唐培培郝浩浩吳俊林周權(quán)李昂姜山劉哲陳劍暉李翔*馬金婷王杭肖金勝賈峰

（1河南省煙草公司駐馬店市公司，河南駐馬店 463000；2河南省駐馬店市煙草公司泌陽縣分公司，河南泌陽 463700；3湖北中煙工業(yè)有限責任公司襄陽卷煙廠，湖北襄陽 441000；4河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

煙草是一種需鉀量很大的作物，煙葉含鉀量是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標之一[1]。但我國北方煙區(qū)的煙葉含鉀量大多不足2%[2]，直接影響煙葉品質(zhì)。提高煙葉鉀含量的方法主要有增加外施鉀肥[3]和提高鉀離子吸收[3]。煙葉AKT1基因具有對鉀離子高親和力吸收的作用[4]，AKT1蛋白主要定位于細胞膜和核膜附近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有特定的保守域和Ion-trans結(jié)構(gòu)[5]，在植物鉀的吸收轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用[6]，介導(dǎo)了從低濃度鉀溶液中吸收鉀離子[7]。AKT1蛋白也可提高植株對NH4+的吸收[6]，在健壯煙苗的根部其表達量較高[8-9]。打頂后24 h內(nèi)煙草鉀離子通道基因在葉中表達量高于根，有利于鉀元素向葉中分配[10]。本研究旨在通過分析煙草中鉀離子通道基因和蛋白的生物信息學特點，為利用分子技術(shù)提高煙葉鉀含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

分別在 NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）、茄科數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）以及 Nicotiana atttenuata Data Hub（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/）下載9個擬南芥、9個煙草和2個番茄的AKT1基因或蛋白序列。

1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及疏水性分析

采用ExPaSy在線軟件Protparam（http：//web.exp asy.org/protparam/）分析蛋白序列的等電點、分子量和脂肪族氨基酸指數(shù)等性質(zhì)[11]。利用TMHMM網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量。利用SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISSMODEL （https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)。利用Expasy ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預(yù)測蛋白的疏水性。

1.3 AKT1蛋白磷酸化位點分析

利用 NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）分析蛋白的磷酸化位點，包括絲氨酸（Serine）、蘇氨酸（Threonine）和酪氨酸（Tyrosine）。

1.4 煙草AKT1基因的組織表達差異分析

利用Nicotiana atttenuata Data Hub中Expression中 Gene expression（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/chart/expression_genes）分析基因的組織表達量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016和PASW Statistics 18.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀離子通道蛋白理化性質(zhì)分析

鉀離子通道相關(guān)蛋白的理化特性結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，共篩選出煙草、擬南芥和番茄鉀離子通道蛋白20個，氨基酸數(shù)目范圍為662～2 655個，其中6個煙草鉀離子通道蛋白的氨基酸數(shù)目較多，平均2 250個氨基酸，而擬南芥和番茄鉀離子通道蛋白的氨基酸數(shù)目平均為805個。20個鉀離子通道蛋白的氨基酸數(shù)量及其分子量差異較大；鉀離子通道蛋白酸性和堿性各10個，其中，9個煙草鉀離子通道蛋白中，6個為堿性，3個為酸性。鉀離子通道蛋白平均每100個氨基酸中帶負電荷殘基的總數(shù)（Asp+Glu）為10.24個，鉀離子通道口附近有帶負電荷的殘基，可提高局部陽離子濃度而降低陰離子濃度[12]；每100個氨基酸中帶正電荷殘基的總數(shù)（Arg+Lys）為10.95個，正電荷殘基對減緩鉀離子通道的宏觀失活具有重要作用[13]。9個煙草鉀離子通道蛋白中5個穩(wěn)定，4個不穩(wěn)定；9個擬南芥鉀離子通道蛋白中6個穩(wěn)定，3個不穩(wěn)定，2個番茄鉀離子通道蛋白中穩(wěn)定與不穩(wěn)定各1個。20個蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)平均為97.18。

