高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源食品中復(fù)硝酚鈉的3種組分

鄒 游, 邵琳智, 藍(lán) 草, 陳思敏

(廣州海關(guān)技術(shù)中心食品與化妝品檢測(cè)研究所, 廣東 廣州 510623)

復(fù)合硝基酚鈉也稱復(fù)硝酚鈉,是幾種含硝基苯酚鈉鹽(有的產(chǎn)品是銨鹽)的復(fù)合型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,最早于20世紀(jì)90年代由日本旭化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社研發(fā),商品名為“愛(ài)多收”“愛(ài)豐收”和“Atonik”,由5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(5NG)、對(duì)硝基酚鈉(PNP)和鄰硝基酚鈉(ONP)按照一定比例構(gòu)成[1]。因具有高效、低毒、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn),復(fù)硝酚鈉在農(nóng)業(yè)以及養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域適用非常廣泛,既可單獨(dú)使用,也可作為增效劑與農(nóng)藥、肥料、飼料等配合使用。與飼料復(fù)配使用時(shí),復(fù)硝酚鈉能促進(jìn)動(dòng)物的食欲及其對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收,加快生長(zhǎng)發(fā)育,同時(shí)增強(qiáng)動(dòng)物的免疫能力,提高肉、蛋、奶、皮、毛的產(chǎn)量和質(zhì)量[2-4]。近年來(lái)有研究表明,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在農(nóng)作物中的殘留通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體會(huì)造成一定程度的危害。復(fù)硝酚鈉雖然毒性較低,但長(zhǎng)期食用含復(fù)硝酚鈉殘留的動(dòng)植物食品仍對(duì)人體健康存在潛在危害。美國(guó)環(huán)保局(EPA)已將鄰硝基酚和對(duì)硝基酚列為“優(yōu)先控制污染物”[5],對(duì)硝基酚也被列入中國(guó)優(yōu)先控制污染物黑名單[6]。歐盟委員會(huì)發(fā)布(EU)2021/590號(hào)條例,修改制定了復(fù)硝酚鈉在某些產(chǎn)品中的最大殘留限量[7],在作為商品銷售的豬、牛、羊、馬、家禽等可食用組織中復(fù)硝酚鈉的最大殘留限量(以5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、對(duì)硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉之和計(jì),并以5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉表示)均為0.03 mg/kg。2019年底,我國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部250號(hào)公告也正式將復(fù)硝酚鈉列入食用動(dòng)物禁止使用的藥品及其他化合物清單[8]。

目前,國(guó)內(nèi)尚未有農(nóng)畜產(chǎn)品中復(fù)硝酚鈉殘留監(jiān)控的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。查閱已發(fā)表的文獻(xiàn),復(fù)硝酚鈉在動(dòng)物源食品中的檢測(cè)方法大多為氣相色譜法和高效液相色譜法。其中,氣相色譜法需對(duì)樣品進(jìn)行酸化或衍生化后才能測(cè)定[9],前處理復(fù)雜,準(zhǔn)確度較低,報(bào)道的定量限較高,均為10 μg/kg;高效液相色譜法是檢測(cè)復(fù)硝酚鈉比較常用的方法[10,11],但現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的方法普遍存在樣品分析時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度較低等問(wèn)題,且僅報(bào)道了檢出限,不能滿足定量檢測(cè)的要求。相比而言,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在檢測(cè)動(dòng)物樣品中的藥物殘留特別是在禁用藥物的痕量分析中具有更好的靈敏性和更高的特異性[12-17],但卻幾乎無(wú)人用于復(fù)硝酚鈉中3種組分的同時(shí)檢測(cè)。原因在于ONP的分子結(jié)構(gòu)中,硝基基團(tuán)的氧原子與鄰位酚羥基的氫原子形成分子內(nèi)氫鍵,使酚羥基的氫原子不易被電離,導(dǎo)致了ONP的極性極弱,在電噴霧電離(ESI)模式下的靈敏度比其余兩個(gè)組分低了3個(gè)數(shù)量級(jí),從而影響整個(gè)方法的靈敏度[18]。然而,大氣壓化學(xué)電離(APCI)與電噴霧電離的原理不同,主要用于弱極性和小分子化合物的分析。Xing等[19]采用了帶APCI源的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)水產(chǎn)品中的復(fù)硝酚鈉進(jìn)行痕量分析,靈敏度很高。

