程 強(qiáng)，趙麗娟

(南京林業(yè)大學(xué)，林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

柳樹(Salixspp.)具有適應(yīng)性強(qiáng)、易繁殖的特點(diǎn)，在北半球溫帶地區(qū)廣泛分布[1]。柳樹是我國(guó)園林綠化和生態(tài)防護(hù)的主要樹種，然而柳樹人工林往往通過(guò)無(wú)性扦插種植，林分單一，常受到各種病害威脅。目前威脅柳樹種植的主要是一些真菌病害，如柵銹菌屬真菌(Melampsoraspp.)導(dǎo)致的葉銹病[2]，殼囊孢屬真菌(Cytosporaspp.)導(dǎo)致的爛皮病[3]等。病原真菌的基因組學(xué)研究，包括比較基因組、候選基因篩選和分析基因組進(jìn)化動(dòng)態(tài)，是發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵致病基因和闡述致病機(jī)制的主要途徑之一；這些基因和機(jī)制的闡述可為病害防治提供新的思路[4]，因此有必要針對(duì)柳屬植物的病原真菌基因組開展全基因測(cè)序研究。

柳樹痂囊腔菌(Elsino?murrayae，簡(jiǎn)寫為Emu)是座囊菌綱多腔菌目真菌，可在柳屬植物葉片上引起瘡痂狀葉斑病癥。柳樹瘡痂葉斑病危害范圍廣，在歐洲、大洋洲和南北美洲的各種喬木和灌木柳樹上均有描述[5-6]。筆者在中國(guó)南京的垂柳(S.babylonica)葉片上分離獲得了柳樹痂囊腔菌，發(fā)現(xiàn)其可侵染喬木柳中的垂柳和爆竹柳(S.fragilis)、灌木柳中的簸箕柳(S.suchowensis)，但在毛白楊(Populustomentosa)上可快速誘導(dǎo)類似超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡；組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)在該真菌的侵染早期柳樹葉片無(wú)明顯癥狀，侵染2 d后細(xì)胞出現(xiàn)死亡。筆者還克隆了1個(gè)侵染第2天高表達(dá)NLP(necrosis-and ethylene-inducing-like protein)基因，并且證實(shí)了NLP蛋白具有顯著的植物細(xì)胞毒性。這些初步的研究提示柳樹痂囊腔菌是柳屬植物的病原真菌，而且在分子水平上可與柳樹寄主發(fā)生相互作用[7]。另外，對(duì)甜橙痂囊腔菌(E.australis，簡(jiǎn)寫為Eau)的楊樹瘡痂病致病型(poplar spot anthracnose，PSA)的基因組序列進(jìn)行分析，該致病型可侵染多種楊屬植物及甜橙栽培品種‘愛媛38’，但不能侵染垂柳[8]。本研究使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)柳樹痂囊腔菌NL1菌株(E.murrayaeNL1)進(jìn)行基因組測(cè)序、組裝和注釋，在具有基因組信息的痂囊腔菌中進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示其近緣種是甜橙痂囊腔菌楊樹致病型NL1[E.australisNL1 (PSA)]菌株，兩者的比較基因組分析鑒定了可能參與寄主適應(yīng)性的候選基因，進(jìn)而還分析了柳樹痂囊腔菌的交配類型。這些信息有助于柳樹病原真菌的相互作用研究，為柳樹病害防治和抗性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 真菌培養(yǎng)和DNA提取

柳樹痂囊腔菌NL1菌株生長(zhǎng)于土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板，溫度25 ℃，生長(zhǎng)20 d。收集菌落經(jīng)液氮研磨后，使用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen, 北京)提取基因組DNA。使用ND 1000 Nanodrop(NanoDrop Technologies, 美國(guó))和凝膠電泳檢測(cè)基因組的DNA質(zhì)量和濃度。

