畢 菲 ，郭維華

（1）四川大學華西口腔醫(yī)院兒童口腔科，四川 成都 610041;2）口腔疾病研究國家重點實驗室，四川 成都 610041）

從牙根發(fā)育與牙周組織形成的生理性過程角度來看，赫特維希上皮根鞘是一組必不可少的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。當牙冠基本發(fā)育完成時，內(nèi)、外釉上細胞在頸環(huán)處增生，向根尖孔方向延長，星網(wǎng)狀層和中間層細胞消失，雙層鞘狀結(jié)構(gòu)的赫特維希上皮根鞘（hertwig’s epithelial root sheath，HERS）形成；通過上皮-間充質(zhì)相互作用（epithelialmesenchymal interaction，EMI），HERS 誘導其內(nèi)側(cè)的牙乳頭細胞（dental papilla cells，DPCs）分化為成牙本質(zhì)細胞，形成根部牙本質(zhì)；HERS 細胞也會誘導其外側(cè)的牙囊細胞（dental follicle cells，DFCs）分化為成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞，形成牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)[1]。HERS 細胞也能通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），進行成骨/成牙骨質(zhì)向分化，形成牙周組織[2]。鑒于HERS 細胞在牙根、牙周組織發(fā)育形成過程中的重要性與必要性，為了進一步探究其在牙周組織的修復再生中的應用潛力以及明確今后的研究重點，筆者將HERS 的起源、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，以及近年來關(guān)于HERS 的生物學行為、參與牙及支持組織發(fā)育調(diào)控、應用于組織再生修復的研究進展綜述如下。

1 HERS 的起源和形態(tài)結(jié)構(gòu)特征研究

1.1 HERS 的起源

HERS 是由德國生物學家Oskar Hertwig 于1874 年在兩棲動物中首次發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)[3]。在兩棲動物和非鱷魚爬行動物中，HERS 保持連續(xù)而不斷裂，在牙與骨之間有更加牢固的連結(jié)形成[4]；在鱷魚和哺乳動物中，HERS 是一個短暫存在的結(jié)構(gòu)，會發(fā)生斷裂，并最終形成馬拉瑟上皮剩余，在上皮結(jié)構(gòu)的空隙中，牙周韌帶能夠在牙根與牙槽骨之間形成靈活的連結(jié)[3]。

1.2 HERS/ERM 的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征研究

Suzuki M 等[5]發(fā)現(xiàn)HERS 由兩層細胞構(gòu)成，內(nèi)層細胞呈立方狀，外層細胞扁平，細胞間通過橋粒和間隙連接緊密連接，周圍被連續(xù)的基底膜包繞。Hamamoto Y 等[6]發(fā)現(xiàn)HERS 斷裂后，立即能夠觀察到上皮細胞島形成，細胞形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)含少量粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Andujar M B 等[7]觀察到小鼠磨牙牙根的早期發(fā)育期間，HERS 細胞在EMI 的過程中失去了立方狀的外形，變得扁平；牙周膜中一部分細胞的粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜在面對無細胞牙骨質(zhì)一側(cè)與層粘連蛋白和Ⅳ型膠原有特異性結(jié)合，并且這些細胞表達角蛋白，卻不表達波形蛋白。

2 HERS 在牙根發(fā)育過程中參與調(diào)控的研究

2.1 HERS 參與的重要分子、信號通路調(diào)控研究

HERS 是牙根發(fā)育的重要引導結(jié)構(gòu)，過往研究發(fā)現(xiàn)Bmp、Tgfβ、β-catenin、Wnt、Fgf、Shh、Nfic、Smad 等信號分子之間形成復雜的信號通路以及級聯(lián)網(wǎng)絡，對牙根的發(fā)育進行綜合調(diào)控。

Mu H 等[8]發(fā)現(xiàn)上皮來源的Bmp2 和Bmp4 在HERS 退化過程中以及牙根部間充質(zhì)的分化、成熟中，扮演了不可或缺的角色。Yang S 等[9]發(fā)現(xiàn)在牙根發(fā)育時，β-catenin 失活會導致HERS 提前斷裂，細胞間黏附降低、連接蛋白表達下降、EMT 增加；相反，β-catenin 的穩(wěn)定化使得HERS 不斷裂，HERS 細胞無法解離，連接蛋白表達增加。Nemoto，E 等[10]發(fā)現(xiàn)HERS 能夠通過Wnt/β-catenin 信號通路誘導DFCs 的成牙骨質(zhì)/成骨向分化。Huang H 等[11]發(fā)現(xiàn)在RANKL 敲除小鼠的磨牙中，HERS 無法正常向根方延長并且排列雜亂無序，牙根發(fā)育和牙齒萌出受阻；且與根尖組織成牙向分化相關(guān)的基因表達降低。Nakatomi M 等[12]發(fā)現(xiàn)Shh 信號通路與HERS 的功能相關(guān)，并能調(diào)控胚胎時期牙發(fā)育過程中的EMI。Yokohama-Tamaki T 等[13]發(fā)現(xiàn)在牙根發(fā)育過程中，F(xiàn)gf10 的過表達會抑制HERS 形成，F(xiàn)gf10 信號的消失會引起牙冠發(fā)育轉(zhuǎn)向牙根發(fā)育。

