孫佳明， 龐 焦， 高向紅， 李明玉， 王從綱， 李憲臻

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

蔗糖異構(gòu)酶主要來(lái)源于細(xì)菌，已報(bào)道的多種產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的細(xì)菌包括大黃歐文菌（Erwinia rhapontici）、沙雷氏桿菌（Serratia plymuthica）、克雷伯式桿菌 （Klebsiella sp.）和多源發(fā)散菌（Pantoea dispersa）等[9]。野生菌株普遍產(chǎn)酶水平低，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的要求，如Erwinia rhapontici NX-5發(fā)酵酶活力為1.3 U/mL[10]，優(yōu)化后的Klebsiella sp.LX3的發(fā)酵酶活力達(dá)到15.12 U/mL[11]。利用原核系統(tǒng)對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行異源表達(dá)是提高其產(chǎn)量的有效手段，具有生產(chǎn)成本低、工藝操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)效率高等多種優(yōu)勢(shì)。目前針對(duì)蔗糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)，采用大腸桿菌為表達(dá)宿主的研究工作最多，如源自沙雷氏桿菌 （Serratia plymuthica）、多源發(fā)散菌（Pantoea dispersa UQ68J） 和 克 雷 伯 式 桿 菌（Klebsiella sp.UQ14S）的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)表達(dá)[12-13]，然而，蔗糖異構(gòu)酶的可溶性表達(dá)水平很低，主要以包涵體形式表達(dá)，嚴(yán)重制約了蔗糖異構(gòu)酶的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用[14-15]。針對(duì)這一問(wèn)題，有研究者采用融合谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）標(biāo)簽或高密度發(fā)酵手段在一定程度上提高了蔗糖異構(gòu)酶的可溶性表達(dá)量，但改善程度仍然有限[16-18]。此外，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如調(diào)整誘導(dǎo)劑的加入量、改變誘導(dǎo)溫度在很多情況下對(duì)目的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的提高有限，而關(guān)于蛋白質(zhì)折疊的研究為提高重組蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)提供了新思路，研究表明不同分子伴侶可以在目的蛋白質(zhì)多肽鏈翻譯后的各個(gè)階段發(fā)揮作用，通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)目的蛋白質(zhì)正確折疊從而提高其可溶性表達(dá)水平，如通過(guò)共表達(dá)分子伴侶質(zhì)粒pGro7使核糖核酸外切酶R的可溶性表達(dá)量提高了54.50%[19]。通過(guò)比較4種分子伴侶質(zhì)粒pGKJE8、pGro7、pG-Tf2、pTf16對(duì)牛支原體膜蛋白M1的截?cái)嗥卧诖竽c桿菌中表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8和pG-Tf2能顯著提高M(jìn)1截短片段的可溶性表達(dá)[20]。目前，關(guān)于蔗糖異構(gòu)酶異源高效可溶性表達(dá)的研究工作較少，尤其是缺少利用分子伴侶共表達(dá)策略調(diào)控其可溶性表達(dá)的研究工作。

在作者前期工作中，已分離到了Klebsiella sp.LX3菌株，該菌株生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶具有很高的蔗糖轉(zhuǎn)化率（99.5%），其轉(zhuǎn)化蔗糖的主產(chǎn)物為異麥芽酮糖，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[11，16]。盡管前期工作中對(duì)該菌株表達(dá)的蔗糖異構(gòu)酶通過(guò)融合GST標(biāo)簽在一定程度上改善了SIase的可溶性表達(dá)量，但改善程度有限，并且后續(xù)純化需要蛋白酶切除標(biāo)簽和凝膠過(guò)濾層析得到純酶[16]。同時(shí)，其他文獻(xiàn)中也報(bào)道了多種不同來(lái)源的蔗糖異構(gòu)酶可溶性表達(dá)水平較低，主要以包涵體形式表達(dá)[14-15]。因此，為了提高蔗糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)水平，作者以源自Klebsiella sp.LX3的SIase為研究對(duì)象，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-24b-SIase，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步將4種分子伴侶質(zhì)粒（pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16）分別與基因SIase在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中共表達(dá)，通過(guò)輔助蛋白質(zhì)正確折疊減少包涵體產(chǎn)生并促進(jìn)SIase可溶性表達(dá)。進(jìn)一步將篩選所得含有最佳分子伴侶的工程菌進(jìn)行培養(yǎng)，利用金屬離子螯合層析技術(shù)純化可溶性SIase，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征和產(chǎn)物特異性分析，從而為規(guī)?；苽銼Iase的應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供參考，為SIase在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株E.coli BL21（DE3）、E.coli DH10B、質(zhì)粒pET-28a-SIase：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；卡那霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖、四環(huán)素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Ni-NTA 6FF瓊脂糖純化樹(shù)脂、咪唑、BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；分子伴侶質(zhì)粒（pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16）、DNA和蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；異麥芽酮糖：Sigma公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

