條斑紫菜DnaJ基因家族鑒定及其在環(huán)境脅迫下的表達(dá)分析?

孫 斌, 孔凡娜, 殷吉強(qiáng)

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

條斑紫菜(Pyropiayezoensis)具有由絲狀孢子體和葉狀配子體組成的異形世代交替的生活史。配子體自然情況下生長(zhǎng)于潮間帶的礁石上，受潮汐的影響，經(jīng)受周期性的干露失水、復(fù)水、光照、溫度等非生物因素的劇烈脅迫。復(fù)雜的生活環(huán)境賦予了條斑紫菜獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制，使其成為研究抗逆機(jī)制的潮間帶模式物種。同時(shí)，隨著全球變暖等問(wèn)題的加劇，高溫、低鹽等惡劣條件均嚴(yán)重地影響紫菜的生長(zhǎng)[1]，因此，有必要研究條斑紫菜的抗逆機(jī)制。

熱激蛋白(Heat shock protein，HSP)，又稱為熱休克蛋白，廣泛分布于生物界中[2]，在植物抵御脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)其分子量和功能的不同，可以將其分為6個(gè)家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和 小分子HSP(small HSP，sHSP)[3]。其中，HSP40作為HSP70的輔伴侶分子存在，具有1個(gè)高度保守的J結(jié)構(gòu)域，又被稱為DnaJ，可以促進(jìn)HSP70的ATP酶活性。DnaJ蛋白數(shù)量龐大且結(jié)構(gòu)多樣，一般可根據(jù)含有結(jié)構(gòu)域的不同分成 A、B、C 三類[4]：A類J蛋白包含J結(jié)構(gòu)域、富含甘氨酸和苯丙氨酸區(qū)域(G/F結(jié)構(gòu)域)和鋅指結(jié)構(gòu)域；B類J蛋白包含J結(jié)構(gòu)域、G/F結(jié)構(gòu)域；C類僅包含 J結(jié)構(gòu)域。其中，J結(jié)構(gòu)域有保守組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸三肽(His/Pro/Asp，HPD)，HPD是DnaJ蛋白與HSP70互作所必需的結(jié)構(gòu)[5]。DnaJ蛋白可參與維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的正確折疊、組裝、運(yùn)輸、降解等多種生命活動(dòng)進(jìn)程，在生物體抵抗和適應(yīng)高低溫、干旱等逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[6-9]。

在藻類抵抗外界脅迫的過(guò)程中，HSP蛋白發(fā)揮著重要的作用。條斑紫菜中，高溫、低溫及低鹽脅迫均可以誘導(dǎo)hsp90的上調(diào)表達(dá)[10]；在滸苔(Ulvaprolifera)中，hsp70在低鹽、高鹽及紫外照射脅迫下均上調(diào)表達(dá)[11]；在壇紫菜(P.haitanensis)中，高溫可誘導(dǎo)hsp70的高表達(dá)[12]。隨條斑紫菜失水程度升高，hsp40表達(dá)量也逐漸升高，而且有著明顯的世代差異，在孢子體世代下的表達(dá)量顯著高于配子體世代[13]。在藍(lán)藻(Cyanobacterial)中，小分子熱激蛋白(sHSP)可以增加光系統(tǒng)Ⅱ的耐熱性[14]，壇紫菜的sHSP基因在高溫和失水脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)量均顯著上調(diào)[15]。相較于其他HSP蛋白，有關(guān)DnaJ的研究大多集中在哺乳動(dòng)物、植物或者細(xì)菌上，在藻類中相對(duì)較少。因此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法首次在全基因組水平對(duì)條斑紫菜DnaJ家族進(jìn)行鑒定和分析，并進(jìn)一步探究了PyDnaJ家族部分成員在失水、溫度脅迫處理下的表達(dá)模式，以期為解析條斑紫菜抗逆機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的條斑紫菜RZ純系。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA)；DNA酶(購(gòu)自O(shè)MEGA)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自TAKARA)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自全式金)；快速質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自天根); 2×Taq Plus Master Mix(購(gòu)自南京諾唯贊)；ChamQTM SYBR Color qPCR Master Mix(購(gòu)自南京諾唯贊)。

