米曲霉β-半乳糖苷酶的定向進(jìn)化、高效表達(dá)及應(yīng)用

李晨霞， 向芷璇， 李 敬， 江正強(qiáng)*， 閆巧娟， 馬俊文

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083）

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，EC 3.2.1.23），又稱乳糖酶，具有水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種催化活性[1]，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。微生物β-半乳糖苷酶具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)酶量大、催化活性高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，工業(yè)應(yīng)用的β-半乳糖苷酶主要來(lái)源于曲霉屬（Aspergillus sp.）和克魯維酵母屬（Kluyveromyces sp.），曲霉屬β-半乳糖苷酶是胞外酶，最適pH在酸性范圍內(nèi)（pH 2.5～5.4），最適溫度一般為50～60℃[2]。米曲霉（Aspergillus oryzae）的基因組中包含有6個(gè)β-半乳糖苷酶基因，目前已報(bào)道的3個(gè)來(lái)源于米曲霉的β-半乳糖苷酶基因（O58、AO、O76）均屬于GH35家族，可在畢赤酵母GS115表達(dá)[3]。其中，米曲霉β-半乳糖苷酶（AO）具有優(yōu)良的水解和轉(zhuǎn)糖苷活性，研究較多，尤其是在分子改造和固定化方面[4-7]。采用密碼子優(yōu)化和組成型啟動(dòng)子PGAP將該酶在畢赤酵母SMD1168H中高效表達(dá)[4]；通過(guò)組成型啟動(dòng)子PGCW14和源自酵母的自我復(fù)制序列（PARS）構(gòu)建關(guān)于該酶的非甲醇誘導(dǎo)游離型表達(dá)載體[5]；經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變，獲得突變體（N140C/W806F）的轉(zhuǎn)糖苷能力提高了24.1%[6]；通過(guò)制備共聚物（Col-Al/Col-Al-Glu）將該酶進(jìn)行固定化，實(shí)現(xiàn)該酶的重復(fù)利用[7]。米曲霉β-半乳糖苷酶能夠水解牛奶中的乳糖，可有效改善乳糖不耐癥，在乳制品行業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但水解效率和表達(dá)水平亟待提高。

通過(guò)分子改造提高β-半乳糖苷酶的水解效率，是提升其應(yīng)用價(jià)值的有效方法之一。定向進(jìn)化將乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）β-半乳糖苷酶水解乳糖的效率提高2倍[8]；凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）β-半乳糖苷酶第148位Asn突變?yōu)锳sp，降低水解產(chǎn)物半乳糖的抑制作用，提升水解效率，但突變體的酶活力僅為野生型的13.5%[9]；嗜熱脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）β-半乳糖苷酶第351位Glu突變?yōu)锳rg，提高了該酶對(duì)于乳糖的親和力，突變體的最適pH提高了0.5，比活力由1.86 U/mg提高到6.56 U/mg[10]；極端嗜熱古菌（Pyrococcus furiosus）β-半乳糖苷酶第415位Asn突變?yōu)镾er，改變了活性中心疏水基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，提高了該酶在巴氏滅菌溫度下牛奶中乳糖的水解效率，但突變體的酶活力僅120 U/mL[11]。這些研究通過(guò)定向進(jìn)化及定點(diǎn)突變提高了水解效率，但β-半乳糖苷酶的表達(dá)水平較低。畢赤酵母具有胞外高效表達(dá)、發(fā)酵工藝成熟、成本低等特點(diǎn)，已用于表達(dá)多種β-半乳糖苷酶[12]，如亮白曲霉（Aspergillus candidus）β-半乳糖苷酶在畢赤酵母中表達(dá)的酶活力達(dá)3 600 U/mL[13]。米曲霉β-半乳糖苷酶在畢赤酵母中表達(dá)的酶活力為4 239 U/mL[4]。因此，同時(shí)提高米曲霉β-半乳糖苷酶的水解效率及表達(dá)水平，更有利于工業(yè)化應(yīng)用。

