舒俊杰 ，陳紅羽 ，劉 凱 ，雷普平

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，云南 昆明 650500;2）信陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，河南 信陽 464000;3）河南圣德司法鑒定中心，河南 信陽 464000;4）昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

由基因突變引起的心臟離子通道疾?。–ardiac channelopathy）被認(rèn)為是引起不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD）的首要原因之一，以QT間期延長(zhǎng)為主要特征的長(zhǎng)QT 綜合征（long QT syndrome，LQTS）是常見的易引起心率失常和心源性猝死的心臟離子通道疾病之一[1]。得益于基因分型技術(shù)的發(fā)展，研究人員[2]在LQTS 患者以及各型SUD 猝死者DNA 中發(fā)現(xiàn)了大量心肌細(xì)胞Na+、K+、Ca2+離子通道編碼基因的突變，而明確此類突變的致病性變得尤為重要。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)（Patch clamp techniques）作為先進(jìn)的細(xì)胞電生理技術(shù)，在研究離子通道疾病中的應(yīng)用日益廣泛，尤其是對(duì)于LQTS 相關(guān)基因突變致病性的評(píng)估、SUD 的預(yù)防和死亡原因鑒定等方面具有重要意義。本文對(duì)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在LQTS 和SUD 中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 長(zhǎng)QT 綜合征的研究現(xiàn)狀

長(zhǎng)QT 綜合征是一組以體表心電圖QT 間期延長(zhǎng)為主要特征、易引發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速等心律失常、嚴(yán)重者可導(dǎo)致猝死的心臟離子通道疾病。研究表明[2]，遺傳性LQTS 是由KCNQ1、KCNH2、SCN5A等編碼心臟Na+、K+、Ca2+等離子通道和（或）相關(guān)蛋白基因的突變引起。臨床醫(yī)生在排除外源性因素作用后，根據(jù)個(gè)體體表心電圖QT 間期時(shí)長(zhǎng)（QTc≥480 ms 或在不明原因暈厥時(shí)QTc≥460 ms）并綜合評(píng)估患者家族史以及多重心電圖檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行LQTS 的診斷[3-4]。據(jù)報(bào)道，LQTS 的發(fā)病率約為1∶7 000～1∶2 000，而作為最常見的離子通道疾病之一，LQTS 約占所有SUD 病例的20%～25%，同時(shí)LQTS 也是引起兒童和青少年SUD 的主要原因之一[5]。

目前的研究結(jié)果已經(jīng)明確了17 種遺傳性LQTS 亞型的致病基因，各致病基因?qū)?yīng)的LQTS亞型、影響（離子）電流和主要致病機(jī)制，見表1。其中KCNQ1基因和KNCH2基因均編碼電壓門控K+通道蛋白的α 亞基，二者對(duì)應(yīng)的離子通道分別介導(dǎo)心臟復(fù)極化過程中延遲整流鉀電流中的慢速電流（IKS）和快速電流（IKr），KCNQ1和KNCH2基因的功能缺失型突變分別通過減少IKS、IKr，延長(zhǎng)心臟復(fù)極過程導(dǎo)致LQTS1 和LQTS2；SCN5A基因編碼電壓門控Na+通道蛋白的α 亞基，該離子通道介導(dǎo)心肌細(xì)胞復(fù)極過程中的晚期內(nèi)向Nav1.5 電流，SCN5A基因的功能獲得型突變通過增加Nav1.5 電流時(shí)程，延長(zhǎng)心臟復(fù)極過程導(dǎo)致LQTS3。據(jù)統(tǒng)計(jì)，LQTS1、LQTS2 和LQTS3 作為最常見的3 種LQTS 亞型，占所有基因型陽性患者的比例分別為35%、30%和10%[6]，見表1。

表1 長(zhǎng)QT 綜合征各亞型相關(guān)的致病基因和致病機(jī)制Tab.1 Pathogenic genes and mechanism of different LQTS subtypes

2 長(zhǎng)QT 綜合征與不明原因猝死

SUD 是指經(jīng)法醫(yī)學(xué)尸體解剖、組織病理學(xué)檢驗(yàn)及其他科學(xué)手段全面檢驗(yàn)后仍無法明確死因的猝死，現(xiàn)場(chǎng)勘查或案情調(diào)查也未發(fā)現(xiàn)與死亡有關(guān)的證據(jù)，這使得SUD 成為法醫(yī)病理學(xué)的工作難點(diǎn)和研究熱點(diǎn)之一。

新近研究顯示基因突變導(dǎo)致的離子通道疾病已經(jīng)成為SUD 的罪魁禍?zhǔn)祝瑢W(xué)者Ackerman[7]在1999 年首次通過基因測(cè)序技術(shù)對(duì)一名在游泳時(shí)發(fā)生SUD 的19 歲健康女性進(jìn)行了4 個(gè)LQTS 致病基因（KCNQ1、HERG、KCNE1、SCN5A）的分子遺傳學(xué)篩查，發(fā)現(xiàn)該女性KCNQ1基因第1 外顯子區(qū)存在373-381（GCCGCGCCC）的堿基缺失，明確其生前患有致死性的長(zhǎng)QT 綜合征。