1.2 基因組測(cè)序、組裝和注釋

基因組DNA經(jīng)超聲隨機(jī)打斷，電泳回收小于500 bp片段，加接頭后于南京集思慧遠(yuǎn)生物科技公司應(yīng)用Illumina HiSeq 2500 測(cè)序儀，雙端(Paired-end)150 bp測(cè)序。原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，包括去除接頭，去除低質(zhì)量讀序(Phred質(zhì)量值≤19的堿基占總堿基的15%以上的讀序)，去除含N比例大于5%的讀序。使用SOAPdenovo軟件[9]組裝過(guò)濾后數(shù)據(jù)，與BUSCO V3 的真菌數(shù)據(jù)庫(kù)(the fungi_odb9)[10]比對(duì)，評(píng)估組裝基因組的完整性。蛋白編碼基因的預(yù)測(cè)使用GeneMark-ES[11]，采用默認(rèn)參數(shù)；rRNA 和 tRNA 基因預(yù)測(cè)分別使用 RNAmmer V1.2[12]和tRNAScan-SE V1.4[13]。碳水化合物活性酶篩選采用 dbCAN2 工具中的3種方法(HMMER，DIAMOND和Hotpep)，采用默認(rèn)參數(shù)[14]。分泌蛋白預(yù)測(cè)使用SignalP 5.0[15]和 TMHMM[16]。小分泌蛋白在NCBI NR數(shù)據(jù)中BLASTp比對(duì)，采用Evalue≤1×10-10；小分泌蛋白在Pathogen Host Interactions(PHI)數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTp比對(duì)，采用Evalue≤0.001。 次生代謝物合成基因簇預(yù)測(cè)采用antiSMASH 5.0的真菌版本[17]。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化與全基因組共線性分析

在BUSCO的 fungi_odb9數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)選取100個(gè)真核通用基因[10]，在Elsino?屬真菌基因組中通過(guò)BLASTp(Evalue≤1×10-10)確定其同源基因，將這些同源基因的核苷酸序列串聯(lián)起來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用近緣的多腔菌目真菌Myriangiumduriaei為外類群。進(jìn)化樹構(gòu)建使用MEGA 7.0軟件[18]的鄰接法(Neighbor-Joining)，1 000次Bootstrap自抽樣驗(yàn)證。全基因組共線性分析使用CoGe比較基因組平臺(tái)的SynMap模塊[19]，BLASTn (Evalue≤ 0.000 1)和quota-align-merge模型。

1.4 柳樹痂囊腔菌(Emu)NL1菌株和甜橙痂囊腔菌楊樹致病型NL1菌株[Eau NL1 (psA)]比較分析

篩選共有特異性蛋白: 結(jié)合使用OrthoMCL軟件[20]和TBtools軟件中的雙向BLAST方法[21]，尋找Emu NL1相對(duì)于其他Elsino?屬真菌(不包括Eau NL1 (PSA)的特異性蛋白，尋找Eau NL1 (PSA)相對(duì)于其他Elsino?屬真菌(不包括Em uNL1)的特異性蛋白，然后在兩個(gè)特異性蛋白集合中尋找Emu NL1和Eau NL1 (PSA)的共有蛋白(OrthoMCL和雙向BLAST同時(shí)支持)。

篩選差異蛋白： OrthoMCL和雙向BLAST方法均不支持存在有直系同源關(guān)系的蛋白，為兩個(gè)真菌之間的差異蛋白。利用BLAST程序(Evalue≤1×10-10)將差異蛋白序列在GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，獲得注釋信息。使用TBtools軟件中的GO Enrichment功能進(jìn)行富集分析。

1.5 交配類型位點(diǎn)分析與檢測(cè)