本研究采用堿性溶液提取樣品,去除大部分水溶性雜質(zhì),后續(xù)通過(guò)調(diào)節(jié)pH值、乙腈反萃、正己烷脫脂凈化,能有效避免樣品提取過(guò)程中雜質(zhì)的干擾,減少基質(zhì)效應(yīng)(ME),再以APCI為電離方式,建立了高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)對(duì)復(fù)硝酚鈉3種組分進(jìn)行測(cè)定,以提高方法的正確度和靈敏度,為制定標(biāo)準(zhǔn)提供了較為可靠的參考依據(jù),填補(bǔ)了動(dòng)物源食品中復(fù)硝酚鈉殘留量測(cè)定的技術(shù)空白,具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500三重四極桿質(zhì)譜儀,帶大氣壓化學(xué)電離源,Analyst儀器控制及Multiquant數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)SCIEX公司); UFLC-XR液相色譜儀(包括輸液泵LC-20AD、自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20AC、柱溫箱CTO-20AC)(日本島津公司); BT223S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司); 3-30K高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司); Biotage Turbo Vap氮吹儀(南京新飛達(dá)光電科學(xué)技術(shù)有限公司); MS 3 basic渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)。

5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(CAS號(hào):67233-85-6,純度:96.15%)、對(duì)硝基苯酚鈉(CAS號(hào):824-78-2,純度:80.47%)(德國(guó)Ehrenstorfer公司);鄰硝基苯酚鈉(CAS號(hào):824-39-5,純度:99.9%,北京曼哈格生物科技有限公司);乙腈、甲醇(HPLC級(jí),美國(guó)Fisher Scientific公司);鹽酸(優(yōu)級(jí)純,廣州化學(xué)試劑廠);實(shí)驗(yàn)室用水為一級(jí)水(符合GB/T 6682-2008一級(jí)水要求);其他未作特殊說(shuō)明的試劑均為分析純。

1.2 樣品的前處理

1.2.1提取

稱取樣品2.00 g(精確至±0.02 g)于50 mL離心管中,加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,在渦旋混合器上混勻30 s后,振蕩提取15 min,以3 mol/L的鹽酸溶液調(diào)整pH至3.0后加入5.0 g氯化鈉,渦旋1 min,再加入8 mL乙腈,振蕩提取20 min,以4 000 r/min離心5 min。取上清液于另一50 mL離心管中,殘?jiān)^續(xù)加入8 mL乙腈,振蕩提取20 min后以4 000 r/min離心5 min,合并上清液,備用。

1.2.2凈化

在備用液中先加入5 mL飽和氯化鈉溶液,再加入10 mL正己烷,振蕩后以4 000 r/min離心5 min,取中間乙腈層于15 mL離心管中,于40 ℃下氮吹至約1.5 mL后加一級(jí)水定容至3 mL,以0.2 μm濾膜過(guò)濾,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

CORTECT C18色譜柱(100 mm×4.6 mm, 3 μm);流動(dòng)相A:水,流動(dòng)相B:甲醇;流速:0.80 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～3.0 min, 10%B～55%B; 3.0～6.5 min, 55%B; 6.5～9.5 min, 55%B～95%B; 9.5～9.6 min, 95%B～10%B, 9.6～13.0 min, 10%B。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:大氣壓化學(xué)電離源,負(fù)離子掃描模式;噴霧電壓(IS): -4 500 V;離子源溫度(TEM): 500 ℃;氣簾氣(氮?dú)?壓力:40 kPa;碰撞氣(氮?dú)?壓力:中等;霧化氣(氮?dú)?壓力:50 kPa;輔助加熱器壓力(氮?dú)?: 60 kPa;放電電流:-2 μA;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。