米曲霉β-半乳糖苷酶（AoBgal35A）最適pH及溫度分別為pH 4.5及60℃[6]。作者利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)AoBgal35A進(jìn)行分子改造，在畢赤酵母中高效表達(dá)水解率提高的突變體，進(jìn)一步評(píng)價(jià)突變酶在制備無(wú)乳糖牛奶中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Fast Pfu DNA聚合酶：北京全式金生物技術(shù)公司產(chǎn)品；rTaq DNA聚合酶和DNA Marker：Takara公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶：New England Biolabs公司產(chǎn)品；真菌基因組DNA提取試劑盒：北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Axyprep DNA凝膠回收試劑盒：AxyGen公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；Lowry法蛋白質(zhì)濃度試劑盒：北京索萊寶公司產(chǎn)品；MyCycler PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀：美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；CBIO-GelPro凝膠成像分析系統(tǒng)：北京賽百奧科技有限公司產(chǎn)品；FUG-5 L單層玻璃機(jī)械攪拌發(fā)酵罐：上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司產(chǎn)品；GL-20B高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：上海青浦滬西儀器廠產(chǎn)品；Q-Sepharose強(qiáng)陰離子交換柱：美國(guó)GE Healthcare公司產(chǎn)品；TU-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Kieselgel 60硅膠板：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)：Agilent Technologies公司產(chǎn)品；其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.2 菌株及培養(yǎng)基

米曲霉（中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心NO.3.0411）菌株由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏[14]；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和畢赤酵母GS115：北京全式金生物有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pPIC9K：美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。

MM（minimal methanol）培養(yǎng)基：YNB 13.4 g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇10 g/L，瓊脂15 g/L；其他培養(yǎng)基的配置與文獻(xiàn)[12]相同。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 β-半乳糖苷酶隨機(jī)突變體文庫(kù)的構(gòu)建使用真菌基因組DNA提取試劑盒和總RNA提取試劑盒分別提取米曲霉基因組DNA和總RNA，采用PolyATract mRNA Isolation Systems（Promega）從 米曲霉總RNA中純化mRNA，并合成cDNA第一鏈。根據(jù)AoBgal35A基因序列（GenBank登錄號(hào)為KF857462），設(shè)計(jì)引物AoBgal35AF：5′-ATGAAGCT CCTCTCTGTTGCT-3′和AoBgal35AR：5′-TTAGTATG CTCCCTTCCGCT-3′，以米曲霉基因組cDNA為模板，擴(kuò)增基因。PCR反應(yīng)體系：5×Fast Pfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板1 μL，F(xiàn)ast Pfu DNA聚合酶1 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，20 s，55℃，20 s，72℃，3 min；反應(yīng)循環(huán)34次；72℃，5 min。膠回收PCR產(chǎn)物作為易錯(cuò)PCR模板。設(shè) 計(jì) 特 異 性 引 物Ao-F：5′-GTCATTAC GTAGCTT CCATCAAGCATCGTCTC-3′和Ao-R：5′-CTCAGCC TAGGTTAGTATGCTCCCTTCCGCTG-3′，采用不同濃度的Mg2+和Mn2+對(duì)米曲霉β-半乳糖苷酶基因（AoBgal35A）進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增。易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系如下：0.1 mmol/L Mn2+或0.2 mmol/L Mn2+1 μL，5 mmol/L Mg2+或7 mmol/L Mg2+1 μL，0.2 mmol/L dGTP和dATP各1 μL，1.0 mmol/L dCTP和dTTP各1 μL，0.2 μmol/L Ao-F/R各1 μL，1.25 U rTaq DNA聚合酶1 μL，模板1 μL，5×rTaq Buffer 10 μL，用純水補(bǔ)足至50 μL。易錯(cuò)PCR反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，3 min；反應(yīng)循環(huán)34次；72℃，10 min。

易錯(cuò)PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后進(jìn)行膠回收，用限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和AvrⅡ分別酶切膠回收產(chǎn)物和載體pPIC9k。用T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h，即為隨機(jī)突變體文庫(kù)。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，選取10個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序。收集隨機(jī)突變體文庫(kù)所有轉(zhuǎn)化子接入LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床培養(yǎng)4～5 h，提取質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pme I線性化，通過(guò)乙醇沉淀回收，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化步驟參考畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)（Version B，053002，Invitrogen）操作。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于MD平板，于30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72 h。