使用近緣的Eau NL1 (PSA)的MAT1-1-1，MAT1-2-1，HP1和HP2蛋白，在Emu NL1基因組和蛋白組中分別進(jìn)行tBLASTn和BLASTp查找(Evalue≤1×10-10)。針對(duì)6個(gè)Emu菌株(NL1—NL6)，使用Emu的MAT1-2位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物基于MAT1-2-1基因序列設(shè)計(jì)，分別為MAT1-2-1-F (5′-GTTTGCGGTAGAGTATGAAGGAGT-3′)和MAT1-2-1-R (5′-AAAGATTCCAACATCATCTCCATT-3′)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Emu NL1基因組與注釋

針對(duì)Emu NL1的基因組測(cè)序原始數(shù)據(jù)(6.36 Gb，42 404 556個(gè)讀序)進(jìn)行了過(guò)濾，獲得了6.26 Gb，41 741 302個(gè)讀序的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。高質(zhì)量數(shù)據(jù)經(jīng)組裝產(chǎn)生了1個(gè)20.7 Mb的基因組，GC含量為54.49%。該基因組包含98個(gè)scaffold，測(cè)序量覆蓋組裝基因組241.09倍。最長(zhǎng)的12個(gè)scaffold(L50)占據(jù)基因組的一半，最小的scaffold大小為0.6 Mb(N50)。通過(guò)與BUSCO真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中290個(gè)單拷貝直系同源基因比對(duì)，顯示99%基因(288/290)具有匹配結(jié)果，表明基因組組裝結(jié)果完整度較高。在Emu NL1基因組中預(yù)測(cè)出8 256個(gè)蛋白編碼基因，50 tRNA，11個(gè)RNA基因(表1)。

表1 柳樹痂囊腔菌(Emu)NL1菌株基因組組裝注釋統(tǒng)計(jì)

2.2 Emu NL1致病相關(guān)基因注釋

通過(guò)比對(duì)dbcan2數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出486個(gè)基因編碼碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enZyme, CAZyme)，其中包括14個(gè)多糖裂解酶(polysaccharide lyase, PL)、228個(gè)糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GH)、54 個(gè)糖酯酶(carbohydrate esterase, CE)、68個(gè)輔助活性酶(auxiliary activitie, AA)、110個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases, GT)和12個(gè)具有糖結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module, CBM)的蛋白。184個(gè)碳水化合物活性酶是具有信號(hào)肽序列的分泌蛋白或膜蛋白，它們主要集中在PL(13個(gè))、GH(110個(gè))、CE(23個(gè))和AA(31個(gè))類型，表明這4種類型的CAZyme可接近植物細(xì)胞壁，具有參與植物細(xì)胞壁降解的潛力(圖1A)。

A.碳水化合物活性酶CAZymes；B.小分泌蛋白的特異性the specificity of SSPs；C.E. murrayae NL1和E. fawcettii的痂囊腔菌素合成基因簇the biosynthetic gene clusters of elsinochrome in E. murrayae NL1 and E. fawcettii。箭頭代表基因與轉(zhuǎn)錄方向，相同顏色箭頭代表同源基因Arrows represent genes and their transcription directions, and arrows with the same color represent homologous genes。 CAC42_918/ELSFAW08003. 聚酮合成酶polyketide synthase； CAC42_919/ELSFAW08004.依賴FAD的單加氧酶FAD-dependent monooxygenase；CAC42_920/ELSFAW08005.依賴FAD/FMN的氧化還原酶FAD/FMN-dependent oxidoreductase；CAC42_921/ELSFAW08006. MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體MFS transporter；CAC42_922/ELSFAW08007. O-甲基轉(zhuǎn)移酶O-methyltransferase；CAC42_923/ELSFAW08008.鋅指轉(zhuǎn)錄因子zing-finger transcription factor；CAC42_924/ELSFAW08009. MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體MFS transporter；CAC42_925/ELSFAW08010.依賴氧或FAD/FMN的氧化還原酶oxygen-，F(xiàn)AD/FMN-dependent oxidoreductase；CAC42_926/ELSFAW08011.漆酶laccase；CAC42_927/ELSFAW08012， beta-ig-h3成束蛋白beta-ig-h3 fasciclin。