Wang J 等[14]對牙根發(fā)育過程中的重要信號通路進行了綜合歸納，發(fā)現(xiàn)Nfic、Osterix、βcatenin 和sonic hedgehog 都在牙根發(fā)育中起到重要作用，并且HERS 在牙根發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮的作用也是至關(guān)重要的。Li J 等[15]對牙根發(fā)育過程中的細胞及分子調(diào)控機制進行綜合歸納，發(fā)現(xiàn)Bmp/Tgfβ 信號通路、Wnt 信號通路以及Fgf 和Hh 信號通路在牙根發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用；HERS 引導了牙根發(fā)育。Huang X 等[16]發(fā)現(xiàn)TGFβ/BMP、Smad 以及Shh 信號通路通過調(diào)節(jié)Nfic表達來控制牙根發(fā)育，HERS 和神經(jīng)嵴來源的牙源性間充質(zhì)之間的相互作用可能引導了牙根形成的大小、形狀及數(shù)目。

除上述常見的HERS 細胞參與的分子及信號通路以外，Tian Q 等[17]發(fā)現(xiàn)Vps4b 基因突變可能通過改變HERS 中CK14 和PCNA 的表達，從而導致牙根發(fā)育異常；Date Y 等[18]發(fā)現(xiàn)Chd3 基因在分泌型成釉細胞和HERS 細胞中高表達，但在發(fā)育中的成牙本質(zhì)細胞和星網(wǎng)狀層細胞中低表達，Chd3 在HERS 細胞的DNA 合成及促進牙根發(fā)育中有重要作用[19]。

2.2 通過HERS 作用于牙根發(fā)育的其他影響因素研究

除了器官組織細胞本身表達的關(guān)鍵信號分子對牙根發(fā)育發(fā)揮著主要的調(diào)控作用外，一些內(nèi)源性的其他生物活性分子或外源性的因素如藥物、射線、創(chuàng)傷等，也會通過HERS 對牙根發(fā)育造成一定影響。

Xu J 等[20]發(fā)現(xiàn)血管活性腸肽（VIP）增強了HERS 的增殖以及向根方的延長，在體外培養(yǎng)中，VIP 促進了HERS01a 細胞系的增殖以及CK14 和vimentin 的表達。Ida-Yonemochi H 等[21]發(fā)現(xiàn)基底膜聚糖perlecan 的過量表達會造成牙齒形態(tài)的異常，如perlecan 在HERS 細胞中堆積導致牙根向外彎曲。Sakuraba H 等[22]發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）可能通過增強HERS 增殖和向根方延長來促進牙根發(fā)育。

Fujiwara N 等[23]發(fā)現(xiàn)Harmine（駱駝蓬堿）能夠促進HERS 延長并刺激HERS 細胞增殖，并且能夠誘導HERS 細胞中SMAD1/5/8 蛋白磷酸化；星網(wǎng)狀層的消失可能是控制HERS 形成時機的關(guān)鍵事件，表皮生長因子可能是頸環(huán)上皮轉(zhuǎn)變?yōu)镠ERS 的調(diào)控因素之一[24]；胰島素樣生長因子1（IGF-1）通過調(diào)節(jié)HERS 外層細胞的有絲分裂活性來參與牙根的早期發(fā)育過程[25]。Kawakami T等[26]發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺在牙根發(fā)育過程中會造成HERS 的缺損，導致HERS 早失，進一步抑制正常的牙根發(fā)育，引起不可逆的牙根發(fā)育過短。Hirose N 等[27]發(fā)現(xiàn)成釉蛋白可能對HERS 細胞有調(diào)控其分化的作用，并通過在HERS 中的表達啟動正常的牙根發(fā)育過程。