1.2 方法

1.2.1 基因家族鑒定 本研究從 Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載DnaJ基因家族的隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)(PF00226)，利用 Hmmer3.0軟件[16]的Hmmsearch程序檢索條斑紫菜中DnaJ蛋白序列(閾值 E<10-5)；提取蛋白序列并構(gòu)建物種特異的HMM模型后，再次檢索條斑紫菜中的DnaJ蛋白序列(閾值 E<10-5)；根據(jù)輸出文件提取條斑紫菜中符合條件的蛋白序列，分別上傳至Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)確認(rèn)獲得的蛋白序列是否含有DnaJ結(jié)構(gòu)域，排除假陽(yáng)性，最終得到PyDnaJ家族成員。通過(guò)SnapGene軟件[17]、在線網(wǎng)站Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)分別對(duì)蛋白的等電點(diǎn)、分子量及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)及蛋白序列分析 使用TBtools[18]對(duì)DnaJ基因家族成員進(jìn)行分析，獲得基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。使用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對(duì)DnaJ家族成員的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，分布模型為Any number of repetitions(ANR)，預(yù)測(cè)保守基序數(shù)量為10，motif長(zhǎng)度設(shè)置為6～50 aa，并利用TBtools軟件實(shí)現(xiàn)motif預(yù)測(cè)結(jié)果的可視化。

1.2.3 染色體定位及基因復(fù)制分析 利用TBtools對(duì)基因家族成員進(jìn)行染色體定位分析及可視化，進(jìn)一步利用McScanX[19]解析基因組復(fù)制事件，并利用DnaSP6[20]計(jì)算了非同義替換率/同義替換率(Ka/Ks)值。

1.2.4DnaJ基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測(cè) 調(diào)取PyDnaJ基因家族成員的上游序列(2 000 bp)并上傳至PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件的分析和預(yù)測(cè)，并利用TBtools軟件進(jìn)行順式元件預(yù)測(cè)結(jié)果的可視化。

1.2.5DnaJ基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析 本研究結(jié)合條斑紫菜、壇紫菜、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、水稻(OryzasativaL.)DnaJ家族蛋白序列信息，探究DnaJ家族的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。利用本研究中基因家族鑒定方法，根據(jù)從NCBI下載的蛋白序列信息分別提取條斑紫菜、壇紫菜和萊茵衣藻中DnaJ家族成員蛋白序列，參考Luo等[21]的方法獲得水稻中的DnaJ家族蛋白序列，利用MegaX[22]對(duì)蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，建樹(shù)方法為最大似然法(Maximum Likelihood)，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.6 材料的處理和收集 用本實(shí)驗(yàn)室保存的條斑紫菜RZ作為實(shí)驗(yàn)材料。將健康生長(zhǎng)的孢子體和配子體材料吸干水分后，經(jīng)液氮冷凍，凍存于-80 ℃冰箱中。挑選同批培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且日齡為30 d的條斑紫菜葉狀體分別進(jìn)行失水脅迫和溫度脅迫處理，處理方法參考Kim等[23]和Sun等[24]，每組均設(shè)置3組平行，處理見(jiàn)表1。

1.2.7 基因表達(dá)分析 本研究選取條斑紫菜DnaJ家族中的部分成員(PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ19、PyDnaJ20、PyDnaJ25和PyDnaJ27)作為目的基因，引物序列如表2所示，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)分析不同成員在不同世代及失水、復(fù)水和溫度脅迫下的相對(duì)表達(dá)量的變化。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行組和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。選用PyUBC作為內(nèi)參基因[25]，用2-△△Ct法計(jì)算得到目的基因在不同脅迫下的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因家族的鑒定

