家族成員中不存在的長(zhǎng)而靈活的N和C末端，剩余的殘基形成3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)1和環(huán)3中的殘基形成兩對(duì)扭曲的反向平行β鏈并在其尖端通過(guò)單個(gè)二硫鍵連接，在其凸面存在與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)[5]。環(huán)2具有多種構(gòu)象，是結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)的關(guān)鍵區(qū)域[6]。

硬化蛋白主要作用于骨骼系統(tǒng)，骨細(xì)胞是其主要來(lái)源[7]。之后在其他系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)了Sost mRNA并發(fā)揮生理或病理作用，如促進(jìn)血管鈣化[8]、調(diào)節(jié)B細(xì)胞的發(fā)育和分化[9]等。

1.2 硬化蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)

最初，硬化蛋白是在對(duì)硬化癥(Sclerosteosis)和范布赫姆病(Van Buchem disease)的研究中發(fā)現(xiàn)的，在這兩種疾病中均發(fā)現(xiàn)SOST基因編碼的硬化蛋白的突變，且都表現(xiàn)為高骨量疾病[10]。硬化癥由SOST基因突變導(dǎo)致，而在范布赫姆病中，在該基因內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)致病突變，但在其染色體17q12上有52kb缺失，影響了SOST基因的轉(zhuǎn)錄[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SOST表達(dá)所必需的增強(qiáng)子元件、進(jìn)化保守區(qū)5(ECR5)以及肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(Mef2c)對(duì)SOST轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，Mef2c通過(guò)與ECR5結(jié)合調(diào)節(jié)SOST轉(zhuǎn)錄[12]。另外，DNA甲基化調(diào)節(jié)SOST的表達(dá)，Reppe等[13]在OP中觀察到SOST啟動(dòng)子甲基化增加，降低了血清硬化蛋白濃度降低并減少了對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，進(jìn)一步促進(jìn)骨形成。硬化蛋白對(duì)骨代謝的作用備受重視，但對(duì)調(diào)節(jié)其表達(dá)機(jī)制的了解還很少。

2 經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路：硬化蛋白的主要作用通路

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是硬化蛋白作用的主要通路[3]。當(dāng)細(xì)胞外Wnt配體與跨膜受體(Frizzled)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)形成三元復(fù)合物，將導(dǎo)致破壞復(fù)合物移位到細(xì)胞膜[14]。破壞復(fù)合物是軸蛋白(Axin)、酪蛋白激酶1(CK1)、腺瘤性息肉病大腸桿菌(APC)以及糖原合酶激酶3(GSK3)組成的復(fù)合物，可以使LRP5/6胞內(nèi)區(qū)域磷酸化，募集軸蛋白(Axin)，破壞破壞復(fù)合物的活性，進(jìn)而導(dǎo)致非磷酸化的β-catenin聚集在細(xì)胞質(zhì)中，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(Tcf)和淋巴因子結(jié)合因子(LEF)的激活因子發(fā)揮作用，啟動(dòng)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄[15]。在硬化蛋白抑制狀態(tài)下，硬化蛋白與LRP5/6細(xì)胞表面受體結(jié)合，阻止Wnt配體與LRP5/6相互作用，將抑制典型的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin被磷酸化并被破壞復(fù)合物靶向泛素化，在蛋白酶體中被降解[14]。

硬化蛋白還可以通過(guò)非經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用。在軟骨細(xì)胞中，Wnt3a可激活c-JunN末端激酶(JNK)和PKC，用硬化蛋白處理僅抑制磷酸化JNK，表明硬化蛋白可通過(guò)非經(jīng)典c-JunN末端激酶(JNK)信號(hào)通路發(fā)揮作用[16]。針對(duì)不同Wnt配體，硬化蛋白可能還存在其特有通路。

在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)中，LRP5/6與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP4)發(fā)揮著重要作用，對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必不可少。LRP5和LRP6具有高度同源性并在機(jī)體組織中廣泛表達(dá)，它們?cè)诮閷?dǎo)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)方面具有相似的功能。LRP4與LRP5/6結(jié)構(gòu)相似，但在硬化蛋白中發(fā)揮著不同的作用。