LB液體培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl，pH 7.2；LB固體培養(yǎng)基為在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂；LLB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl，pH 7.2。Buffer A緩 沖 液：0.5 mol/L氯 化 鈉、50 mmol/L磷 酸 二 氫鈉-氫氧化鈉，pH 8.0；Buffer B緩沖液：0.5 mol/L氯化鈉、50 mmol/L磷酸二氫鈉-氫氧化鈉、0.03 mol/L咪唑，pH 8.0；Buffer C緩沖液：0.5 mol/L氯化鈉、50 mmol/L磷酸二氫鈉-氫氧化鈉、0.05 mol/L咪唑，pH 8.0；Buffer D緩 沖 液：0.5 mol/L氯 化 鈉、50 mmol/L磷酸二氫鈉-氫氧化鈉、0.10 mol/L咪唑，pH 8.0；Buffer E緩沖液：0.5 mol/L氯化鈉、50 mmol/L磷酸二氫鈉-氫氧化鈉、0.20 mol/L咪唑，pH 8.0。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水過(guò)濾系統(tǒng)：美國(guó)密理博Millipore公司產(chǎn)品；HITACHI-CR21GⅢ超速冷凍離心機(jī)：日立（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；通用型垂直電泳儀：上海生工生物科技有限公司產(chǎn)品；Infinite F50酶標(biāo)儀：瑞士帝肯Tecan公司產(chǎn)品；PCR儀、電轉(zhuǎn)儀：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；NanoVue Plus超微量紫外分光光度計(jì)、ImageQuant LAS4000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)通用電氣（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜分析儀 （Agilent Technologies 1260 Infinity）：美國(guó)安捷倫科技公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 SIase表達(dá)工程菌的構(gòu)建為了便于重組SIase的分離純化，并且盡可能減少在SIase中引入額外的氨基酸殘基，作者以所在課題組前期構(gòu)建的攜帶源自Klebsiella sp.LX3的SIase基因的質(zhì)粒pET-28a-SIase為模板（SIase基因存在于BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)之間），通過(guò)PCR擴(kuò)增和酶切連接技術(shù)將SIase基因擴(kuò)增并插入到pET-24b載體的Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，從而在SIase的C端引入組氨酸標(biāo)簽，并且N端不會(huì)引入多余的氨基酸殘基。首先設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)的SIase基 因 片 段。上 游 引 物F：5′-GAGTGATC CATATGGCACCATCCTTGAATCAGGATATTCACG-3′，下游引物R：5′-CTACTGCTCGAGCCGCAGCTTA TACACACCTGCC-3′，其中下劃線(xiàn)標(biāo)識(shí)分別為限制性核酸內(nèi)切酶QuickCutTMNde I和QuickCutTMXho I的識(shí)別位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為：5×Prime STAR?HSBuffer 10 μL，DNTP 4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL， 模 板 質(zhì) 粒 加 入2 μL，PrimeSTAR?HS Polymerase 0.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收得到的PCR產(chǎn)物和pET-24b載體用QuickCutTMNde I和QuickCutTMXho I進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為PCR膠回收產(chǎn)物1 000 ng，10×Green Buffer 2 μL，QuickCutTMNde I和QuickCutTMXho I各1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 μL，質(zhì)粒載體1 000 ng，10×Green Buffer 2 μL，QuickCutTMNde I和QuickCutTMXho I各1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 μL；酶切反應(yīng)條件為37℃反應(yīng)30 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后利用DNA膠回收試劑盒回收線(xiàn)性化載體質(zhì)粒和目的基因片段，繼續(xù)用連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板上。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選到的陽(yáng)性單克隆送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-24b-SIase，將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中得到工程菌。