優(yōu)化后的3種目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 MRM模式下5NG、PNP和ONP的保留時(shí)間與質(zhì)譜參數(shù)

圖1 不同提取溶劑對(duì)5NG、PNP和ONP回收率的影響Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recoveries of 5NG, PNP and ONP

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

復(fù)硝酚鈉易溶于水,可溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。研究首先選取常用的有機(jī)試劑如甲醇、乙腈、0.1%乙酸乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑進(jìn)行提取效率對(duì)比試驗(yàn),直接加入等量有機(jī)試劑提取,再濃縮上機(jī),考察4種有機(jī)試劑對(duì)3種化合物回收率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。采用乙酸乙酯提取的溶液不能直接用于質(zhì)譜分析,需要氮吹至干轉(zhuǎn)換溶劑,但通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證,吹干復(fù)溶操作會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物損失嚴(yán)重,特別是鄰硝基酚鈉損失超過(guò)50%。其余3種有機(jī)提取試劑中,0.1%乙酸乙腈的提取效率最高,接近95%;乙腈次之,能達(dá)到90%。但直接加入有機(jī)溶劑容易使蛋白質(zhì)和脂肪含量較高的肌肉組織結(jié)團(tuán),難以分散,需要通過(guò)高速勻漿才能使其均勻分散,增加了前處理的復(fù)雜性。而且,用乙腈和0.1%乙酸乙腈直接提取雖然效率高,但提取濃縮后基質(zhì)效應(yīng)很大,需要設(shè)計(jì)更多的凈化步驟去除基質(zhì)效應(yīng),增加了實(shí)驗(yàn)的不確定性。復(fù)合硝酚鈉中的3種組分在堿性條件下均以負(fù)離子形式存在,親水性很強(qiáng),因此嘗試采取先用氫氧化鈉溶液進(jìn)行提取,再用有機(jī)溶劑反萃取的兩步提取方法進(jìn)行試驗(yàn)。強(qiáng)堿不僅能夠溶解大部分的水溶性雜質(zhì),而且能夠使蛋白質(zhì)變性,形成可以通過(guò)離心即能除去的沉淀,而微溶于水中的脂肪顆粒則可以通過(guò)后續(xù)用正己烷進(jìn)一步除去。被提取出來(lái)的溶液通過(guò)鹽酸調(diào)節(jié)成酸性,此時(shí),復(fù)硝酚鈉的3種組分呈現(xiàn)分子形態(tài)[20],疏水性強(qiáng),易富集于有機(jī)溶劑。考慮到要在質(zhì)譜儀上進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè),且提取液吹干會(huì)造成損失,故選擇提取效率較高、能用于質(zhì)譜分析的乙腈作為萃取劑進(jìn)行反萃,再通過(guò)加入氯化鈉使溶液飽和,進(jìn)一步降低目標(biāo)化合物在水相中的殘留,使其最大化地在有機(jī)相中富集,提高萃取效率,減少基質(zhì)效應(yīng)。故本研究采用堿溶液作為提取溶劑再用乙腈反萃取替代直接加入有機(jī)溶劑的提取方式。

2.2 凈化方法的選擇

提取液的凈化是樣品前處理過(guò)程中關(guān)鍵的一步,直接關(guān)系到方法的定量限和回收率。動(dòng)物基質(zhì)成分復(fù)雜,強(qiáng)堿溶液作為提取溶劑能把部分水溶性雜質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂肪去除。乙腈作為反萃溶劑能把微溶于水相的脂肪顆粒提取出來(lái),故要設(shè)計(jì)凈化方式除去溶于乙腈中的少量脂肪。研究選取正己烷和幾種不同品牌的除脂柱(Oasis PRiME HLB小柱和EMR-Lipid小柱)進(jìn)行脫脂試驗(yàn)。結(jié)果顯示,正己烷的液液分配凈化方式即可達(dá)到脫脂效果;而使用除脂柱前,要求備用液含20%水才能使脂肪被有效吸附,但此操作卻不利于后續(xù)氮吹濃縮和定容。因此,凈化步驟采用簡(jiǎn)單快捷的正己烷液液分配方法去除脂溶性雜質(zhì)。