植物病原真菌通過(guò)效應(yīng)因子干擾寄主免疫系統(tǒng)，操縱寄主各種生物學(xué)過(guò)程，以此實(shí)現(xiàn)成功的定殖。效應(yīng)因子通常是小分泌蛋白(small secreted protein，SSP)，且常與已知蛋白無(wú)明顯同源關(guān)系[22]。Emu NL1有783個(gè)蛋白具有信號(hào)肽序列，其中小于300個(gè)氨基酸且無(wú)穿膜結(jié)構(gòu)域的小分泌蛋白有193個(gè)。在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中BLASTp比對(duì)發(fā)現(xiàn)17個(gè)小分泌蛋白是Emu特有蛋白(Table S1)，這些蛋白可能作為Emu特有候選效應(yīng)因子參與柳樹的定殖；另外發(fā)現(xiàn)了44個(gè)只存在于Elsino?屬真菌的小分泌蛋白，這些候選效應(yīng)因子蛋白可能與該屬真菌共有的致病性機(jī)制相關(guān)(圖1 B)。部分小分泌蛋白與PHI數(shù)據(jù)庫(kù)中已驗(yàn)證的效應(yīng)因子具有較高的相似性，包括CAC42_7312對(duì)應(yīng)誘導(dǎo)寄主細(xì)胞死亡的NLP(比對(duì)上的病原真菌為Zymoseptoriatritici)，CAC42_5568對(duì)應(yīng)可抑制寄主對(duì)寡聚幾丁質(zhì)識(shí)別的Ecp6(Cladosporiumfulvum)，CAC42_2337對(duì)應(yīng)結(jié)合寄主葡聚糖酶抑制蛋白的XLP1(Phytophthorasojae)，CAC42_875對(duì)應(yīng)為Cf-2抗性蛋白識(shí)別的無(wú)毒蛋白VAP1(Globoderarostochiensis)。

根據(jù)在antiSMASH真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果，Emu NL1基因組具有16個(gè)次生代謝產(chǎn)物基因簇，分別為4個(gè)聚酮(polyketides，PKS)，7個(gè)非核糖體多肽(non-ribosomal peptides，NRPS)，1個(gè)雜合PKS-NRPS和4個(gè)多萜(Terpene)合成基因簇。痂囊腔菌素(elsinochrome)是一種真菌毒素，在氧和光存在時(shí)，痂囊腔菌素釋放活性氧，對(duì)植物組織產(chǎn)生毒害。Emu NL1基因組具有痂囊腔菌素合成基因簇(PKS類型)，與該基因簇的原型(柑橘痂囊腔菌E.fawcettii的EfETB基因簇)[23]相比，所有10個(gè)成員(CAC42_918-CAC42_927)具有高度的共線性，其編碼蛋白的平均一致性達(dá)81.2%，這表明Emu NL1具備產(chǎn)生痂囊腔菌素的遺傳基礎(chǔ)(圖1 C)。另外Emu NL1具有1個(gè)DHN 黑色素合成基因簇 (CAC42_1176-CAC42_1179)(PKS類型)和1個(gè)鐮刀菌素(fusarin)合成基因簇(CAC42_1916-CAC42_1924)(PKS-NRPS類型)；其他13個(gè)次生代謝物合成基因簇未找到高度相似的原型，產(chǎn)物未知。