Ide Y 等[28]發(fā)現(xiàn)輻射導致的HERS 早失以及HERS 周圍間充質(zhì)細胞的增殖抑制會進一步引起牙根的發(fā)育畸形。Nakasone N 等[29]發(fā)現(xiàn)在牙根發(fā)育過程中，咬合能夠降低細胞增殖，是牙根延長調(diào)控因素之一。Hodgson B D 等[30]發(fā)現(xiàn)，光生物調(diào)節(jié)能夠改善在牙根發(fā)育過程中因長春堿造成的HERS 細胞增殖減弱及谷胱甘肽水平降低。

Jiang X 等[31]和Jung I Y 等[32]發(fā)現(xiàn)嚴重的創(chuàng)傷和大面積、長時間的根尖炎癥可能導致HERS和牙乳頭脫離牙根，形成一個單獨發(fā)育的、與原牙根主體不相連的根尖段。Andreasen J O 等[33]將HERS 整體切除或挫傷，牙根表現(xiàn)為發(fā)育停滯，且牙槽骨向牙根內(nèi)長入，將部分HERS 切除，依然有牙根形成，但體積較小，不切除HERS，牙根能夠獲得完整的發(fā)育；發(fā)現(xiàn)無論是部分還是完全的HERS 損傷都可能影響牙根發(fā)育[34]。

3 HERS 及其衍生物的生物學行為，以及應用于組織修復再生的研究

3.1 HERS 細胞/馬拉瑟上皮剩余細胞的研究

在牙根發(fā)育期間，通過上皮-間充質(zhì)相互作用，HERS 細胞可以誘導牙囊細胞向成纖維細胞、成牙骨質(zhì)細胞及成骨細胞分化，形成牙周膜、牙骨質(zhì)及牙槽骨；也可以誘導牙乳頭細胞向成牙本質(zhì)細胞分化，形成牙本質(zhì)。除上皮-間充質(zhì)相互作用以外，HERS 細胞還能夠進行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，自身進行成牙骨質(zhì)/成骨向分化，形成牙周支持組織。而牙根發(fā)育完成后，HERS 細胞進入牙周膜中形成馬拉瑟上皮剩余細胞，維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，參與牙周組織受損修復的過程。

He M 等[35]發(fā)現(xiàn)HERS 細胞來源的條件培養(yǎng)基促進了大鼠切牙DFCs 的成骨分化以及礦化能力，相反地，卻對大鼠磨牙DFCs 產(chǎn)生了抑制效應。Yang Y 等[36]發(fā)現(xiàn)在牙根發(fā)育過程中，HERS細胞能夠通過Wnt 通路和牙本質(zhì)的參與，誘導DFCs 進行成牙向分化。Guo Y 等[37]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)時，HERS 細胞在DFCs 誘導下細胞形態(tài)發(fā)生變化并且產(chǎn)生了更多的礦化結(jié)節(jié)；在體內(nèi)移植實驗中，HERS 細胞形成了牙骨質(zhì)-牙周韌帶樣結(jié)構(gòu)[38]；提出：HERS 細胞直接參與了牙周膜的形成過程，并且對于DFCs 的分化并形成牙周組織結(jié)構(gòu)有重要作用。Jung H S 等[39]發(fā)現(xiàn)將HERS、DFCs 和DPCs 在體內(nèi)共培養(yǎng)，能夠誘導DFCs 的成牙骨質(zhì)/成骨向分化，從而促進牙周組織修復再生。Bai Y 等[40]發(fā)現(xiàn)HERS 細胞通過EMI 誘導DFCs 膜片，能夠促進DFCs 的成骨/成牙骨質(zhì)向分化，并在體內(nèi)形成牙骨質(zhì)樣組織，促進牙周組織修復。

Duan Y 等[41]發(fā)現(xiàn)相較于二維培養(yǎng)的HERS細胞，三維培養(yǎng)的HERS 細胞小球在增殖、自我更新、干性維持、分化潛能以及牙本質(zhì)形成的誘導能力方面都有所增強；并且HERS 細胞小球的形成與擴展在一定程度上依賴于HIF-1 通路；在體內(nèi)實驗（大鼠腎被膜下植入）中，HERS 細胞小球與HA/TCP 共培養(yǎng)，有類牙骨質(zhì)形成；HERS細胞小球與DPCs、TDM 共培養(yǎng)，有相對有序且明顯礦化的新生類牙本質(zhì)組織出現(xiàn)。Thomas H F等[42]將HERS 從5 日齡的CD-1 小鼠第一磨牙中分離出來進行HERS 細胞的培養(yǎng)，免疫熒光鑒定獲得了純化的上皮細胞；還將HERS 與牙乳頭進行重組，發(fā)現(xiàn)HERS 對DPCs 有成牙本質(zhì)細胞向分化的誘導作用，并且在移植2 周后觀察到了根部牙本質(zhì)樣組織的出現(xiàn)。Suzuki M 等[5]發(fā)現(xiàn)HERS 的斷裂是源于DFCs 的侵襲，而不是源于細胞的死亡；在與HERS 的基底膜發(fā)生接觸后，DPCs 向成牙本質(zhì)細胞分化；在與HERS 細胞發(fā)生直接接觸后，DFCs 向成牙骨質(zhì)細胞分化。