2.1 LRP5/LRP6

LRP5和LRP6為單程跨膜蛋白，存在于細(xì)胞表面，其胞外區(qū)由4個(gè)重復(fù)單元(從N到C末端命名為E1到E4)組成，每個(gè)重復(fù)單元都有一個(gè)YWTDLDL-螺旋域和一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣域。Bourhis等[17]研究發(fā)現(xiàn) E1結(jié)合硬化蛋白中的短肽，因此LRP5/6 E1可作為藥物研制的靶點(diǎn)。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)硬化蛋白的C端與LRP6 E2之間存在結(jié)合位點(diǎn)，并能增加SOST與LRP6親和力，但其作用不如SOST環(huán)2-LRP6 E1廣泛。因此針對(duì)環(huán)2和C端肽的抗體治療效果可能更好、不良反應(yīng)更少，是藥物研發(fā)的另一種選擇。Sebastian等[19]通過(guò)測(cè)序技術(shù)來(lái)鑒定成骨細(xì)胞中受Wnt3a調(diào)控的靶基因，發(fā)現(xiàn)與LRP6相比，LRP5的缺失對(duì)Wnt3a信號(hào)傳導(dǎo)的影響很小。Choi等[20]通過(guò)使用含有喹喔啉的BMD4503-2與LRP5/6-硬化蛋白復(fù)合物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，恢復(fù)了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的下調(diào)活性。因此，未來(lái)可基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)針對(duì)LRP5/6-硬化蛋白相互作用的小分子抑制劑。

2.2 LRP4

最初研究發(fā)現(xiàn)，LRP4的第3個(gè)螺旋槳結(jié)構(gòu)域(E3)中發(fā)生了兩個(gè)產(chǎn)生類硬化癥的人類錯(cuò)義突變[21]，因此提出LRP4可能促進(jìn)硬化蛋白對(duì)Wnt信號(hào)的抑制作用。Fijalkowski等[22]在因LRP4突變而患有硬化癥的患者中發(fā)現(xiàn)血清硬化蛋白水平升高，因此推測(cè)硬化蛋白分泌后在LRP4的作用下保留在骨骼中發(fā)揮作用。Bullock等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)攜帶LRP4-R1170W錯(cuò)義突變的小鼠產(chǎn)生高骨量表型，并且對(duì)硬化蛋白水平的改變不太敏感。LRP4可作為藥物研究的靶點(diǎn)，其與硬化蛋白作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 硬化蛋白在骨骼系統(tǒng)中的作用

3.1 破骨細(xì)胞

已知RANKL/OPG比值是破骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因素并影響其活性，硬化蛋白可通過(guò)影響RANKL間接促進(jìn)骨吸收[23]。而缺乏β-catenin的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出成熟和礦化受損、RANKL表達(dá)增加及OPG表達(dá)減弱[3]。一直認(rèn)為破骨細(xì)胞不表達(dá)Wnt受體，硬化蛋白通過(guò)作用于成骨細(xì)胞Wnt通路影響RANKL進(jìn)一步作用于破骨細(xì)胞，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)未能排除其他通路對(duì)β-catenin的影響，并且目前所有研究均未表明成骨細(xì)胞Wnt通路如何影響RANKL。Weivoda等[24]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞可表達(dá)經(jīng)典的Wnt受體，Wnt3a直接通過(guò)破骨細(xì)胞前體中的經(jīng)典(β-catenin)和非經(jīng)典(cAMP/PKA)途徑抑制破骨細(xì)胞分化。

3.2 成骨細(xì)胞

成骨細(xì)胞起源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)，在Wnt/β-catenin信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子(如Runx2和Osterix)的特異性激活下，骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化[3]，產(chǎn)生并礦化骨基質(zhì)，部分成骨細(xì)胞作為骨細(xì)胞嵌入鈣化基質(zhì)中。硬化蛋白作為骨形成抑制劑的作用貫穿于成骨細(xì)胞譜系：抑制骨祖細(xì)胞的增殖，影響成骨前體細(xì)胞的增殖和募集，抑制成骨細(xì)胞的成熟和分化，負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞的活性。在老年卵巢切除大鼠中發(fā)現(xiàn)Scl-Ab可以促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖并減少凋亡[25]，Scl-Ab還能增加成骨細(xì)胞前體的數(shù)量并促進(jìn)其分化為成熟成骨細(xì)胞[26]，同時(shí)增加I型前膠原氨基末端前肽(P1NP)、骨特異性堿性磷酸酶(BSAP)和骨鈣素等骨形成標(biāo)記物[27]。另外，Thouverey等[28]發(fā)現(xiàn)硬化蛋白還可以通過(guò)激活血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)及其下游信號(hào)通路抑制成骨細(xì)胞分化。在人類成骨細(xì)胞中，硬化蛋白通過(guò)激活caspase1、3、4和7以及增加促凋亡因子bax的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。

硬化蛋白還具有維持骨襯里細(xì)胞(bone lining cell，BLC)靜止?fàn)顟B(tài)的作用，骨襯里細(xì)胞相當(dāng)于成骨細(xì)胞儲(chǔ)備池，使用Scl-Ab治療后，小鼠BLC在骨膜和皮質(zhì)內(nèi)表面迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S的成骨細(xì)胞[29]。但是目前對(duì)于骨襯里細(xì)胞的研究還比較少，關(guān)于其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，或許可為促進(jìn)成骨作用提供新途徑。

