SMAD4 基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs12958604 和rs10502913 與宮頸癌相關(guān)性研究

滕元姬 凌永嫦 王永亮 李美琴 王春芳 王俊利 楊鳳蓮

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第四大常見癌癥，每年有50 多萬例女性確診[1]。在中國，宮頸癌是僅次于乳腺癌的女性生殖系統(tǒng)第二大癌癥，其發(fā)病原因雖證實(shí)與HPV 感染有關(guān)，但確切的機(jī)制仍不十分清楚[2-3]。SMAD4（mothers against decapentaplegic homolog 4）又名DPC4，是位于人類染色體18q21.1 的腫瘤抑制基因，由12 個(gè)外顯子組成，編碼552 個(gè)氨基酸序列，是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）通路關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其缺失被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β 產(chǎn)生抵抗的開始[4]。研究表明，SMAD4 基因突變與宮頸癌發(fā)生發(fā)展和不良預(yù)后相關(guān)，SMAD4 基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與胸主動(dòng)脈瘤或主動(dòng)脈夾層、潰瘍性結(jié)腸炎、直腸癌、胰腺導(dǎo)管癌等多種腫瘤易感性密切相關(guān)[5-6]。本研究旨在通過采用病例對(duì)照研究的方法，探討SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs12958604 和rs10502-913 與宮頸癌易感性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018 年2 月至2019 年12 月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的宮頸癌患者和同時(shí)期健康體檢者血液樣本各342 例，分為宮頸癌組和對(duì)照組，及包括年齡、民族、腫瘤類型、組織病理分級(jí)、腫瘤TNM 分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌組：1）經(jīng)臨床和病理組織診斷為宮頸癌；2）年齡≥18 歲。對(duì)照組：1）健康體檢女性，年齡≥18 歲；2）納入個(gè)體間無血緣關(guān)系；3）血液常規(guī)檢查結(jié)果正常及HPV 檢測結(jié)果陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌組與對(duì)照組：1）既往腫瘤史或合并其他腫瘤；2）合并其他系統(tǒng)性血液或自身免疫類疾??；3）有精神病史、有慢性病史、有腫瘤家族史。本研究獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計(jì) 采用病例對(duì)照研究方法，對(duì)宮頸癌組和對(duì)照組SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs12958604 和rs10502913 頻率差異進(jìn)行比較，同時(shí)評(píng)估其他風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)病因的影響。

1.2.2 DNA 提取及 SNP 檢測 收集血液樣本2 mL/例，嚴(yán)格按照DNA 提取試劑盒（深圳亞能生物科技有限公司）說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，提取血液樣本中的DNA，-20°條件保存。采用imLDRTM多重SNP 分型試劑盒（上海天昊生物科技有限公司），使用多重PCR 反應(yīng)對(duì)目標(biāo)SNP 位點(diǎn)所在區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增。rs12958604 擴(kuò)增引物上游為5'-CTAAGCCTTGATGAGTTGCT-3'，下游為5'-CTGCAAATTATATTATAGAT-3'；rs10502913 擴(kuò)增引物上游為5'-TAGCCAATCCTGACTGATAC-3'，下游為5'-TTGTGCCAAGACCTAGGTTA-3'。采用ABI3730XL毛細(xì)管電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各位點(diǎn)基因型、等位基因（計(jì)算方法例數(shù)加倍）、基因模型采用二元Logistic 回歸分析，群體遺傳學(xué)Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)采用 χ2檢驗(yàn)，陽性位點(diǎn)與其他風(fēng)險(xiǎn)因素采用多元Logistic 回歸多因素分析，基因單倍型（計(jì)算方法例數(shù)加倍）采用在線SHEsis 軟件分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

宮頸癌組的中位年齡為51（23～79）歲，對(duì)照組的中位年齡為50（23～86）歲，兩組年齡進(jìn)行比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.060）。宮頸癌組中，鱗狀細(xì)胞癌最多見，占 78.1%（267/342），其次為腺上皮細(xì)胞癌，占15.2%（52/342）。在宮頸癌TNM 分期中（Ⅰ+Ⅱ期）占64.9%（222/342），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占24.0%（82/342），遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移占6.1%（21/342）。

2.2 基因型分析

SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs12958604 和rs105029 13 分型顯示，rs12958604 位點(diǎn)有AA、GA 和GG 基因型，rs10502913 位點(diǎn)有GG、GA 和AA 基因型（圖1）。

圖1 SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs12958604 和rs10502913 測序圖

2.3 基因型和等位基因與宮頸癌易感性分析

采用群體遺傳學(xué)Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)基因型頻數(shù)，宮頸癌組rs12958604（χ2=0.943，P=0.332）和rs10502913（χ2=3.473，P=0.062）位點(diǎn)基因型符合Hardy-Weinberg 平衡定律；對(duì)照組rs12958604（χ2=1.996，P=0.158）和rs10502913（χ2=0.221，P=0.639）位點(diǎn)基因型亦符合。本研究結(jié)果顯示，群體的遺傳性能保持相對(duì)穩(wěn)定，各等位基因的頻率在遺傳中基本保持基因平衡。rs12958604 位點(diǎn)GG 基因型、GG+GA 顯性模型在宮頸癌組和對(duì)照組進(jìn)行比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），G 等位基因在宮頸癌組中分布頻率低于對(duì)照組，兩組進(jìn)行比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。rs10502913 位點(diǎn)的基因型和等位基因在兩組中進(jìn)行比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1，2。