Oh J E 等[43]發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠誘導DFHERSCs 牙囊組織來源的HERS 細胞（DF-HERSCs）進行EMT，向成骨向分化。Chen J 等[44]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 和FGF2 能通過 MAPK/ERK-dependent信號通路誘導HERS 發(fā)生EMT。

Li Y 等[45]發(fā)現(xiàn)上皮剩余（ERM）能夠促進牙周炎患者來源（P）和老年人來源（A）的PDLSCs 的成骨相關(guān)基因和蛋白表達。Bosshardt D D 等[46]對牙周再生過程中的細胞間的相互作用進行綜合歸納，提出：馬拉瑟上皮剩余中的上皮細胞被認為是一個能夠提供成牙骨質(zhì)細胞補給的細胞龕；在此過程中，釉質(zhì)基質(zhì)蛋白以及TGF-β 家族的成員與成牙骨質(zhì)細胞分化有關(guān)。Huang X 等[47]對HERS細胞在牙根發(fā)育中的命運及轉(zhuǎn)歸作歸納總結(jié)，提出：HERS 細胞在牙根形成的全過程中都能在牙根表面被檢測到，并不會消失；大部分HERS 細胞粘附于牙骨質(zhì)表面，余下部分分散開來形成馬拉瑟上皮剩余；在DFCs 穿過HERS 網(wǎng)絡接觸到牙本質(zhì)之前，HERS 細胞會在牙本質(zhì)表面分泌細胞外基質(zhì)成分；HERS 細胞參與牙骨質(zhì)的形成，也有可能分化成為成牙骨質(zhì)細胞；在牙根發(fā)育過程中，HERS 并非被“打散”，相反，HERS 細胞之間繼續(xù)以網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的形式進行相互交流作用；HERS 細胞與神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)進行相互作用，引導牙根發(fā)育。Xiong J 等[48]對馬拉瑟上皮剩余細胞在牙周組織中的作用進行歸納總結(jié)，提出：雖然目前對于馬拉瑟上皮剩余細胞的功能尚無共識，但其在維持牙周組織穩(wěn)態(tài)、防止牙固連及牙根吸收以及促進牙骨質(zhì)修復等方面發(fā)揮作用，可能成為誘導牙周組織再生的重要干細胞來源。

3.2 HERS 細胞系/馬拉瑟上皮剩余細胞系的研究

HERS 細胞和馬拉瑟上皮剩余細胞的原代培養(yǎng)較為困難，細胞量的獲取不足在一定程度上限制了實驗研究。因此，通過建立永生化的細胞系，保證充足的細胞來源，促進了對HERS 細胞和馬拉瑟上皮剩余細胞生物學特性的研究。

Kim G H 等[49]構(gòu)建了永生化的人誘導性多能干細胞來源的上皮樣細胞系（EPI-hiPSCs），并發(fā)現(xiàn)EPI-hiPSCs 能夠促進DPCs 成牙相關(guān)基因表達、牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）表達以及更多的礦化結(jié)節(jié)形成。Li X 等[50]和Zhang S 等[51]建立了SD 大鼠HERS 細胞來源的細胞系HERS-H1 和HERS-C2；HERS-H1 細胞系在體外增強DPCs 的成牙向分化及礦化能力；HERS-C2 細胞系能夠在體外通過EMT 分化為成牙骨質(zhì)細胞并在體內(nèi)形成牙骨質(zhì)樣組織。Tsunematsu T 等[52]從牙周膜中分離出了馬拉瑟上皮剩余來源的自發(fā)性永生化的牙源性上皮（iOdE）細胞，發(fā)現(xiàn)它們具有形成小球并表達干細胞相關(guān)基因的能力；并且iOdE 細胞能夠經(jīng)成骨誘導培養(yǎng)基作用后進行成骨向分化，將其移植于免疫缺陷小鼠體內(nèi)培養(yǎng)后形成了鈣化結(jié)節(jié)。Nam H 等[53]發(fā)現(xiàn)HERS/ERM 細胞有上皮干細胞和胚胎干細胞標志物的表達；在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了HERS/ERM 來源的永生化細胞系[54]，發(fā)現(xiàn)細胞系能夠保持上皮干細胞和胚胎干細胞標志物的表達，并且在TGF-β1 誘導下，能通過EMT 獲得間充質(zhì)表型。Akimoto T 等[55]構(gòu)建了HERS 細胞來源的細胞系HERS01a，發(fā)現(xiàn)細胞系表達間充質(zhì)細胞標記物vimentin、N-cadherin 和上皮細胞標記物CK14、E-cadherin 以及p63；經(jīng)TGF-β 誘導后，HERS01a 細胞的間充質(zhì)標志物表達增多，EMT 標志物snail1 和snail 2 也增多。