1.3.2 β-半乳糖苷酶隨機(jī)突變體文庫(kù)的篩選利用X-gal固體培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，牙簽挑取MD平板上的單克隆，點(diǎn)到涂有20 mg/mL X-gal溶液的MM平板上，30℃培養(yǎng)48 h。產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶后，可水解X-gal，從而形成深藍(lán)色菌落。挑取初篩具有β-半乳糖苷酶酶活力的菌株，接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于BMMY培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min培養(yǎng)72 h，每隔24 h補(bǔ)加0.5%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。發(fā)酵液經(jīng)離心，收集上清液即為粗酶液。粗酶液進(jìn)行水解活性復(fù)篩，以5 g/dL乳糖為底物，加酶量5 U/mL，在pH 4.5、50℃條件下反應(yīng)4 h后，將樣品煮沸5 min滅酶。采用薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）定性分析水解產(chǎn)物，樣品于TLC分析板上展層2次，展層劑為正丁醇、乙醇、水（體積比為5∶3∶2），用顯色劑完全浸濕吹干后在180℃顯色，顯色劑為濃硫酸和甲醇（體積比為5∶95），標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖、半乳糖和乳糖。乳糖水解率提高的突變體為正向突變體。將篩選到的正向突變體mAoBgal35A進(jìn)行基因測(cè)序，與野生型AoBgal35A的基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，確定mAoBgal35A的突變位點(diǎn)。

1.3.3 β-半乳糖苷酶突變體（mAoBgal35A）的高密度發(fā)酵及純化選取正向突變體mAoBgal35A轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，進(jìn)行高拷貝篩選。用無(wú)菌水將MD平板上的His+轉(zhuǎn)化子重懸，菌液適當(dāng)稀釋后，分別涂布于不同濃度G418-YPD平板上，30℃倒置培養(yǎng)2～5 d。挑取不同轉(zhuǎn)化子，搖瓶發(fā)酵3 d，測(cè)定上清液的酶活力。選擇酶活力最高的菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵方法及相關(guān)培養(yǎng)基配制參照畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)（Version B，053002，Invitrogen）操作。發(fā)酵液于4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液即為粗酶液，粗酶液在緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉鹽，pH 7.0）中透析過(guò)夜。利用QSepharose強(qiáng)陰離子交換柱純化重組蛋白質(zhì)，以0.4 mL/min流量上樣。交換柱預(yù)先用10個(gè)柱體積的緩沖液（20 mmol/L磷酸鈉鹽，pH 7.0）平衡，經(jīng)含0～500 mmol/L NaCl的20 mmol/L（pH 7.0）磷酸鈉鹽緩沖液線性洗脫，收集具有酶活力的組分，采用SDSPAGE分析蛋白質(zhì)純度，純化后的蛋白質(zhì)于pH 5.0檸檬酸緩沖液中透析。

1.3.4 β-半乳糖苷酶的酶活力及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定β-半乳糖苷酶酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]的方法。在1.5 mL的離心管中加入75 μL 15 mmol/L的oNPG和150 μL 50 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH 5.0），55℃預(yù)熱3 min后加入25 μL適當(dāng)稀釋的酶液，55℃反應(yīng)10 min后加入750 μL的2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，在410 nm下測(cè)定釋放的鄰硝基苯酚（oNP）的量。酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化oNPG水解釋放1 μmol鄰硝基苯酚所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。參照Lowry法[16]測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.3.5 β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定最適pH測(cè)定：采用50 mmol/L不同pH的緩沖溶液（檸檬酸-檸檬酸三鈉，pH 3.0～6.0；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，pH 6.0～7.0；Tricine，pH 7.5～8.0），按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定不同pH下的酶活力，以酶活力最高點(diǎn)為100%，分別計(jì)算不同pH下的相對(duì)酶活力。

pH穩(wěn)定性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]的方法，用上述不同pH的緩沖液稀釋酶液至約1 mg/mL于50℃保溫30 min，然后迅速將樣品置于冰水浴中冷卻30 min，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定其殘余酶活力，以未經(jīng)處理的純酶液酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

最適溫度測(cè)定：分別在不同溫度條件下（30～75℃）的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH 5.0）中測(cè)定酶反應(yīng)最適溫度。以酶活力最高點(diǎn)為100%，分別計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]的方法，酶液用檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH 5.0）稀釋至約1 mg/mL后，置于不同溫度（30～75℃）下保溫30 min，然后迅速將樣品置于冰水浴中冷卻30 min，測(cè)定其殘余酶活力，以未經(jīng)處理的純酶液酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力。