1.3.2 分子伴侶與SIase共表達(dá)工程菌的構(gòu)建分別 將4種 分 子 伴 侶 質(zhì) 粒pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16（見(jiàn)表1）轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，利用含有終質(zhì)量濃度為30 μg/mL氯霉素的平板篩選陽(yáng)性克隆，并且再次將含有分子伴侶的重組菌制備成感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入pET-24b-SIase質(zhì)粒，涂布于含有氯霉素和卡那霉素的平板進(jìn)行篩選，得到同時(shí)含有分子伴侶質(zhì)粒和pET-24b-SIase質(zhì)粒的工程菌。

表1 攜帶分子伴侶質(zhì)粒信息Table 1 Information of plasmids harboring different molecular chaperons

1.3.3 SIase的誘導(dǎo)表達(dá)挑取含有SIase基因的陽(yáng)性單克隆接種于5 mL含終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)14 h得到種子液。將種子液以1%（體積分?jǐn)?shù)）比例轉(zhuǎn)入含50 μg/mL卡那霉素的LLB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌體OD600達(dá) 到0.6～0.8時(shí)，加 入 終 濃 度 為0.5 mmol/L的IPTG，在16℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。共表達(dá)工程菌需要進(jìn)行分子伴侶與SIase的分別誘導(dǎo)，首先挑取共表達(dá)工程菌的陽(yáng)性單克隆接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素和30 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)14 h得到種子液。將種子液以1%（體積分?jǐn)?shù)）比例轉(zhuǎn)入含50 μg/mL卡那霉素和30 μg/mL氯霉素的LLB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入誘導(dǎo)劑10 μg/mL的四環(huán)素（pG-Tf2）或500 μg/mL L-阿拉伯糖（pGro7、pKJE7、pTf16）以誘導(dǎo)分子伴侶表達(dá)，繼續(xù)在37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌體OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在16℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將未進(jìn)行和進(jìn)行了共表達(dá)的工程菌分別于8 000 r/min、5 min條件下離心收集菌體細(xì)胞，加入Buffer A緩沖液重懸，在冰水浴中超聲破碎（功率500 W，破碎5 s，間隔3 s，破碎30 min），10 000 r/min離心15 min分離可溶性上清液和沉淀組分，之后取20 μL可溶性上清液與5 μL 5×上樣緩沖液混合，將破碎后沉淀用Buffer A緩沖液重懸后取20 μL與5 μL 5×上樣緩沖液混合，上述樣品經(jīng)沸水處理5 min后分別吸取10 μL上清液樣品和5 μL沉淀樣品加至膠孔中進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

為此，工程項(xiàng)目劃分必須堅(jiān)持由項(xiàng)目法人組織監(jiān)理、設(shè)計(jì)及施工等單位進(jìn)行，并確定主要單位工程、主要分部工程、重要隱蔽單元工程和關(guān)鍵部位單元工程。項(xiàng)目法人在主體工程開(kāi)工前將項(xiàng)目劃分表及說(shuō)明書(shū)面報(bào)相應(yīng)質(zhì)量監(jiān)督機(jī)構(gòu)確認(rèn)。工程實(shí)施過(guò)程中，需對(duì)單位工程、主要分部工程、重要隱蔽單元工程和關(guān)鍵部位單元工程的項(xiàng)目劃分進(jìn)行調(diào)整時(shí)，項(xiàng)目法人要重新報(bào)送工程質(zhì)量監(jiān)督機(jī)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)。