2.3 痂囊腔菌屬真菌系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

目前已報(bào)道的痂囊腔菌屬真菌的基因組序列有6個(gè)，分別是葡萄痂囊腔菌(E.ampelina)YL-1菌株、3個(gè)柑橘痂囊腔菌(E.fawcettii)菌株，甜橙痂囊腔菌甜橙瘡痂致病型(sweet orange scab, SOS)Ea-1菌株[E.australisEa-1 (SOS)]和甜橙痂囊腔菌楊樹致病型NL1菌株(E.australisNL1 (PSA))[8,24-26]。為了解Elsino?屬真菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，使用100個(gè)通用真核基因構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果(圖2、表2)顯示Emu NL1與2個(gè)Eau菌株在1個(gè)高支持的進(jìn)化枝，而Eau和E.ampelina在另外一個(gè)進(jìn)化枝。此項(xiàng)結(jié)果與痂囊腔菌屬的已經(jīng)報(bào)道的多基因分型結(jié)果一致[7,27]，即，在痂囊腔菌屬中Emu與Eau具有臨近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。E.murrayae與其他痂囊腔菌屬真菌以及近緣的Myriangiumduriaei全基因組比對(duì)和共線性分析發(fā)現(xiàn)，Emu NL1與Eau NL1 (PSA)具有最長(zhǎng)的共線性長(zhǎng)度19.86 Mb，最高的平均一致性(74.5%)，以及最多的共線性基因數(shù)量(6 561個(gè))。

圖2 痂囊腔菌屬7種真菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

表2 柳樹痂囊腔菌 NL1與痂囊腔屬和多腔菌屬真菌的共線性分析

2.4 Emu NL1與Eau NL1 (PSA)比較及Emu NL1交配類型位點(diǎn)

Emu NL1與Eau NL1 (PSA)本身是近緣物種，而且侵染的寄主也是近緣物種(楊柳科的柳樹和楊樹)。這2種真菌共有的，同時(shí)在其他Elsino?屬真菌中缺失的基因，可能參與特異性定殖楊柳科植物。結(jié)合OrthoMCL和雙向BLAST方法在Emu NL1和Eau NL1 (PSA)中篩選出12個(gè)共有特異性蛋白，其中CAC42_7074/B9Z65_8229是1個(gè)有64/65個(gè)氨基酸的小分泌蛋白，無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)域特征，并且在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源蛋白；CAC42_1565/B9Z65_5438和CAC42_817/B9Z65_6139是這兩個(gè)真菌中特有的分泌蛋白；CAC42_4946/B9Z65_8048和CAC42_7243/B9Z65_1695是兩個(gè)涉及氧化還原過(guò)程的酶類，CAC42_1526/B9Z65_5383是絲裂原活化蛋白激酶，其他6對(duì)基因是功能未知的細(xì)胞內(nèi)蛋白。

Emu NL1和Eau NL1 (PSA)分別特異性的侵染柳屬和楊屬植物，因此兩種真菌可能存在差異的蛋白參與寄主的選擇。在兩種真菌之間比較分析分別篩選出752個(gè)Emu NL1和1 746個(gè)Eau NL1 (PSA)差異蛋白。267個(gè)Emu NL1和676個(gè)Eau NL1 (PSA)差異蛋白獲得了GO 注釋，GO富集顯示2種真菌的差異蛋白的注釋信息存在相同之處，即差異蛋白多集中于碳水化合物代謝過(guò)程和毒素代謝過(guò)程，多位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，多具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性和裂解酶活性(圖3)。

圖3 Emu NL1和Eau NL1 (PSA)之間差異蛋白的GO富集分析

在病原微生物和寄主的協(xié)同進(jìn)化中，寄主進(jìn)化出抗性蛋白(R蛋白)識(shí)別病原微生物的效應(yīng)因子(無(wú)毒蛋白)，啟動(dòng)超敏應(yīng)答，以此限制病原微生物的增殖。筆者前期實(shí)驗(yàn)顯示Emu NL1可在毛白楊上迅速誘導(dǎo)類似超敏反應(yīng)的細(xì)胞死亡[7]，進(jìn)一步分析Emu NL1所編碼的差異蛋白發(fā)現(xiàn)，其中有42個(gè)蛋白是小分泌蛋白(候選效應(yīng)因子)，這個(gè)蛋白集合可能包含被毛白楊識(shí)別效應(yīng)因子(表3)，可為將來(lái)無(wú)毒基因的篩選提供線索。