動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：以50 mmol/L最適pH緩沖液配制1.5～5.0 mmol/L的oNPG為底物，按照標(biāo)準(zhǔn)方法于最適溫度下反應(yīng)5 min后測(cè)定其比活力。通過(guò)GraphPad Prism 6軟件，根據(jù)Michaelis-Menten進(jìn)行非線性擬合計(jì)算突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.3.6 β-半乳糖苷酶突變體mAoBgal35A的水解特性及制備無(wú)乳糖牛奶水解特性：利用檸檬酸-檸檬酸三鈉（pH 5.0）緩沖液配置的5 g/dL乳糖為底物，在55℃和加酶量5 U/mL的條件下水浴保溫，分別在5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h取樣，樣品煮沸5 min滅酶。TLC檢測(cè)方法如1.3.2所示。HPLC檢測(cè)方法：以葡萄糖、半乳糖、乳糖的混合溶液（終質(zhì)量濃度為1 mg/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)品，色譜柱為BP-800Pb++，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器（RAD），流動(dòng)相為純水，進(jìn)樣體積為10 μL，流量為0.6 mL/min，柱溫為80℃。水解率的計(jì)算公式為：

式中：H為水解率，%；A1為初始乳糖質(zhì)量濃度，g/dL；A2為取樣時(shí)乳糖質(zhì)量濃度，g/dL。

制備無(wú)乳糖牛奶：在鮮牛乳中添加β-半乳糖苷酶mAoBgal35A，在室溫下優(yōu)化加酶量（1、2、3、4、5 U/mL），定時(shí)取樣后樣品煮沸5 min滅酶，以乳糖質(zhì)量濃度及水解率為指標(biāo)，通過(guò)HPLC進(jìn)行定量分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析采用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉β-半乳糖苷酶（AoBgal35A）隨機(jī)突變體文庫(kù)的篩選

調(diào)整易錯(cuò)PCR體系中Mg2+和Mn2+的濃度使堿基隨機(jī)錯(cuò)配，從而構(gòu)建隨機(jī)突變體文庫(kù)[18]。當(dāng)Mg2+為5 mmol/L、Mn2+為0.1 mmol/L時(shí)，隨機(jī)突變體文庫(kù)的氨基酸突變率為0.26%，處于合理突變范圍內(nèi)[19]。平板初篩10 000個(gè)突變體，300個(gè)突變體具有β-半乳糖苷酶活性，TLC分析水解產(chǎn)物，153個(gè)突變體具有水解活性。復(fù)篩到一個(gè)水解率明顯提升的正向突變體，命名為mAoBgal35A，經(jīng)序列比對(duì)，突變第955位的蘇氨酸Thr突變?yōu)楸彼酇la。

2.2 突變體mAoBgal35A的高密度發(fā)酵及純化

突變體經(jīng)G418-YPD平板篩選，搖瓶發(fā)酵酶活力最高為48 U/mL。經(jīng)5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)168 h后，發(fā)酵液中β-半乳糖苷酶的平均酶活力和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為4 760 U/mL和22 mg/mL，菌體質(zhì)量濃度為390 g/L（見(jiàn)圖1（a））。SDS-PAGE結(jié)果表明（見(jiàn)圖1（b）），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)分子質(zhì)量為110 000處的蛋白質(zhì)條帶逐漸變粗，與野生型AoBgal35A的相對(duì)分子質(zhì)量一致[4]，發(fā)酵上清液中β-半乳糖苷酶的含量逐漸增多。經(jīng)QSepharose強(qiáng)陰離子交換柱純化得到電泳級(jí)純酶（見(jiàn)圖1（c）），比活力由216 U/mg提高到250 U/mg，純化倍數(shù)1.2，回收率57.3%。

圖1 畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)mAoBgal35A歷程、SDSPAGE分析及純化Fig.1 Time-course of mAoBgal35A produced by Pichia pastoris，SDS-PAGE and purification of the extracellular fermentation

2.3 突變體mAoBgal35A的酶學(xué)性質(zhì)

mAoBgal35A的最適pH為5.0，比野生型（pH 4.5）提高0.5（見(jiàn)圖2（a）），在pH 4.0～7.0保持80%以上的酶活力，比野生型（pH 4.5～5.5）在更廣泛的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（見(jiàn)圖2（b））。mAoBgal35A的最適溫度為55℃，比野生型（60℃）降低5℃（見(jiàn)圖2（c）），mAoBgal35A在60℃以下保持80%以上的酶活力，較野生型（≤55℃）穩(wěn)定性稍有提高（見(jiàn)圖2（d））。mAoBgal35A對(duì)oNPG的Km為（2.89±0.18）mmol/L，低于野生型（（4.51±0.30）mmol/L），表明突變體對(duì)底物具有更高的親和力。同時(shí)，mAoBgal35A對(duì)oNPG的催化效率（kcat/Km）為246.98 mmol/（L·s），是野生型 （191.61 mmol/（L·s））的1.3倍，表明mAoBgal35A具有更高的催化效率。