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

2.3.1流動(dòng)相選擇

根據(jù)復(fù)硝酚鈉的性質(zhì),比較了甲醇、乙腈和不同濃度的甲酸銨和水溶液作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明,當(dāng)水相使用不同濃度的甲酸銨溶液時(shí),鄰硝基酚鈉和對(duì)硝基酚鈉均未能有效分離;當(dāng)水相使用一級(jí)水時(shí),3種組分有效分離且靈敏度達(dá)到最高。當(dāng)有機(jī)相選擇使用乙腈時(shí),出現(xiàn)了基線不平的現(xiàn)象,且鄰硝基酚鈉出峰前有干擾峰無(wú)法分離。通過(guò)比較保留時(shí)間、響應(yīng)值、背景干擾和洗脫能力,流動(dòng)相體系最終確定為甲醇-水,不但節(jié)省了溶劑配制的時(shí)間,且峰形好,靈敏度高。

2.3.2洗脫方式的優(yōu)化

在等度洗脫實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)甲醇大于55%時(shí),復(fù)硝酚鈉的3種組分便能有效分離,單純對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分離,重復(fù)性好,未見(jiàn)異常。但在實(shí)際樣品的色譜分離中發(fā)現(xiàn):甲醇比例達(dá)到55%～80%時(shí),前一個(gè)樣品在色譜柱上分離后因等度洗脫的有機(jī)相比例不高,洗脫能力較弱,導(dǎo)致極性較大的雜質(zhì)仍被保留在色譜柱上,干擾了下一個(gè)樣品的色譜分離。然而,當(dāng)甲醇比例大于80%時(shí),復(fù)硝酚鈉3種組分在色譜柱上均不保留,出峰時(shí)間小于2 min,容易被共流出物干擾影響定量。因此,優(yōu)化了梯度洗脫方式進(jìn)行樣品的色譜分離,確保當(dāng)次進(jìn)樣的目標(biāo)分析物和雜質(zhì)均能被洗脫,不會(huì)對(duì)下一個(gè)樣品分離造成影響,且保留時(shí)間適中,能最大限度地避免雜質(zhì)干擾。

2.4 離子源的選擇

研究對(duì)比了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法常用的電噴霧電離和大氣壓化學(xué)電離兩種電離模式。其中,5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉和對(duì)硝基酚鈉在ESI模式下響應(yīng)很高,但基質(zhì)效應(yīng)也很強(qiáng)。而鄰硝基酚鈉則因其硝基上的氧原子與鄰位酚羥基上的氫原子形成了分子內(nèi)氫鍵,產(chǎn)生鄰位效應(yīng)[21],酚羥基上的氫原子電離效率差,導(dǎo)致靈敏度比對(duì)硝基酚鈉低了至少3個(gè)數(shù)量級(jí),在樣品檢測(cè)中難以適應(yīng)禁用獸藥的痕量檢測(cè)要求,故容易被忽略和遺漏。APCI由于電離原理與ESI不同,離子轉(zhuǎn)化率更高,主要適用于弱極性化合物的檢測(cè)[22]。復(fù)硝酚鈉3種組分在APCI模式下分離的色譜峰見(jiàn)圖2,可見(jiàn)響應(yīng)良好,均能達(dá)到痕量分析水平,且不易形成多電荷分子碎片,離子競(jìng)爭(zhēng)少,雜峰較少,基質(zhì)效應(yīng)也較弱,故選擇使用APCI模式電離。

圖2 APCI模式下5NG、PNP和ONP混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of 5NG, PNP and ONP in mixed standard solutions at atmospheric pressure chemical ionization mode 5NG: 10 μg/L; PNP: 20 μg/L; ONP: 50 μg/L.

