超高效合相色譜法快速測(cè)定保健食品中10種脂溶性維生素

李佳晨, 曹 玲, 方 方, 施海蔚, 黃 青, 譚 力, 段巧蓮, 馮有龍

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 2. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 江蘇 南京 210019)

近年來(lái)隨著人民生活品質(zhì)的提高,越來(lái)越多的人選擇服用保健食品來(lái)補(bǔ)充人體所需的營(yíng)養(yǎng)成分,其中使用較多的一類(lèi)是維生素類(lèi)補(bǔ)充劑。維生素主要包括脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類(lèi)。其中,脂溶性維生素因可溶于有機(jī)溶劑,并以與脂肪相似的方式被吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)而得名。常見(jiàn)的脂溶性維生素包括維生素A、維生素D、維生素E和維生素K。脂溶性維生素的測(cè)定方法主要有熒光法[1]、分光光度法[2]、電化學(xué)法[3]、氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5,6]、柱交換色譜法[7]、加壓毛細(xì)管電色譜法[8]等。

保健食品中因常使用天然而非人工合成的原料,基質(zhì)較為復(fù)雜、干擾成分較多,脂溶性維生素的測(cè)定難度也大大增加。目前使用較多的方法是GB 5009.82-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素A、D、E的測(cè)定》和GB 5009.158-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測(cè)定》。上述標(biāo)準(zhǔn)大多采用高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等對(duì)維生素A、D、E、K中的一個(gè)或幾個(gè)組分進(jìn)行測(cè)定,但無(wú)法對(duì)這4種維生素同時(shí)測(cè)定,且樣品前處理過(guò)程復(fù)雜,對(duì)人員操作能力要求較高。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 201717《保健食品中9種脂溶性維生素的測(cè)定》采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定9種脂溶性維生素,但未包括維生素A棕櫚酸酯、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚等保健食品中常見(jiàn)的脂溶性維生素成分。

超高效合相色譜(UPC2)是以超臨界流體色譜法為主體,使用容易達(dá)到超臨界狀態(tài)的CO2為主要流動(dòng)相,配合不同有機(jī)溶劑作為改性劑,通過(guò)與不同檢測(cè)器聯(lián)用,來(lái)進(jìn)行分離和分析的技術(shù)[9-11]。UPC2分析柱的填料顆粒極細(xì),一般在2 μm以下,分析過(guò)程中可以通過(guò)對(duì)壓力、流速等條件的精細(xì)調(diào)控,實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的有效保留和分離。該技術(shù)同時(shí)還具備有機(jī)溶劑使用量少、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[10,12-14]。雖然該技術(shù)已用于脂溶性維生素[15,16]的分析,但是應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜的保健食品中仍未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用超高效合相色譜法,使用LC-Simulator軟件進(jìn)行色譜條件優(yōu)化,在7 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了保健食品中10種常用脂溶性維生素的分離及含量測(cè)定。本方法快速、準(zhǔn)確,樣品前處理簡(jiǎn)便,靈敏度高,重復(fù)性好,準(zhǔn)確度高,實(shí)用性強(qiáng),為維生素定性與定量檢測(cè)提供了一種高效可行的色譜檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY超高效合相色譜儀(配有二極管陣列檢測(cè)器以及Waters Empower TM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)),美國(guó)Waters公司;RF-20A高效液相色譜儀,日本Shimadzu公司;ST-16R冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo Scientific公司;Tube-mill 100控制型試管研磨機(jī),美國(guó)IKA公司。

維生素A棕櫚酸酯(批號(hào):100295-201801,純度:98.5%)、維生素D2(批號(hào):100155-201908,純度:99.8%)、維生素D3(批號(hào):100061-202110,純度:100%)、維生素E醋酸酯(批號(hào):100062-201811,純度:98.0%)、維生素K1(批號(hào):100156-201806,純度:99.7%),中國(guó)食品藥品檢定研究院;α-生育酚(批號(hào):LRAB6618,純度:100%)、γ-生育酚(批號(hào):LRAB6135,純度:100%)、δ-生育酚(批號(hào):LRAB6619,純度:100%),美國(guó)Sigma-Aldrich公司;維生素A醋酸酯(批號(hào):G131856,純度:98.5%),德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;β-生育酚(批號(hào):8-KPA-128-4,純度:95%),加拿大Toronto Research Chemicals公司;乙腈、甲醇、正己烷、二甲基亞砜均為色譜純,德國(guó)Merck公司;甲酸,色譜純,美國(guó)ACS公司;0.22 μm濾膜,上海安譜科技股份有限公司。