圖2 AoBgal35A和突變體mAoBgal35A的最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.2 Optimal pH，pH stability，optimal temperature and thermostability of AoBgal35A and mAoBgal35A

2.4 突變體mAoBgal35A水解特性及制備無(wú)乳糖牛奶

mAoBgal35A水解乳糖的結(jié)果如圖3所示，以5 g/dL乳糖為底物，在pH 5.0和55℃的條件下反應(yīng)4 h，水解率由84.2%提高到95.2%。

圖3 mAoBgal35A水解乳糖的TLC和HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.3 TLC and HPLC of hydrolysis lactose in milk by mAoBgal35A

mAoBgal35A水解牛奶中乳糖的結(jié)果如圖4所示，主要考察在室溫條件下突變體mAoBgal35A水解牛奶中的乳糖的應(yīng)用。通過(guò)加酶量?jī)?yōu)化，發(fā)現(xiàn)隨著加酶量的增加，水解相同含量的乳糖所需的時(shí)間逐漸縮短，當(dāng)加酶量為2 U/mL時(shí)，水解72 h，牛奶中的乳糖基本被完全水解，乳糖水解率為90.0%，牛奶中乳糖質(zhì)量濃度為0.38 g/dL，根據(jù)我國(guó)《食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽管理規(guī)范》中有關(guān)《食品營(yíng)養(yǎng)聲稱和營(yíng)養(yǎng)成分功能聲稱準(zhǔn)則（衛(wèi)監(jiān)督發(fā)[2007]300號(hào)）》，達(dá)到了無(wú)乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)（乳糖質(zhì)量濃度≤0.5 g/dL）。牛奶色澤乳白，奶香濃郁，無(wú)不良風(fēng)味。

圖4 mAoBgal35A水解牛奶中乳糖的TLC和室溫下加酶量?jī)?yōu)化的HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.4 TLC and HPLC of hydrolysis lactose in milk with different enzyme dosage at room temperature by mAoBgal35A

3 討論

目前提高β-半乳糖苷酶水解能力主要采用定向進(jìn)化和定點(diǎn)突變的方法[8-11]。作者通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)米曲霉β-半乳糖苷酶AoBgal35A進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得一個(gè)乳糖水解率明顯提高的突變體mAoBgal35A。突變體在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)，經(jīng)高密度發(fā)酵，胞外酶活力為4 760 U/mL，高于米曲霉β-半乳糖苷酶在畢赤酵母KM71（4 239 U/mL）[4]、畢赤酵母GS115（1 434 U/mL）[20]和黑曲霉（2 640 U/mL）[21]中 的 表 達(dá) 水 平。 同 時(shí)， 產(chǎn) 酶（mAoBgal35A）水平也高于大多數(shù)β-半乳糖苷酶在畢赤酵母的表達(dá)水平，如來(lái)源于亮白曲霉（Aspergillus candidus，3 600 U/mL）[13]、 節(jié) 桿 菌（Arthrobacter sp.，1 926 U/mL）[22]及 泡 盛 曲 霉（Aspergillus awamori，347.8 U/mL）[23]等的β-半乳糖苷酶。mAoBgal35A的高效表達(dá)使其在工業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用潛力。

mAoBgal35A的最適pH及溫度分別為5.0和55℃，比野生型AoBgal35A（pH 4.5和60℃）分別提高了0.5和降低了5℃。mAoBgal35A的最適催化條件與大多數(shù)霉菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶相似，如銅綠擬青霉（Paecilomyces aerugineus，pH 4.5和60℃）[24]、黑曲霉（Aspergillus niger，pH 3.5～4.5和50～60℃）[25]和構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans，pH 5.0和60℃）[26]等，但高于乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis，pH 4.4和37℃）[27]來(lái)源的β-半乳糖苷酶。mAoBgal35A的pH穩(wěn)定性比野生型AoBgal35A（pH 4.5～5.5）有所提高，在pH 4.0～7.0保持穩(wěn)定，與泡盛曲霉（Aspergillus awamori，pH 4.7～7.5）[23]來(lái)源的β-半乳糖苷酶相近，優(yōu)于黑曲霉（Aspergillus niger，pH 3.5～5.5）[25]和土曲霉（Aspergillus terreus，pH 4.5～6.5）[28]來(lái)源的β-半乳糖苷酶。