經(jīng)過(guò)Hmmsearch檢索、CDD和Pfam結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，在條斑紫菜中共鑒定出27個(gè)DnaJ成員，分別命名為PyDnaJ01～PyDnaJ27。cDNA序列最長(zhǎng)為3 277 bp，最短為576 bp，編碼多肽的氨基酸數(shù)量為191～980，分子量為18.44～101.86 kDa，等電點(diǎn)為4.76～10.9。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有6個(gè)蛋白定位于高爾基體，2個(gè)蛋白定位于高爾基體/過(guò)氧化物酶體，9個(gè)定位于高爾基體/細(xì)胞核，1個(gè)定位于高爾基體/線粒體，2個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，1個(gè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/細(xì)胞核，2個(gè)定位于細(xì)胞核，4個(gè)定位于線粒體(見(jiàn)表3)。

表1 條斑紫菜的不同處理?xiàng)l件

表2 qRT-PCR所用引物序列

表3 條斑紫菜DnaJ家族成員特征

續(xù)表3

2.2 基因結(jié)構(gòu)和蛋白序列分析

基因結(jié)構(gòu)分析表明PyDnaJ基因家族成員含有較少的內(nèi)含子，其中PyDnaJ02、PyDnaJ06、PyDnaJ07、PyDnaJ09、PyDnaJ10、PyDnaJ14、PyDnaJ18、PyDnaJ21、PyDnaJ26和PyDnaJ27均含有1個(gè)內(nèi)含子，PyDnaJ05含有2個(gè)內(nèi)含子，PyDnaJ11含有3個(gè)內(nèi)含子，其余成員均不含有內(nèi)含子(見(jiàn)圖1)。

圖1 PyDnaJ家族基因結(jié)構(gòu)和motif結(jié)構(gòu)分析

蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，PyDnaJ家族成員共含有10個(gè)不同的Motif，不同成員含有Motif數(shù)量不等，全部成員均含有Motif1(見(jiàn)圖2B)，其為J結(jié)構(gòu)域核心序列，含有穩(wěn)定的HPD結(jié)構(gòu)；除PyDnaJ02和PyDnaJ07外，其余25個(gè)蛋白均含有Motif2和Motif3，Motif1與Motif3(見(jiàn)圖2A)、Motif2(見(jiàn)圖2C)組成了完整的J結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖2D)。結(jié)構(gòu)域分類結(jié)果顯示，條斑紫菜DnaJ家族成員根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域可以分為三大類，其中PyDnaJ11、PyDnaJ13、PyDnaJ17、PyDnaJ25 4個(gè)成員屬于A類，除含有J結(jié)構(gòu)域外，含有Motif7和Motif8。Motif7為富含甘氨酸和苯丙氨酸的G/F結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖2E)，Motif8為Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly (C-X-X-C-X-G-X-G)基序(見(jiàn)圖2F)，4個(gè)motif8組成完整的鋅指結(jié)構(gòu)域； PyDnaJ03、PyDnaJ08、PyDnaJ20 3個(gè)成員屬于C類，僅含有J結(jié)構(gòu)域；其余20個(gè)成員屬于B類，含有J結(jié)構(gòu)域和G/F結(jié)構(gòu)域。

(A：基序3；B：基序1；C：基序2；D：DnaJ家族J結(jié)構(gòu)域的HMM標(biāo)簽；E：基序7；F：基序8。A：motif3；B：motif1；C：motif2；D：HMM logo of J domain in DnaJ family；E：motif7；F：motif8.每列字母的總高度表示該位置的序列保守性(以bits為單位)，而該列中字母的高度反映了該位置相應(yīng)氨基酸的相對(duì)頻率。The overall height of each stack of letters indicates the sequence conservation at that position (measured in bits), whereas the height of symbols within the stack reflects the relative frequency of the corresponding amino or nucleic acid at that position. )

2.3 染色體定位與共線性分析

染色體定位結(jié)果表明(見(jiàn)圖3)，11個(gè)成員分布在PY_1染色體，8個(gè)成員分布在PY_2染色體，8個(gè)成員分布在PY_3染色體。

(PY_(1～3)：條斑紫菜1～3號(hào)染色體。PY_(1～3)：P. yezoensis 1～3 chromosome.)