表1 rs12958604 和rs10502913 基因頻率在宮頸癌組與對(duì)照組的比較

表2 rs12958604 和rs10502913 等位基因頻率在宮頸癌組與對(duì)照組的比較

2.4 rs12958604 和其他風(fēng)險(xiǎn)因素與宮頸癌易感性的多元Logistic 回歸多因素分析

SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs12958604 和其他風(fēng)險(xiǎn)因素與宮頸癌易感性的多元Logistic 回歸多因素分析結(jié)果顯示，高血壓為宮頸癌易感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而年齡、民族、高血脂、糖尿病與宮頸癌易感性進(jìn)行比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表3）。

表3 rs12958604 和其他風(fēng)險(xiǎn)因素與宮頸癌易感性的多因素分析

2.5 SMAD4 基因SNP 位點(diǎn) rs12958604 和rs105029-13 單倍型分析

采用SHEsis 軟件進(jìn)行rs12958604 和rs105029-13 單倍型分析結(jié)果顯示，兩組基因有3 種單倍型，分別為A-G、G-A、G-G，其中以G-A 單倍型為主。在宮頸癌組和對(duì)照組中，G-A 單倍型分別占50.6%（346/684）和57.9%（396/684），G-A 和G-G 單倍型在兩組中進(jìn)行比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表4）。

表4 宮頸癌組和對(duì)照組中rs12958604 和rs10502913 單倍型比較

3 討論

SMAD4 是基因編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白SMADs 家族成員。SMAD4 連接激活域并整合WNT、FGF 和TGF-β 信號(hào)通路，經(jīng)過多種途徑被絲氨酸-蘇氨酸受體激酶磷酸化后參與調(diào)節(jié)TGF-β[4]。TGF-β 通路上游有信號(hào)傳遞時(shí)，下游區(qū)SMAD4 基因可通過增強(qiáng)TGF-β信號(hào)來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[7]。SMAD4 基因缺失在胰腺導(dǎo)管腺癌中最常見，但也在如胃癌、結(jié)腸癌、肺鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中表達(dá)[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 基因 SNP 位點(diǎn)rs129586-04 的GG 基因型和GG+GA 顯性模型及G 等位基因可能降低宮頸癌易感性；rs12958604 和rs10502913 單倍型分析顯示，攜帶G-G 單倍型為風(fēng)險(xiǎn)因素，可能增加宮頸癌易感性，而G-A 單倍型可能降低宮頸癌易感性。本研究的多因素分析結(jié)果顯示，高血壓為宮頸癌易感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。張璇等[10]對(duì)SMAD4 基因SNP 與鼻咽癌預(yù)后的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，rs12598604 位點(diǎn)GA/GG 型攜帶者3 年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增高，而本研究并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)GA/GG 型與臨床病理特征（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）具有相關(guān)性，可能與rs12598604在鼻咽和宮頸組織中表達(dá)水平不同有關(guān)。Alghamdi 等[11]研究顯示，SMAD4 基因在17.6%原發(fā)性宮頸腺癌中表達(dá)缺失，在95.8%黏液性上皮腫瘤（如宮頸、子宮內(nèi)膜、卵巢）中表達(dá)降低。Yuan 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β 信號(hào)通路的上游TGFBR2 調(diào)節(jié)因子通過Hedgehog 信號(hào)失活上調(diào)SMAD4 表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移。劉堯堯等[13]研究顯示，miR-210-3p 通過靶向調(diào)控SMAD4 基因，可提高其蛋白表達(dá)水平，從而負(fù)向調(diào)控宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖、侵襲能力。本研究顯示，SMAD4 基因 SNP 位點(diǎn)rs10502913 與宮頸癌易感性無相關(guān)性。Zhao 等[14]研究顯示，SMAD4基因SNP 位點(diǎn)rs10502913 與中國漢族人群的煤炭工人塵肺病易感性無相關(guān)性。Wosiak 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs10502913 與結(jié)直腸癌易感性無顯著相關(guān)性。因此，SMAD4 基因無論是在TGFβ 信號(hào)通路中的連接、傳遞作用，還是與上、下游基因的相互調(diào)控作用，或是自身高度基因SNP，對(duì)細(xì)胞生長、增殖、分化等均起著不同的重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示SMAD4 基因SNP 位點(diǎn)rs12958604 與宮頸癌易感性具有相關(guān)性。rs105029-13 與宮頸癌易感性不具有相關(guān)性，但該結(jié)果仍需更大樣本量和更深層次的研究來進(jìn)一步證實(shí)。本研究也存在如樣本例數(shù)較少，未探討區(qū)域環(huán)境因素與宮頸癌發(fā)生是否存在交互作用，缺乏對(duì)該基因在宮頸癌組織和癌旁組織樣本中探討等不足之處。擴(kuò)展SMAD4 基因SNP 領(lǐng)域的數(shù)據(jù)是本課題未來研究的目的和方向，對(duì)臨床早期診斷、個(gè)性化治療將具有參考意義。SMAD4 基因與腫瘤相關(guān)性研究雖取得了一定進(jìn)展，但仍處于起始階段，其在腫瘤的早期診斷、預(yù)后和治療中仍有較大研究價(jià)值。