1.3.4 重組SIase的分離純化將篩選到含最佳分子伴侶質(zhì)粒的工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于8 000 r/min、5 min條件下離心收集菌體細(xì)胞，加入Buffer A緩沖液重懸，在冰水浴中超聲破碎（功率500 W，破碎5 s，間隔3 s，破碎30 min），10 000 r/min離心15 min分離可溶性上清液和沉淀組分。由于重組SIase的C端帶有組氨酸標(biāo)簽，因此利用金屬離子螯合層析法進(jìn)行純化。將可溶性上清液經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后與提前用Buffer A緩沖液平衡的Ni-NTA 6FF瓊脂糖純化樹(shù)脂結(jié)合，流量為1 mL/min。之后分別用10倍柱體積的Buffer A緩沖液、Buffer B和Buffer C緩沖液進(jìn)行洗雜。最后利用Buffer D和Buffer E洗脫目的蛋白質(zhì)。將純化得到的不同組分取20 μL與5 μL 5×上樣緩沖液混合，經(jīng)沸水處理5 min后分別吸取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，純化得到的目的蛋白質(zhì)SIase經(jīng)透析處理后進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)表征。蛋白質(zhì)濃度采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.3.5 SIase酶活力的測(cè)定100 μL SIase（0.08 mg/mL）的酶液與400 μL含40 g/L蔗糖的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）混勻，于特定溫度下水浴反應(yīng)15 min，之后將樣品經(jīng)100℃沸水處理15 min終止反應(yīng)。將含有反應(yīng)產(chǎn)物的混合物于10 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為Hypersil APS-2氨基柱，流動(dòng)相為含有80%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈的水溶液，流量為1.0 mL/min。酶活力單位的定義：以蔗糖為底物，每分鐘釋放1 μmoL異麥芽酮糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 溫度對(duì)SIase酶活力的影響取100 μL含0.08 mg/mL SIase的酶液與400 μL含40 g/L蔗糖的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）混勻。分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60℃水浴反應(yīng)15 min，之后經(jīng)滅酶處理后利用HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中的異麥芽酮糖并進(jìn)一步計(jì)算酶活力。相對(duì)酶活力定義為以測(cè)定的最高酶活力為100%計(jì)算所得比值為相對(duì)酶活力。

1.3.7 pH對(duì)SIase酶活力的影響取100 μL含0.08 mg/mL SIase的酶液分別與400 μL含40 g/L蔗 糖 的pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混勻。在最適溫度條件下水浴反應(yīng)15 min，之后經(jīng)滅酶處理后利用HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中的異麥芽酮糖并進(jìn)一步計(jì)算酶活力。相對(duì)酶活力定義為以測(cè)定的最高酶活力為100%計(jì)算所得比值為相對(duì)酶活力。

1.3.8 SIase的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定分別以不同濃度的 蔗 糖 溶 液（8、16、32、40、80、160、200、320、400、640 mmol/L）為底物進(jìn)行蔗糖異構(gòu)酶活力的測(cè)定。反應(yīng)條件為：最適溫度和最適pH反應(yīng)條件下，水浴反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后將樣品經(jīng)100℃沸水滅酶15 min，將離心得到的上清液經(jīng)0.22 μm濾膜處理后進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析。利用GraphPad Prism5.0基于Michaelis-Menten方程進(jìn)行非線(xiàn)性擬合得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax，計(jì)算得到kcat、kcat/Km。

1.3.9 SIase的產(chǎn)物特異性分析取100 μL含0.08 mg/mL SIase的酶液與400 μL含40 g/L蔗糖的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 6.0）混勻，分別在30、35、40℃下水浴12 h進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，之后將反應(yīng)樣品經(jīng)100℃沸水滅酶處理，10 000 r/min離心15 min得到的上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，之后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIase在E.coli BL21（DE3）中的重組表達(dá)

首先以作者所在實(shí)驗(yàn)室保存攜帶SIase基因的pET-28a表達(dá)載體為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到含酶切位點(diǎn)的SIase基因，與pET-24b載體質(zhì)粒用QμickCutTMNde I和QμickCutTMXho I雙酶切分別獲得有黏性末端的SIase基因片段和線(xiàn)性化載體質(zhì)粒，之后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞，利用終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板篩選得到單菌落用于菌落PCR鑒定。利用pET系列載體的T7通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，如圖1所示，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物在1 500～2 250 bp處存在單一條帶，與pET-24b-SIase預(yù)期擴(kuò)增條帶1 896 bp位置一致，表明其為陽(yáng)性克隆。將驗(yàn)證正確的菌液送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序和進(jìn)一步比對(duì)，表明pET-24b-SIase表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒工程菌的菌落PCR鑒定Fig.1 PCR amplification for identification of gene engineering bacteria transformed with recombinant plasmid

將重組質(zhì)粒pET-24b-SIase轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中獲得工程菌，對(duì)重組工程菌在16℃、誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.5 mmol/L條件下誘導(dǎo)表達(dá)20 h。收集菌體經(jīng)超聲破碎后通過(guò)離心分離獲得可溶性目的蛋白質(zhì)上清液和不溶性沉淀，利用SDSPAGE進(jìn)行檢測(cè)。如圖2所示，經(jīng)誘導(dǎo)后在約66 400處出現(xiàn)與SIase理論相對(duì)分子質(zhì)量68 140相符的目 的 條 帶， 這 與 源 自P.dispersa UQ68J、K.pneumoniae NK33-98-8、E.rhapontici NX-5、S.plymuthica AS9的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中異源表達(dá)的相對(duì)分子質(zhì)量相近[10，12-13，21]。并且SIase主要以包涵體形式存在于不溶性沉淀組分中，表明利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)SIase進(jìn)行異源可溶性表達(dá)存在一定困難。