共線性分析發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜DnaJ基因家族共存在2個(gè)共線基因(PyDnaJ01、PyDnaJ10)，因此被視為片段重復(fù)事件，其Ka為0.084 6，Ks為0.096 9，Ka/Ks值為0.873 07。根據(jù)Ka/Ks值估算片段重復(fù)基因的進(jìn)化選擇模式，Ka/Ks>1表示正選擇，Ka/Ks< 1表示純化選擇，Ka/Ks= 1 表示中性選擇，故PyDnaJ01和PyDnaJ10的進(jìn)化選擇模式為純化選擇。

2.4 DnaJ基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測(cè)

為了更好的預(yù)測(cè)基因功能，本研究檢測(cè)了DnaJ家族成員起始密碼子上游2 000 bp的序列用于啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的預(yù)測(cè)及分析(見(jiàn)圖4)，主要檢測(cè)出兩類順式作用元件，一類是同非生物脅迫(干旱、低溫、缺氧)響應(yīng)相關(guān)的元件(MBS、LTR、ARE等)，以及防御和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的元件(TC-rich repeats)等；另一類是植物激素響應(yīng)元件，包括茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)元件(TGACG-motif、CGTCA-motif等)、脫落酸響應(yīng)相關(guān)元件(ABRE)和生長(zhǎng)素響應(yīng)相關(guān)元件(TGA-box等)。

圖4 條斑紫菜DnaJ家族順式作用元件分布

2.5 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究對(duì)來(lái)自條斑紫菜(P.yezoensis，Py)、壇紫菜(Porphyrahaitanensis，Ph)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,Cr)和水稻(OryzasativaL.，Os)中的共135條DnaJ家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖5)，其中水稻DnaJ家族共有115個(gè)成員，隨機(jī)選出9個(gè)亞群的38個(gè)成員參與構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[16]。進(jìn)化樹(shù)分析，顯示135條序列分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11個(gè)亞群，其中，C亞群為紅藻和綠藻特有的亞群，I亞群為萊茵衣藻特有的亞群，其他亞群為紅藻和綠色植物共有的類群，說(shuō)明DnaJ家族在藻類與綠色植物分歧之前就已經(jīng)形成分化，在進(jìn)化過(guò)程中有的亞群在低等的綠藻和紅藻中單獨(dú)保留，有的則以直系同源的方式在不同的物種中形成。另外相對(duì)于綠色植物，條斑紫菜(27個(gè)成員)、壇紫菜(22個(gè)成員)中DnaJ成員的數(shù)量要遠(yuǎn)少于萊茵衣藻(48個(gè)成員)和水稻(115個(gè)成員)，說(shuō)明綠色植物的DnaJ在進(jìn)化過(guò)程中可能發(fā)生了擴(kuò)張。

圖5 PyDnaJ家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.6 基因表達(dá)水平檢測(cè)

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了PyDnaJ09、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ19、PyDnaJ20、PyDnaJ25和PyDnaJ27在配子體和孢子體世代下的表達(dá)模式(見(jiàn)圖6)，被選取的基因在孢子體世代的表達(dá)水平均極顯著高于配子體世代(P<0.01)。

(**表示差異極顯著(P<0.01)。**：Extremely significant difference(P<0.01).)