樣品A(劑型:膠囊,批號(hào):9624569-07,成分:天然維生素E醋酸酯)、樣品B(劑型:膠囊,批號(hào):817030801,成分:天然α-生育酚)、樣品C(劑型:片劑,批號(hào):1818842576471,成分:維生素A醋酸酯、維生素E醋酸酯、維生素D3)、樣品D(劑型:片劑,批號(hào):EW8999,成分：維生素K1),均為自購(gòu)樣品。

1.2 溶液的制備

精確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于10 mL容量瓶?jī)?nèi),用適量正己烷溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度均為2 500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃下避光保存。精確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量并用正己烷稀釋成100.0、75.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、0.5和0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

精密稱(chēng)取膠囊樣品內(nèi)容物1.0 g(片劑樣品則為碾碎的粉末混合物2.0 g)于50 mL棕色具塞試管中,加入75%二甲基亞砜水溶液20 mL,密塞,搖勻,45 ℃水浴超聲15 min,并時(shí)時(shí)振搖,冷卻至室溫,精密加入正己烷15 mL,機(jī)械振搖90 min,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,3 000 r/min離心10 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,直接進(jìn)樣分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPC2Viridis HSS C18 SB (100 mm×3.0 mm, 1.8 μm),流動(dòng)相:A為CO2, B為乙腈-甲醇(85∶15, v/v)。梯度洗脫:0～3.5 min, 2%B～6%B; 3.5～6.0 min, 6%B～15%B; 6.0～6.1 min, 15%B～2%B; 6.1～7.0 min, 2%B。流速:1.9 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):325 nm(維生素A醋酸酯、維生素A棕櫚酸酯)、284 nm(維生素E醋酸酯)、254 nm(維生素K1)、294 nm(α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚)、264 nm(維生素D2、維生素D3);動(dòng)態(tài)背壓(ABPR): 13.10 MPa;補(bǔ)償泵(0.2%甲酸甲醇溶液)流速:0.3 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

為使10種脂溶性維生素及其衍生物在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到分離,并具有良好峰形,比較了ACQUITY UPLC HSS C18(100 mm×3.0 mm, 1.7 μm)和ACQUITY UPC2Viridis HSS C18 SB (100 mm×3.0 mm, 1.8 μm)這兩種色譜柱對(duì)10種脂溶性維生素分離的影響。雖然UPC2Viridis HSS C18 SB柱和UPLC HSS C18柱都為C18柱,但是兩種色譜柱填料不同,使得兩種色譜柱對(duì)10種脂溶性維生素的分離產(chǎn)生了差別,結(jié)果表明,特別是在分離維生素D2、維生素D3時(shí),UPC2Viridis HSS C18 SB柱的分離效果明顯好于UPLC HSS C18柱。

表1 正交試驗(yàn)的因素及水平

2.1.2流動(dòng)相的選擇

超高效合相色譜一般以CO2作為流動(dòng)相A,以有機(jī)試劑作為流動(dòng)相B。流動(dòng)相B有兩個(gè)作用:第一,可提高CO2的溶解能力;第二,可作為強(qiáng)洗脫溶劑。流動(dòng)相B的改變會(huì)影響保留和選擇性。