表1 鉀離子通道蛋白理化性質(zhì)與二級結(jié)構(gòu)含量

煙草鉀離子通道蛋白有5個為疏水性，4個為親水性；前人研究認為煙草鉀離子通道中布滿疏水氨基酸[12]，且氨基酸的疏水特性對鉀離子通道的正常失活也很重要[13]。一般認為鉀離子通道蛋白至少有4個跨膜結(jié)構(gòu)。9個煙草鉀離子通道蛋白中3個短的通道蛋白有5個跨膜結(jié)構(gòu)，6個長的通道蛋白有9～27個跨膜結(jié)構(gòu)；而9個擬南芥鉀離子通道蛋白有7個為5個跨膜結(jié)構(gòu)，其余2個分別為 6、7個跨膜結(jié)構(gòu)；2個番茄鉀離子通道蛋白分別為3、5個跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

對鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測見表1，煙草和擬南芥鉀離子通道蛋白α-螺旋的平均含量分別為37.99%和44.70%，延伸鏈的平均含量分別為22.94%和16.02%，β-轉(zhuǎn)角的平均含量分別為8.15%和6.15%，無規(guī)則卷曲平均含量分別為30.92%和33.13%。這20個蛋白的疏水性為-3.14～3.12，整體比較平衡。

由煙草NIATv7_g04651鉀離子通道蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果可看出，該蛋白由4個亞基組成，一半作為跨膜結(jié)構(gòu)通道，一半在膜外作為輔助開關(guān)結(jié)構(gòu)（圖1），與前期鉀離子通道蛋白通常由4個相同的亞基組成研究結(jié)論一致[14]。此結(jié)構(gòu)可以及時關(guān)閉通道，使胞內(nèi)的鉀離子不能釋放到細胞外。

圖1 煙草NIATv7_g04651鉀離子通道蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 鉀離子通道蛋白磷酸化位點預(yù)測分析

蛋白質(zhì)磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)調(diào)節(jié)方式，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要作用。NIATv7_g04651、NIATv7_g07244 和 NIATv7_g14627等3個煙草鉀離子通道蛋白的磷酸化位點在蛋白兩端分布比較密集，在中間分布相對稀疏，可能在蛋白的兩端更利于磷酸化的執(zhí)行，從而調(diào)控蛋白執(zhí)行相應(yīng)功能。

2.4 鉀離子通道相關(guān)基因的組織表達差異分析

煙草鉀離子通道相關(guān)基因的組織表達差異結(jié)果如表2所示，NIATv7_g04651、NIATv7_g07244和NIATv7_g14627等3個基因均在種子中有比較高的表達；NIATv7_g04651基因主要在花器官中表達，具體在花粉管、花藥、晚期花冠以及開放的花朵中有較高的表達；NIATv7_g07244基因除了在種子中高表達之外，也在柱頭和花蕾中有較高的表達，但是該基因在其他器官中整體表達量比較低；NIATv7_g14627基因除了在種子中高表達之外，也在根、莖、葉中有較高的表達，其他器官中表達量處于中等水平。結(jié)果表明，鉀離子通道基因在器官中表達具有特異性，即在不同的器官組織中，有不同的鉀離子通道基因起作用，在不同生長發(fā)育階段有不同鉀離子通道基因發(fā)揮作用。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，9個煙草鉀離子通道蛋白中6個為堿性，3個為酸性；5個為疏水性蛋白，4個為親水性蛋白。煙草NIATv7_g04651鉀離子通道蛋白由4個亞基組成，一半作為跨膜結(jié)構(gòu)通道，一半在膜外作為輔助開關(guān)結(jié)構(gòu)。NIATv7_g04651、NIATv7_g07244和NIATv7_g14627等3個蛋白的磷酸化位點在蛋白兩端分布較密集，在中間分布相對稀疏；NIATv7_g04651、NIATv7_g07244 和 NIATv7_g14627這3個基因的組織表達具有特異性，在不同生長發(fā)育階段有不同鉀離子通道基因發(fā)揮作用。