圖2 重組SIase的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of recombinant proteins of SIase by SDSPAGE

2.2 不同分子伴侶對(duì)SIase可溶性表達(dá)的影響

分子伴侶能分別或通過(guò)協(xié)同作用參與蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程，有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊和可溶性表達(dá)[22-23]。為提高SIase的異源可溶性表達(dá)水平，通過(guò)引入不同分子伴侶質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)不同分子伴侶與SIase的共表達(dá)，以探究利用分子伴侶共表達(dá)策略提高SIase可溶性表達(dá)的可行性。將重組質(zhì)粒pET-24b-SIase分別轉(zhuǎn)化至含有4種不同分子伴侶質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建出含有分子伴侶質(zhì)粒（pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16）的共表達(dá)工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-24b-SIase，進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)并利用誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖或四環(huán)素和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體經(jīng)超聲破碎后獲得上清液和不溶性沉淀，利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，含有分子伴侶質(zhì)粒pGro7和pG-Tf2的菌體破碎上清液中，可溶性SIase的含量明顯提高，其中共表達(dá)分子伴侶質(zhì)粒pGro7改善效果最好。因此，結(jié)果表明利用共表達(dá)分子伴侶策略能促進(jìn)SIase的可溶性表達(dá)，并且篩選到最佳分子伴侶質(zhì)粒pGro7，搖瓶發(fā)酵酶活力為14.8 U/mL，相比未進(jìn)行共表達(dá)的工程菌發(fā)酵酶活力3.5 U/mL有明顯提高，并且與已報(bào)道Erwinia rhapontici NX-5菌株發(fā)酵酶活力1.3 U/mL和Erwinia sp.D12經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化的發(fā)酵酶活力10.84 U/mL有一定程度的提高，與優(yōu)化發(fā)酵后的Klebsiella sp.LX3的發(fā)酵酶活力為15.12 U/mL相近，從而為進(jìn)一步系統(tǒng)優(yōu)化發(fā)酵條件打下了基礎(chǔ)[10-11，22]。目前大腸桿菌中主要存在3種分子伴侶組，其中DnaK-DnaJ-GrpE和TF因子在新生肽鏈的早期折疊階段保護(hù)其免于錯(cuò)誤折疊和聚集，GroES-GroEL主要協(xié)助部分折疊的多肽鏈克服折疊動(dòng)力學(xué)屏障[23-24]。同時(shí)，pG-Tf2分子伴侶組除表達(dá)GroES、GroEL外還表達(dá)TF因子，但相比pGro7并未產(chǎn)生更好的效果。因此，結(jié)果表明影響SIase正確折疊和可溶性表達(dá)的關(guān)鍵在于部分折疊的多肽鏈跨越動(dòng)力學(xué)屏障存在困難，這為后續(xù)進(jìn)一步提高SIase的異源可溶性表達(dá)提供了研究思路。

圖3 分子伴侶與SIase共表達(dá)工程菌的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of engineered bacteria coexpressing molecular chaperones and SIase

2.3 重組SIase的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)

由于重組SIase的C端帶有組氨酸標(biāo)簽，因此利用Ni-NTA 6FF瓊脂糖純化樹(shù)脂對(duì)含有分子伴侶質(zhì)粒pGro7的E.coli BL21（DE3）/pET-24b-SIase工程菌細(xì)胞破碎上清液中的重組SIase進(jìn)行純化，結(jié)果如圖4所示，利用含有30、50 mmol/L的咪唑的緩沖液有效除去了雜蛋白質(zhì)，并且利用含100 mmol/L咪唑的緩沖液成功純化到SIase。本研究中采用分子伴侶共表達(dá)策略有效提高了SIase的可溶性表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)了用金屬離子螯合層析法一步純化到純酶，而已報(bào)道研究中采用融合GST標(biāo)簽改善SIase的可溶性表達(dá)，后續(xù)純化需要蛋白酶切除標(biāo)簽和凝膠過(guò)濾層析才能得到純酶[16]。因此，本研究中在提高SIase可溶性表達(dá)的同時(shí)簡(jiǎn)化了其分離純化步驟，為針對(duì)SIase的基礎(chǔ)研究提供了更加簡(jiǎn)便的方法。