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

動(dòng)物源食品的樣品基質(zhì)復(fù)雜,進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)容易受到基質(zhì)中共流出物的干擾,影響方法的靈敏度和重復(fù)性,故需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)實(shí)際情況及可操作性,選擇按Matuszewski等[23]提出的提取后添加法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。以陰性空白基質(zhì)提取液作為溶劑,配制5.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1,測(cè)定其峰面積為A;以定容液為溶劑配制5.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2,測(cè)定其峰面積為B。ME=B/A×100%,結(jié)果見(jiàn)圖3。其中,ME>100%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<100%為基質(zhì)抑制效應(yīng),ME=100%可以當(dāng)作基質(zhì)效應(yīng)不存在,這是最為理想的一種情況,但實(shí)際操作中,一般ME值在85%～115%之間,則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯[24]。

圖3 在不同基質(zhì)中5NG、PNP和ONP的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 3 Matrix effects of 5NG, PNP and ONP on different matrices

針對(duì)復(fù)硝酚鈉這類弱極性化合物,本實(shí)驗(yàn)采用了相比ESI源離子化效率更高、基質(zhì)效應(yīng)較小的APCI源[25-27],由圖3可見(jiàn),3種目標(biāo)化合物在4種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)在95%～109%以內(nèi),表明優(yōu)化前處理方法后提取所得樣液對(duì)目標(biāo)化合物的基質(zhì)影響不大,因此無(wú)需使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正,提高了方法在日常多樣化樣品中的檢測(cè)效率。

表2 5NG、PNP和ONP的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.6 線性范圍與定量限

在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下,配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以儀器響應(yīng)峰面積對(duì)復(fù)硝基酚鈉3種組分的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉、對(duì)硝基酚鈉和鄰硝基酚鈉分別在0.5～10、1.0～20和2.5～50 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。當(dāng)樣品中的復(fù)硝酚鈉含量超過(guò)其線性范圍時(shí),可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù),使其上機(jī)濃度落在線性范圍內(nèi)。在陰性空白樣品中從低到高添加不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以定量離子對(duì)色譜峰的信噪比(S/N)大于10確定方法的定量限,結(jié)果見(jiàn)表2。

以魚肉為代表基質(zhì),添加定量限水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí),3種目標(biāo)化合物的定量離子對(duì)MRM色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 空白魚肉添加定量限水平5NG、PNP和ONP時(shí)的提取離子色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of 5NG, PNP and ONP in blank fish sample spiked at LOQ level

2.7 方法的準(zhǔn)確度

采用空白樣品加標(biāo)方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)。分別對(duì)豬肉、雞肉、魚肉和肝臟進(jìn)行3個(gè)水平(定量限、2倍定量限和10倍定量限)加標(biāo),每個(gè)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明,復(fù)硝酚鈉的3種組分在4種基質(zhì)中的平均回收率在81.4%～102%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.91%～8.85%之間(見(jiàn)表3),符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[28]規(guī)定的要求,可用于動(dòng)物源食品中復(fù)硝酚鈉的定量檢測(cè)。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

用本方法對(duì)市售豬肉、雞肉、魚肉和肝臟樣品共96份進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,其中1個(gè)雞肉樣品檢出對(duì)硝基酚鈉,含量為27.0 μg/kg, 5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉和鄰硝基酚鈉均未檢出。其余樣品也均未檢出3種復(fù)硝酚鈉。

3 結(jié)論

本文結(jié)合動(dòng)物源性基質(zhì)的特點(diǎn)和復(fù)硝酚鈉的理化性質(zhì)，對(duì)前處理方法和儀器方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了HPLC-APCI-MS/MS法，用于同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源食品中復(fù)硝酚鈉的3種組分。該方法檢測(cè)成本低，實(shí)驗(yàn)周期短，在多種基質(zhì)中的加標(biāo)回收率高，重復(fù)性好，定量科學(xué)準(zhǔn)確，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，能夠?yàn)閯?dòng)物源食品中復(fù)硝酚鈉的殘留檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。