本實(shí)驗(yàn)共考察了以甲醇、乙腈以及兩者不同比例的混合溶液(乙腈∶甲醇分別為95∶5、85∶15、75∶25、50∶50, v/v)作為流動(dòng)相B時(shí)的情況。甲醇在超高效合相色譜中極性很強(qiáng),而乙腈相比而言則極性較弱。使用甲醇作為流動(dòng)相B時(shí),10種脂溶性維生素的出峰時(shí)間雖然提前了很多,但是維生素D2、維生素D3兩個(gè)峰卻無(wú)法得到很好分離。而當(dāng)使用乙腈作為流動(dòng)相B時(shí),由于極性較弱,部分化合物出峰時(shí)間較長(zhǎng),在相同梯度條件下,維生素D2、維生素D3均未出峰。因此選用二者的混合溶液作為流動(dòng)相B,并對(duì)不同比例混合溶液的效果進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1所示,當(dāng)甲醇比例較高時(shí)各化合物出峰較快但分離不夠理想,當(dāng)乙腈比例較高時(shí)各化合物間的分離度較好。綜合考慮各化合物的出峰時(shí)間及分離效果,篩選出二者最佳混合比例為乙腈-甲醇(85∶15, v/v),此時(shí)不僅所有化合物都能在較短的時(shí)間內(nèi)出峰,各化合物也能得到有效分離。

圖1 不同比例甲醇和乙腈作為流動(dòng)相B時(shí)10種脂溶性維生素的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 10 fat-soluble vitamins with different ratios of methanol and acetonitrile as mobile phase B a. acetonitrile; b. acetonitrile-methanol (95∶5, v/v); c. acetonitrile-methanol (85∶15, v/v); d. acetonitrile-methanol (75∶25, v/v); e. acetonitrile-methanol (50∶50, v/v); f. methanol. 1. vitamin A acetate (VA acetate); 2. vitamin E acetate (VE acetate); 3. vitamin K1 (VK1); 4. vitamin A palmitate (VA palmitate); 5. α-tocopherol; 6. β-tocopherol; 7. γ-tocopherol; 8. δ-tocopherol; 9. vitamin D2 (VD2); 10. vitamin D3 (VD3).

2.1.3LC-Simulator軟件對(duì)色譜條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)多組分化合物的分離,可以對(duì)流速、柱溫、流動(dòng)相組成和梯度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)人工干預(yù)進(jìn)行色譜優(yōu)化費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,計(jì)算機(jī)輔助分離建模已逐漸成為分析化學(xué)中非常有效的工具[17-23]。

流速以及改性劑的濃度都會(huì)影響到出峰時(shí)間,流速越快、改性劑比例越高(即極性增加),則待測(cè)物出峰越快;而柱溫會(huì)影響流動(dòng)相在色譜柱中的密度,隨著柱溫升高,流動(dòng)相的密度會(huì)降低,從而延長(zhǎng)保留時(shí)間,同時(shí)對(duì)于待測(cè)物的保留性能也有一定影響[24,25]。

設(shè)計(jì)以下三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1):流速(Ⅰ)、梯度斜率(Ⅱ)和柱溫(Ⅲ)。得到的27組數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)ACD Labs軟件處理,進(jìn)入LC-Simulator軟件進(jìn)行建模,得到的三維模型見(jiàn)圖2a，三因素正交二維模型見(jiàn)圖2b、c、d。如圖2a的3D模型顯示,顏色從藍(lán)到紅的過(guò)程即為分離度從小到大變化的過(guò)程,最終選擇流速1.9 mL/min,柱溫30 ℃,按照該流速和柱溫,調(diào)整梯度斜率,綜合考慮峰位、分離度以及出峰時(shí)間之后,選擇了多段式的梯度(見(jiàn)1.4節(jié))。實(shí)際出峰時(shí)間與軟件預(yù)測(cè)出峰時(shí)間相比,變化值(Δ值)在5%以?xún)?nèi),說(shuō)明軟件預(yù)測(cè)結(jié)果可行性良好。按優(yōu)化后的條件采集色譜圖如圖3所示。

圖2 LC-Simulator軟件模擬的正交試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Result of orthogonal tests simulated by LC-Simulator a. 3D resolution map of flow rate, volume percentage of mobile phase B (acetonitrile-methanol (85∶15, v/v)) and column temperature; b. 2D resolution map of volume percentage of mobile phase B and column temperature; c. 2D resolution map of column temperature and flow rate; d. 2D resolution map of volume percentage of mobile phase B and flow rate.

圖3 10種脂溶性維生素的超高效合相色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the 10 fat-soluble vitamins detected by UPC2 UPC2: ultra performance convergence chromatography. 1. VA acetate; 2. VE acetate; 3. VK1; 4. VA palmitate; 5. α-tocopherol; 6. β-tocopherol; 7. γ-tocopherol; 8. δ-tocopherol; 9. VD2; 10. VD3.