圖4 SIase純化的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis results of SIase purification

將重組SIase純酶透析后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。通過(guò)檢測(cè)SIase在20～60℃的酶活力以確定最適溫度。結(jié)果如圖5所示，SIase在20～40℃下酶活力隨溫度的升高而增加，在40℃表現(xiàn)出最高酶活力，其中在30～50℃下具有超過(guò)70%的相對(duì)酶活力，高于50℃后酶活力迅速下降，這一性質(zhì)與已報(bào)道重組蔗糖異構(gòu)酶的最適溫度主要在30～50℃相似[10，12]。

圖5 溫度對(duì)SIase酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzymatic activity of SIase

測(cè)定了在pH 4.0～8.0的酶活力，結(jié)果如圖6所示，在pH 5.0～6.5時(shí)SIase具有80%以上的相對(duì)酶活力，其中在pH 6.0時(shí)具有最高酶活力，而pH低于5.0和高于6.5時(shí)，酶活力迅速降低。在最適反應(yīng)條件下測(cè)定SIase的比活力為（317.6±15.6）U/mg。

圖6 pH對(duì)SIase酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on enzymatic activity of SIase

在最適反應(yīng)條件下測(cè)定重組SIase對(duì)不同濃度底物蔗糖的催化反應(yīng)初速度，基于Michaelis-Menten方程進(jìn)行非線(xiàn)性擬合得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果如表2所示，重組SIase對(duì)底物蔗糖的Km為（179.10±20.65）mmol/L、Vmax為 （13 497.0±620.7）μmol/（L·min）、kcat為 （974.4±129.0）s-1，kcat/Km為（5.44±0.72）L/（mmol·s）。

表2 SIase的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of SIase

2.4 重組SIase的產(chǎn)物特異性分析

采用HPLC檢測(cè)了重組SIase的蔗糖轉(zhuǎn)化率為98%，與文獻(xiàn)報(bào)道不同來(lái)源的蔗糖異構(gòu)酶的蔗糖轉(zhuǎn)化率（99.0%～99.7%）相近[10-11，25]，對(duì)30、35、40℃下SIase轉(zhuǎn)化蔗糖的反應(yīng)產(chǎn)物中不同糖組分的含量進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算產(chǎn)物中各組分相對(duì)含量，結(jié)果如表3所示。隨著溫度提高，重組SIase轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中異麥芽酮糖和海藻酮糖比例下降，單糖比例提高，與已報(bào)道的重組SIase表現(xiàn)出類(lèi)似的隨溫度提高的產(chǎn)物組成變化[16，21]。

表3 不同溫度下SIase催化糖產(chǎn)物組分的分析Table 3 Analysis of the catalytic products compositions of sucrose isomerase at different temperatures

3 結(jié)語(yǔ)

作者將源自Klebsiella sp.LX3的SIase在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，針對(duì)其主要以包涵體表達(dá)的問(wèn)題，通過(guò)比較4種不同分子伴侶共表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組SIase可溶性表達(dá)的影響，篩選到最佳分子伴侶質(zhì)粒pGro7，并以此為基礎(chǔ)利用金屬離子螯合層析技術(shù)純化到了SIase純酶。重組SIase轉(zhuǎn)化蔗糖的主產(chǎn)物為異麥芽酮糖，其最適溫度為40℃、最適pH為6.0。動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為（179.10±20.65）mmol/L、Vmax為 （13 497.0±620.7）μmol/（L·min）、kcat為（974.4±129.0）s-1、kcat/Km為（5.44±0.72）L/（mmol·s）。綜上，作者利用分子伴侶共表達(dá)策略提高了SIase的異源可溶性表達(dá)水平，為針對(duì)其高效表達(dá)的進(jìn)一步研究工作提供了必要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但需要注意的是，蔗糖異構(gòu)酶作為一種食品酶制劑，在大腸桿菌中表達(dá)存在一定安全隱患，因此后續(xù)工作可以參考本研究中采用的分子伴侶共表達(dá)策略，利用食品安全級(jí)微生物構(gòu)建高效異源表達(dá)系統(tǒng)，促進(jìn)蔗糖異構(gòu)酶在食品工業(yè)中的規(guī)模化制備和應(yīng)用。