此后，基于基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，法醫(yī)工作者對(duì)大量SUD 案例中猝死者的石蠟包埋組織、凍存組織和LQTS 確診患者的血液樣本進(jìn)行的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大量LQTS 致病基因突變（包含錯(cuò)義突變、移碼突變和插入/缺失突變等）可能是導(dǎo)致各型SUD 的遺傳危險(xiǎn)因子。例如，2013 年Liu Chao 等[8]對(duì)120 名散發(fā)性不明原因夜間猝死綜合征（SUNDS）猝死者血液DNA 的KCNQ1、KCNH2、KCNE1、KCNE2外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)進(jìn)行了死后遺傳分析顯示，14 個(gè)罕見基因突變（MAF ＜ 0.01，包含KCNE1基因1 個(gè)、KCNE22 個(gè)、KCNH25 個(gè)、KCNQ16 個(gè)）和14 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（MAF ＞ 0.01，包含KCNE12 個(gè)、KCNH25 個(gè)、KCNQ17 個(gè)）與中國南部SUNDS 的發(fā)生有關(guān)。另外，2018 年Jia Penglin 等[9]對(duì)83例散發(fā)性和3 例家庭聚集性云南不明原因猝死（YNSUD）死者的石蠟包埋心肌組織DNA 進(jìn)行4 個(gè)已知LQTS 致病基因突變熱點(diǎn)區(qū)（KCNQ1第3 外顯子、KCNH2第6、7 外顯子和SCN5A第28 外顯子）基因測(cè)序后，結(jié)合生物信息學(xué)軟件PolyPhen-2 進(jìn)行蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，KCNQ1基因R192L突變致病和KCNH2基因Y597N 致病突變（PolyPhen-2 預(yù)測(cè)分值 ＞ 0.98）可能與YNSUD 的發(fā)生有關(guān)。

值得注意的是，既往對(duì)SUD 死者和LQTS 確診患者進(jìn)行的基因篩查中發(fā)現(xiàn)了大量的相關(guān)“致病基因突變”，學(xué)者們通常依據(jù)基于不同原理的生物信息學(xué)軟件對(duì)所檢測(cè)到的基因突變（堿基/氨基酸替換）進(jìn)行致病性評(píng)估。目前常用的預(yù)測(cè)軟件有SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster、PROVEAN、Mutation Assessor 等，這些軟件主要對(duì)基因突變位點(diǎn)的氨基酸特性或突變位點(diǎn)及鄰近區(qū)域的序列保守性等特征進(jìn)行分析，給出不同預(yù)測(cè)結(jié)果（良性、有害或致病等），例如SIFT 通過進(jìn)化保守性和位置特異性評(píng)分矩陣進(jìn)行預(yù)測(cè)；PolyPhen-2 基于進(jìn)化保守性與蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)并利用貝葉斯分類器計(jì)算后驗(yàn)概率來預(yù)測(cè)突變的致病性；PROVEAN是依據(jù)進(jìn)化保守性、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型、BLOSUM62氨基酸替換打分矩陣預(yù)測(cè)[10-11]，由于不同軟件遵循不同原理，所以不同軟件對(duì)同一突變致病性的預(yù)測(cè)結(jié)果可能有所不同，甚至相差很大，這就導(dǎo)致在缺乏功能驗(yàn)證的情況下只依據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果判定基因突變的致病性，可能無法在攜帶基因突變的猝死者親屬和LQTS 患者中準(zhǔn)確篩查出猝死高危人群，故有必要結(jié)合生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)LQTS 相關(guān)基因突變進(jìn)行功能驗(yàn)證試驗(yàn)。

3 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在LQTS 基因突變致病性驗(yàn)證中的應(yīng)用

20 世紀(jì)70 年代，德國學(xué)者Neher 和Sakmann[12]為了記錄乙酰膽堿刺激青蛙肌細(xì)胞膜產(chǎn)生的離子電流而創(chuàng)建了膜片鉗技術(shù)（Patch-clamp techniques），它是通過阻抗微電極與細(xì)胞膜之間形成緊密接觸、采用電壓鉗或電流鉗記錄生物膜上一種或多種離子通道的電活動(dòng)，來研究其門控特性、藥理學(xué)特性、生理功能以及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等問題的微電極技術(shù)。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)作為膜片鉗的記錄模式之一，可以獲得細(xì)胞膜上部分或所有離子通道的綜合特性，揭示細(xì)胞的電生理狀態(tài)，目前已被學(xué)者廣泛應(yīng)用LQTS 致病基因突變?cè)诩?xì)胞水平的功能驗(yàn)證[13-15]。