序列分析表明，AoBgal35A與米曲霉來(lái)源β-半乳糖苷酶（AobGal，PDB：4IUG）有99%的同源性。AobGal的三維結(jié)構(gòu)由6個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，一個(gè)中心催化域被5個(gè)反平行的β-三明治結(jié)構(gòu)域包圍，排列成馬蹄形或字母C形[29]。突變體分析如圖5所示，mAoBgal35A中突變的氨基酸Thr955位于第五結(jié)構(gòu)域的β-片層結(jié)構(gòu)，與其周圍的Asp897和Asn951形成氫鍵相互作用。蘇氨酸突變?yōu)楸彼釡p少了一個(gè)Thr955和Asp897之間的氫鍵，可能使其最適溫度有所降低。蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，替換了蘇氨酸的長(zhǎng)側(cè)鏈，疏水殘基Ala取代了親水殘基Thr，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)親疏水平衡，從而對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有一定的影響。如擴(kuò)展青霉脂肪酶突變體K202A與隨機(jī)突變體（ep8）疊加突變使其熱穩(wěn)定性有一定的提高[30]。同時(shí)，極性殘基Thr突變?yōu)榉菢O性殘基Ala，使該部分區(qū)域極性下降，可能是最適pH變化的原因之一[31]。Thr955位于酶分子表面，遠(yuǎn)離催化口袋，與底物沒(méi)有直接的相互作用。Thr955突變?yōu)楸彼嵩鰪?qiáng)了蛋白質(zhì)的疏水性，這可能有助于在水溶液條件下形成更緊密的酶-底物復(fù)合物，從而提高水解活性[32]。如位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面的突變體V88A和S157P、K207G和D37V由于增加了蛋白質(zhì)的疏水性而提高了酶活性[33]。

圖5 AoBgal35A和mAoBgal35A的結(jié)構(gòu)、改變位點(diǎn)、作用力及表面電荷分布示意圖Fig.5 Structure，mutant sites，molecular force changes and surface charge distribution of AoBgal35Aand mAoBgal35A

牛奶的pH為6.5～6.8，突變體mAoBgal35A在pH 7.0仍能保持80%以上的酶活力，適合水解牛奶中的乳糖。mAoBgal35A在室溫及加酶量為2 U/mL水解72 h時(shí)，牛奶中乳糖質(zhì)量濃度為0.38 g/dL，達(dá)到無(wú)乳糖牛奶標(biāo)準(zhǔn)。而野生型AoBgal35A在加酶量為20 U/mL時(shí)，室溫水解72 h，牛奶中乳糖質(zhì)量濃度為0.6 g/dL[4]?？梢?jiàn)，mAoBgal35A的加酶量?jī)H需野生型的10%，即可達(dá)到更好的水解效果。歐文氏菌（Erwinia sp.E602）來(lái)源的β-半乳糖苷酶在加酶量為3 U/mL時(shí)，12 h水解牛奶中60%的乳糖[34]。嗜冷桿菌（Cryobacterium sp.LW097）來(lái)源的β-半乳糖苷酶Bgal322在加酶量為5 U/mL時(shí)，24 h僅水解牛奶中8.4%的乳糖[35]。因此，mAoBgal35A優(yōu)良的水解特性使其在制備無(wú)乳糖牛奶方面具有很好的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)語(yǔ)

對(duì)米曲霉β-半乳糖苷酶（AoBgal35A）基因進(jìn)行定向進(jìn)化，篩選到正向突變體mAoBgal35A，在畢赤酵母中高效表達(dá)，酶活力達(dá)4 760 U/mL，為目前米曲霉β-半乳糖苷酶在畢赤酵母中表達(dá)的最高水平。相比于野生型AoBgal35A，mAoBgal35A的最適溫度降低至55℃，最適pH提升至5.0，在pH 4.0～7.0和60℃以下保持穩(wěn)定。mAoBgal35A室溫下高效水解牛奶中的乳糖，在制備無(wú)乳糖牛奶方面具有潛在的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。