表3 Emu致病相關(guān)蛋白

前期研究已經(jīng)揭示了Eau NL1 (PSA)致病型交配系統(tǒng)，并且繪制兩種交配類型(mating type, MAT)位點(diǎn)的完整結(jié)構(gòu)。Eau NL1 (PSA) 的MAT位點(diǎn)兩側(cè)是保守的AP核酸內(nèi)切酶2(AP endonuclease, APN2)基因和Phox同源結(jié)構(gòu)域蛋白(Phox homology domain protein, Px)基因，MAT1-1位點(diǎn)攜帶典型的α盒(α-box)蛋白基因MAT1-1-1和假定蛋白基因HP1，MAT1-2位點(diǎn)攜帶典型的高遷移(high mobility group, HMG)蛋白基因MAT1-2-1和另一個(gè)假定蛋白基因HP2[8]。

使用Eau NL1 (PSA)的MAT位點(diǎn)基因在Emu NL1基因組中BLAST比對(duì)，只發(fā)現(xiàn)了同源的MAT1-2-1基因[基因位點(diǎn)編號(hào)(下同)為CAC42_7534]，兩者所編碼蛋白的一致性為46%。 CAC42_7534一側(cè)的基因(CAC42_7533)編碼APN2蛋白，另一側(cè)基因(CAC42_7535)編碼一個(gè)假定蛋白，然而這個(gè)假定蛋白與Eau NL1 (PSA)的HP2沒(méi)有明顯相似性。CAC42_7535的另一側(cè)即為Px蛋白基因。因此Emu NL1菌株攜帶MAT1-2位點(diǎn)(圖4A)。根據(jù)CAC42_7534序列設(shè)計(jì)引物，使用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的6個(gè)Emu菌株(NL1—NL6)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得了目標(biāo)大小的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4B)，因此這6個(gè)菌株均屬于MAT1-2交配類型。

灰色矩形代表基因外顯子，黑色箭頭代表轉(zhuǎn)錄方向，紅色箭頭代表MAT1-2檢測(cè)引物。Solid boxes represent the coding regions of the predicted genes interrupted by introns. Black arrows indicate the orientations of the coding sequences. Red arrows indicate MAT-specific primers。M.marker;2～7泳道為6個(gè)E. murrayae分離株lanes; 2-7. six E. murrayae isolates。

3 討 論

3.1 楊樹和柳樹的兩個(gè)痂囊腔菌的寄主適應(yīng)性

痂囊腔屬真菌具有高水平的寄主特異性。Fan等[27]對(duì)73種痂囊腔菌的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)其中69種僅發(fā)生于單一的寄主的種或?qū)?。痂囊腔菌的致病分子機(jī)制研究?jī)H見于痂囊腔菌素，包括其合成基因簇和調(diào)控方式，然而這種真菌次生代謝物可以對(duì)大部分植物造成毒害，不具備寄主選擇性[23]。E.ampelina、E.fawcettii和E.australis是葡萄、柑橘和甜橙最為嚴(yán)重的病害之一，主要侵染寄主果實(shí)，降低果實(shí)的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前這3個(gè)痂囊腔菌的多個(gè)菌株的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，揭示了大量的碳水化合物活性酶基因、候選效應(yīng)因子基因和次生代謝物合成基因簇，但這些研究尚未涉及寄主的適應(yīng)性研究[8，24-26]。

筆者最近在楊屬和柳屬植物的葉斑中分離鑒定了兩種痂囊腔菌，分別是甜橙痂囊腔菌楊樹致病型和柳樹痂囊腔菌。對(duì)Emu NL1菌株進(jìn)行基因組測(cè)序，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生分析和共線性分析發(fā)現(xiàn)，在已測(cè)序的痂囊腔菌中，Emu NL1和Eau NL1 (PSA)具有最為接近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、最多的共線性基因和最高的核苷酸一致性。楊樹和柳樹同屬于楊柳科，是典型的近緣樹種，Eau NL1 (PSA)侵染楊樹，目前尚未發(fā)現(xiàn)其侵染柳樹的證據(jù)，而Emu NL1則侵染柳樹，在毛白楊上誘導(dǎo)類似超敏反應(yīng)的應(yīng)答，這兩種真菌之間也具有高度的近緣關(guān)系，因此可以作為分析痂囊腔菌屬真菌寄主專化性或適應(yīng)性的研究對(duì)象。