3.3 HERS 細胞系來源的外泌體的研究

外泌體具有低免疫原性、高穩(wěn)定性的特點，在向組織修復的臨床轉(zhuǎn)化研究中，擁有廣闊應用前景。Zhang S 等[56]發(fā)現(xiàn)HERS-H1 細胞系來源的外泌體樣囊泡（ELVs-H1）能夠促進DPCs 的增殖、遷移以及成牙向分化，同時促進血管形成以及成神經(jīng)向分化，并且還能激活Wnt/β-catenin通路；利用 ELVs-H1 與DPCs 在牙根薄片上進行體內(nèi)共培養(yǎng)，能夠促進包括修復性牙本質(zhì)樣硬組織及血管、神經(jīng)軟組織在內(nèi)的牙髓-牙本質(zhì)復合體樣組織的再生。

3.4 關(guān)于HERS 細胞能否成為牙骨質(zhì)細胞分化來源的研究爭議

關(guān)于HERS 細胞是否能夠經(jīng)歷EMT，進而分化為成牙骨質(zhì)細胞，一直存在爭議。Diekwisch T G 等[57]在研究中證實了牙骨質(zhì)是由HERS 斷裂后侵入其中的DFCs 所生產(chǎn)的這一經(jīng)典理論；Yamamoto T 等[58-60]更是十分堅持在牙骨質(zhì)形成過程中，HERS 細胞不會經(jīng)歷EMT，且DFCs 才是成牙骨質(zhì)細胞的分化來源。與前述觀點恰恰相反的是，Bosshardt D D 等的研究發(fā)現(xiàn)支持了HERS 細胞生產(chǎn)牙骨質(zhì)基質(zhì)蛋白[61-63]并成為成牙骨質(zhì)細胞來源[64]的可能性；Hammarstrom L等[65]和Alatli I 等[66]稱有證據(jù)證明HERS 細胞無細胞性牙骨質(zhì)和細胞性牙骨質(zhì)中都有涉及；Zeichner-David 等[67]的研究提出了無細胞性牙骨質(zhì)和細胞性牙骨質(zhì)都可以被HERS 來源的成牙骨質(zhì)細胞合成；Sonoyama W 等[68]發(fā)現(xiàn)HERS 細胞在移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)培養(yǎng)時，能夠形成牙骨質(zhì)樣組織；Itaya S 等[69]發(fā)現(xiàn)TGF-β 能夠誘導HERS 進行EMT 并分化為牙周膜成纖維細胞，并表達無細胞牙骨質(zhì)和牙周膜形成相關(guān)蛋白如fibronectin 和periostin。

4 小結(jié)

一方面，HERS 細胞可通過EMT 進行自身的成骨/成牙骨質(zhì)向分化。另一方面，通過EMI，HERS 細胞誘導DPCs 的成牙/成骨向分化，參與根部牙本質(zhì)的形成；HERS 細胞誘導DFCs 的成骨/成牙骨質(zhì)向分化，參與牙周組織形成。

為了更好地補充HERS 細胞參與牙根發(fā)育及牙周組織形成的基礎(chǔ)知識，為牙周再生及生物牙根構(gòu)建提供理論參考及實踐指導，以下科學問題尚需要進一步實驗探究來明確：EMI 和EMT 在分子層面的調(diào)控機制為何；EMI 與EMT 在組織發(fā)生過程中所占比例如何；在組織修復過程中EMI 與EMT，哪一種修復策略的效率更高；HERS 細胞應用于牙周再生時的血管、神經(jīng)形成及功能評價；HERS 細胞生理性的EMT 與腫瘤細胞病理性的EMT 區(qū)別為何；恒牙與乳牙的HERS 區(qū)別為何；HERS 細胞抵御局部感染能力如何；HERS 細胞在炎癥環(huán)境下發(fā)揮的免疫功能為何；HERS 細胞最高效的保存策略為何；HERS 細胞應用于牙周修復最簡便、利用率最高的的操作方式為何等。