目前驗(yàn)證LQTS 致病基因突變功能的方法需聯(lián)合應(yīng)用基因克隆、基因編輯等分子生物學(xué)技術(shù)。對(duì)于心臟離子通道疾病而言，可構(gòu)建穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)人源LQTS 致病基因突變的細(xì)胞系，或者構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離心肌細(xì)胞/起搏細(xì)胞，再利用全細(xì)胞膜片鉗來檢測(cè)突變基因編碼Na+、K+、Ca2+離子通道的功能變化。在全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)操作中，使用微電極接觸浸潤于細(xì)胞外液中的細(xì)胞，給予負(fù)壓吸破細(xì)胞膜形成緊密密封，使細(xì)胞內(nèi)液與電極內(nèi)液接通，此方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定且對(duì)細(xì)胞損傷小，已經(jīng)成為離子通道疾病研究中最重要的技術(shù)[15]。

Zhou Xin 等[16]報(bào)道了1 例21 歲女性在睡眠中發(fā)生SUD 的事件，通過基因篩查發(fā)現(xiàn)其祖母、母親、女兒均攜帶LQTS 致病基因KCNQ1c.686G＞A（p.G229D）突變，遺傳分析推測(cè)本案中猝死女性也是該突變攜帶者，通過定點(diǎn)誘導(dǎo)pEGFP-KCNQ1-N1 質(zhì)粒產(chǎn)生G229D 突變并轉(zhuǎn)染倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO-K1），經(jīng)全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G229D 突變通過產(chǎn)生復(fù)極后未失活的尾電流導(dǎo)致QT 間期延長(zhǎng)和傳導(dǎo)延遲，表明G229D 突變可引起攜帶者心電傳導(dǎo)異常和竇房結(jié)功能障礙。Furushima 等[17]報(bào)道了1 例母親產(chǎn)后1 個(gè)月出現(xiàn)QT 間期延長(zhǎng)（QTc ＞ 490 ms），其胎兒在妊娠期間出現(xiàn)2∶1 房室傳導(dǎo)阻滯，并于產(chǎn)后1 周QT 間期顯著延長(zhǎng)（QTc ＞ 521 ms），對(duì)母嬰進(jìn)行KCNQ1基因全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)2 人均攜帶KCNQ1-T587M 突變。WuJie 等[17]通過p-GFP 質(zhì)粒將KCNQ1-T587M 突變轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)hERG 蛋白（KCNH2基因編碼的K+通道蛋白）的人胚腎細(xì)胞中，全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)結(jié)合熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)發(fā)現(xiàn)該突變通過降低IKr電流同時(shí)干擾hERG 蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制導(dǎo)致長(zhǎng)QT 綜合征的嚴(yán)重表型。

馮莉等[18]對(duì)1 例LQTS 伴暈厥患者（靜息心電圖QTc：488 ms，動(dòng)態(tài)心電圖QTc：610 ms）進(jìn)行了22 個(gè)心臟疾病相關(guān)基因外顯子及鄰近內(nèi)含子區(qū)的遺傳學(xué)篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其攜帶KCNH2-F129I突變，應(yīng)用定點(diǎn)誘導(dǎo)pcDNA3.1-KCNH2質(zhì)粒突變、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞后，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)并結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡法進(jìn)行功能和表達(dá)研究，結(jié)果顯示KCNH2-F129I 突變通過干擾hERG 蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)引起通道蛋白減少而導(dǎo)致IKr電流顯著減弱，幾乎無法單獨(dú)形成功能性IKr通道。

SCN5A致病基因突變的功能研究報(bào)道較KCNQ1、KCNH2基因更多，這可能因?yàn)镾CN5A基因同樣作為Brugada 綜合征、病態(tài)竇房結(jié)綜合征等致猝死性心率失常等疾病的致病基因有關(guān)。Daniel 等[19]構(gòu)建了攜帶人源SCN5A基因野生型和R222Q 突變型的小鼠，通過膠原酶/蛋白酶法從10～14 周小鼠心臟分離獲取心肌細(xì)胞和浦肯野細(xì)胞，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞的鈉電流（INa），結(jié)果顯示R222Q 型小鼠心肌細(xì)胞和浦肯野細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程出現(xiàn)不同程度縮短，其中心肌細(xì)胞INa的電導(dǎo)（表示導(dǎo)電能力）明顯增大，激活、失活電流以及通道由激活變?yōu)槭Щ畹摹按半娢弧本蜇?fù)極移動(dòng)；而浦肯野細(xì)胞的早期后除級(jí)（Early afterdepolarizations）膜電位向負(fù)電壓方向移動(dòng)-60 mV，上述改變均與LQTS 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)并可能導(dǎo)致個(gè)體發(fā)生心律失常甚至猝死。

隨著人類對(duì)離子通道疾病研究的不斷深入，膜片鉗技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞水平電生理的常用技術(shù)。而全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在LQTS 患者的遺傳學(xué)診斷和治療等方面具有指導(dǎo)價(jià)值。對(duì)于法醫(yī)學(xué)病理學(xué)領(lǐng)域，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)于評(píng)估LQTS致病基因突變的危害性、篩查L(zhǎng)QTS 引發(fā)SUD 高風(fēng)險(xiǎn)人群以及明確SUD 案例死亡原因等問題均具有重要意義。