本研究通過(guò)Eau NL1 (PSA)和Emu NL1比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)了兩者之間有12個(gè)共有蛋白在其他痂囊腔菌中缺失，因此這12個(gè)蛋白可能與特異性侵染楊柳科植物相關(guān)。另外本研究篩選了Eau NL1 (PSA)和Emu NL1之間的差異基因，發(fā)現(xiàn)這些差異基因的編碼蛋白集中于碳水化合物代謝和毒素代謝的生物學(xué)過(guò)程，這表明兩種真菌在降解寄主細(xì)胞壁、獲取營(yíng)養(yǎng)和產(chǎn)生具有毒性的次生代謝物方面等存在差異，這可能是兩種真菌分別適應(yīng)楊樹和柳樹寄主的原因。本研究在Emu NL1中還篩選出不存在于Eau NL1 (PSA)的42個(gè)小分泌蛋白(候選效應(yīng)因子)，這些蛋白可能包含毛白楊識(shí)別對(duì)象(無(wú)毒蛋白)，其能誘導(dǎo)之前觀察到的超敏反應(yīng)。

3.2 痂囊腔菌的交配類型

病原真菌通過(guò)有性繁殖創(chuàng)造新的遺傳組合，提高后代對(duì)寄主和環(huán)境的適應(yīng)性[28]，因此具有有性繁殖能力的異宗配合真菌具有更高的進(jìn)化潛力，其病害防治具有更大的挑戰(zhàn)性。大部分子囊菌的有性繁殖受單一位點(diǎn)控制，即交配類型(MAT)位點(diǎn)。異宗配合真菌的菌株要么攜帶MAT1-1位點(diǎn)，要么攜帶MAT1-2位點(diǎn)；而同宗配合真菌的菌株往往同時(shí)攜帶MAT1-1和MAT1-2位點(diǎn)[29]。本研究中的測(cè)序菌株Emu NL1攜帶單一的MAT1-2位點(diǎn)，并且沒(méi)有在基因組上發(fā)現(xiàn)MAT1-1-1基因的痕跡，因此Emu很可能具有異宗配合的交配系統(tǒng)，然而基于MAT1-2-1基因的特異性PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的6個(gè)菌株的交配類型均為MAT1-2?？紤]到痂囊腔菌無(wú)性孢子通過(guò)水濺傳播[30]，而這6個(gè)菌株分離于距離接近的葉片，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣品采集的范圍來(lái)驗(yàn)證Emu是否具有異宗配合的交配系統(tǒng)。

4 結(jié) 論

目前已經(jīng)有多種柳樹完成了基因組測(cè)序，然而目前還未見柳樹病原真菌的全基因組測(cè)序報(bào)道，這制約了柳樹-病原真菌的相互作用研究。本研究針對(duì)柳樹瘡痂葉斑病菌-柳樹痂囊腔菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，預(yù)測(cè)了致病相關(guān)的蛋白編碼基因，證實(shí)了柳樹痂囊腔菌和甜橙痂囊腔菌楊樹致病型具有接近的進(jìn)化關(guān)系，篩選出這2個(gè)病原真菌中參與寄主適應(yīng)性的候選基因，分析了柳樹痂囊腔菌的交配類型。本研究所提供的柳樹痂囊腔菌基因組信息以及比較基因組的結(jié)果對(duì)于柳樹病害防治和柳樹-病原真菌相互作用研究具有重要參考價(jià)值。