3.3 骨髓脂肪組織

與成骨細(xì)胞一樣，骨髓脂肪組織(BMAT)也起源于BMMSC，因此 BMMSC分化為成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞之間存在競(jìng)爭(zhēng)性。SOST可通過(guò)抑制前脂肪細(xì)胞中的Wnt信號(hào)誘導(dǎo)脂肪生成[30]，而Scl-Ab可以恢復(fù)在去卵巢兔的骨髓脂肪擴(kuò)張[31]。另外，Abdallah等[32]發(fā)現(xiàn)骨髓脂肪細(xì)胞可以通過(guò)脂肪因子誘導(dǎo)NF-κB途徑激活的機(jī)制阻斷BMPs信號(hào)傳導(dǎo)，從而對(duì)BMMSC的成骨細(xì)胞分化發(fā)揮抑制作用，但目前沒(méi)有證據(jù)證明硬化蛋白對(duì)此過(guò)程有無(wú)影響。骨髓脂肪細(xì)胞對(duì)骨代謝的影響備受關(guān)注，但至今無(wú)重大進(jìn)展，硬化蛋白可能是潛在突破點(diǎn)。

3.4 調(diào)節(jié)骨結(jié)構(gòu)、骨量與骨強(qiáng)度

硬化蛋白是骨形成、骨量和骨強(qiáng)度的負(fù)向調(diào)節(jié)劑，Scl-Ab可拮抗這種作用，Scl-Ab還可以使骨折愈合過(guò)程中骨痂質(zhì)量與強(qiáng)度增加[30]。硬化蛋白還可以影響骨骼微結(jié)構(gòu)，Scl-Ab可以消除卵巢切除術(shù)導(dǎo)致的皮質(zhì)骨中骨細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常[33]以及改善雄性食蟹猴骨小梁微結(jié)構(gòu)[34]。Albiol等[35]研究發(fā)現(xiàn)硬化蛋白缺乏癥導(dǎo)致雄性和雌性小鼠的小梁骨形成增加，但僅導(dǎo)致雌性的小梁骨吸收減少，關(guān)于硬化蛋白對(duì)骨骼作用的性別差異還在進(jìn)一步研究中。

4 硬化蛋白單克隆抗體

硬化蛋白單克隆抗體是目前唯一一個(gè)兼具促進(jìn)骨形成與抑制骨吸收雙重作用的骨質(zhì)疏松治療藥物。如前所述，許多動(dòng)物以及臨床試驗(yàn)[10,36]均表明Scl-Ab治療可增加骨形成并降低骨吸收。但也存在許多問(wèn)題，硬化蛋白抗體的作用呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性，并且在不同骨組織衰減時(shí)間存在差異[37-38]，但其機(jī)制還不明確。另外，反復(fù)使用硬化蛋白抗體，骨形成反應(yīng)的減弱可能與Wnt拮抗劑(Dkk1、SFRP4、Bglap、Postn和WISP1)的上調(diào)有關(guān)[39]。關(guān)于ROMO臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的不良事件，特別是ROMO使用者的心血管風(fēng)險(xiǎn)[40]，是目前最令人擔(dān)憂的問(wèn)題，一項(xiàng)關(guān)于Romosozumab隨機(jī)臨床試驗(yàn)的薈萃分析表明，Romosozumab 的心血管事件風(fēng)險(xiǎn)可能更高[41]，因此針對(duì)硬化蛋白抗體的研發(fā)還有很大潛力與發(fā)展空間。

5 小結(jié)與展望

一直以來(lái)，抗骨吸收藥物占據(jù)抗骨質(zhì)疏松藥物的主要市場(chǎng)，研發(fā)促進(jìn)骨形成的藥物是一大趨勢(shì)。目前硬化蛋白對(duì)骨骼系統(tǒng)的作用機(jī)制研究已取得重大進(jìn)展，但由于其不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到限制，因此，目前在著力于開(kāi)發(fā)新型促骨形成藥物的同時(shí)，優(yōu)化硬化蛋白抗體，研制出不良反應(yīng)更小，療效更佳的硬化蛋白抗體也是有潛力的方向。硬化蛋白對(duì)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的作用研究已經(jīng)比較成熟，但關(guān)于硬化蛋白的體內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制以及其對(duì)骨髓脂肪細(xì)胞的作用機(jī)制研究還存在突破空間。另外，為進(jìn)一步明確硬化蛋白抗體的不良反應(yīng)，能更好地指導(dǎo)ROMO的臨床應(yīng)用，硬化蛋白對(duì)骨骼外系統(tǒng)的作用以及機(jī)制仍需深入研究。