2.2 前處理方法的選擇

本研究對(duì)測(cè)定維生素類(lèi)保健食品的前處理方法進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)正己烷可以有效地提取藥品中的脂溶性維生素,但是保健食品的基質(zhì)較為復(fù)雜,難以直接通過(guò)有機(jī)溶劑進(jìn)行提取,特別是含維生素D的產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)[26]調(diào)研,發(fā)現(xiàn)需要先對(duì)含維生素D的樣品進(jìn)行破乳,才能提取完全。所以本研究最終選擇先用75%二甲基亞砜水溶液破乳,再加入正己烷振蕩提取作為樣品的前處理方法,結(jié)果表明,經(jīng)破乳后,維生素D才能被提取完全。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線(xiàn)性范圍、檢出限及定量限

將10種脂溶性維生素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度(x, μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。結(jié)果如表2所示,各化合物在線(xiàn)性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9997,表示本方法線(xiàn)性良好。將10種脂溶性維生素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋,在信噪比為10(S/N=10)時(shí)得到10種脂溶性維生素的定量限(LOQ),在信噪比為3(S/N=3)時(shí),得到10種脂溶性維生素的檢出限(LOD),檢出限和定量限分別為片劑0.2～30 μg/g和0.8～75 μg/g,膠囊0.4～60 μg/g和2～150 μg/g。

2.3.2精密度

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,選取50 μg/mL和10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果表明,各組分峰面積的RSD值均小于1.3%,表示儀器精密度良好。

表2 10種脂溶性維生素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

2.3.3穩(wěn)定性

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,選取供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,各組分在24 h內(nèi)均穩(wěn)定,含量的RSD值均小于2%。

2.3.4重復(fù)性

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,每份樣品平行配制6份,計(jì)算含量和RSD值。結(jié)果表明,RSD均小于2%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 樣品含量測(cè)定及加標(biāo)回收率

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)4種樣品中維生素的含量進(jìn)行了測(cè)定,同時(shí)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016、GB 5009.158-2016的方法進(jìn)行含量測(cè)定,并進(jìn)行比較(見(jiàn)表3)。結(jié)果表明,4種樣品含量測(cè)定結(jié)果基本一致,表明建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確。考慮到樣品中的本底值較高,對(duì)照品加入量的多少對(duì)回收率準(zhǔn)確性影響較大。故參考《中國(guó)藥典》2020年版四部通則9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,4種樣品稱(chēng)樣量減半分別平行配制6份,加入各樣品含量50%的標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到樣品加標(biāo)回收溶液,并進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定,結(jié)果如表3所示,4種樣品平均回收率在96.5%～113.9%之間,RSD均小于4%,表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表3 4種樣品采用UPC2法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定時(shí)含量結(jié)果比較及其加標(biāo)回收率(n=6)

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測(cè)定保健食品中10種脂溶性維生素的超高效合相色譜方法,該方法可用于含有脂溶性維生素的保健食品的含量測(cè)定。本研究對(duì)4種含有脂溶性維生素不同劑型的保健食品進(jìn)行含量測(cè)定,相比于現(xiàn)行脂溶性維生素的測(cè)定方法,在保證結(jié)果同樣準(zhǔn)確的前提下,體現(xiàn)了前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn),有效避免了脂溶性維生素在長(zhǎng)時(shí)間、復(fù)雜的前處理及檢測(cè)過(guò)程中的損失,提高了脂溶性維生素檢測(cè)的效率以及準(zhǔn)確性。本方法可為保健食品中多種脂溶性維生素的同時(shí)測(cè)定提供技術(shù)支持,為保健食品功效成分的檢測(cè)探索新的方法和思路。下一步可以考慮進(jìn)一步對(duì)保健食品中其他脂溶性維生素、水溶性維生素以及黃酮、皂苷、脂肪酸等其他類(lèi)別成分的檢測(cè)進(jìn)行探索研究,進(jìn)一步拓展超高效合相色譜法在保健食品質(zhì)量控制中的應(yīng)用。