進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ25和PyDnaJ27在失水和復(fù)水脅迫下的表達(dá)模式(見(jiàn)圖7)發(fā)現(xiàn)：在失水脅迫下，PyDnaJ02和PyDnaJ09在不同程度失水脅迫下的表達(dá)水平均表現(xiàn)出明顯下調(diào)；PyDnaJ11和PyDnaJ18在中、低程度失水脅迫下(失水30%、50%)表現(xiàn)出極顯著下調(diào)(P<0.01)；PyDnaJ27在低程度失水脅迫下(失水30%)表現(xiàn)出明顯下調(diào)，在其他程度失水脅迫下的表達(dá)水平變化并不明顯；而PyDnaJ12在高程度失水脅迫(失水80%)下表現(xiàn)出極顯著上調(diào)(P<0.01)；PyDnaJ25在中、高程度失水條件下(失水50%、80%)的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。在復(fù)水脅迫下，PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12、PyDnaJ18、PyDnaJ25和PyDnaJ27均表現(xiàn)出極顯著下調(diào)(P<0.01)。

最后通過(guò)檢測(cè)PyDnaJ02、PyDnaJ09、PyDnaJ11、PyDnaJ12和PyDnaJ25在不同的溫度脅迫下的表達(dá)模式(見(jiàn)圖8)發(fā)現(xiàn)：在高溫脅迫(24 ℃)下(見(jiàn)圖8A)，PyDnaJ02、PyDnaJ11和PyDnaJ12的表達(dá)水平明顯下調(diào)，PyDnaJ09和PyDnaJ25的表達(dá)水平明顯上調(diào)；在0 ℃下(見(jiàn)圖8B)，PyDnaJ02和PyDnaJ09的表達(dá)水平明顯下調(diào)，PyDnaJ12和PyDnaJ25極顯著上調(diào)(P<0.01)，PyDnaJ11的表達(dá)水平變化不明顯；在-8 ℃下(見(jiàn)圖8C)，PyDnaJ11的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(P<0.01)，PyDnaJ02、PyDnaJ12和PyDnaJ25的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，PyDnaJ09的表達(dá)水平變化不明顯。

(A：失水組；B：復(fù)水組。30%：失水30%處理組；50%：失水50%處理組；80%：失水80%處理組；80%-30 min：失水80%后復(fù)水30 min處理組。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。A：Dehydration group；B：Rehydration group. 30%：30% dehydration group；50%：50% dehydration group；80%：80% dehydration group；80%-30 min：30 min rehydration after 80% dehydration group. *：Significant difference(P<0.05)，**：Extremely significant difference(P<0.01).)

(A：24 ℃處理組；B：0 ℃處理組；C：-8 ℃處理組；10 ℃：對(duì)照組。*表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。A：24 ℃ group；B：0 ℃ group；C：-8 ℃ group；10℃：Control group. *：Significant difference(P<0.05)，**：Extremely significant difference(P<0.01).)

3 討論

DnaJ家族在生物體中有著重要的作用，但目前在高等植物、哺乳動(dòng)物和細(xì)菌中關(guān)于DnaJ家族的研究較多，在紅藻中的研究相對(duì)較少。高等植物中一般存在著較多的DnaJ家族成員，其中：擬南芥中有120個(gè)成員[26]；高粱中有113個(gè)[27]成員；水稻中有115個(gè)[21]成員；甘藍(lán)(Brassicaoleracea)中有129個(gè)成員[28]；辣椒(CapsicumannuumL.)中有76個(gè)[29]成員。而本研究利用生物信息學(xué)方法在大型紅藻條斑紫菜中共鑒定出27個(gè)DnaJ家族成員，在壇紫菜中鑒定出22個(gè)成員，說(shuō)明紫菜中DnaJ家族成員的數(shù)量明顯少于高等植物。結(jié)構(gòu)域分析顯示，與綠色植物中的DnaJ家族類似，其27個(gè)成員中均含有保守三肽HPD，PyDnaJ11、PyDnaJ13、PyDnaJ17、PyDnaJ254個(gè)成員中均存在3個(gè)結(jié)構(gòu)域，PyDnaJ03、PyDnaJ08、PyDnaJ203個(gè)成員中均僅存在J結(jié)構(gòu)域，其余20個(gè)成員則是均含有J結(jié)構(gòu)域和G/F結(jié)構(gòu)域。DnaJ蛋白所含結(jié)構(gòu)域的不同通常作為蛋白分類的依據(jù)，且A和B類的功能類似，C類的功能不同于A和B類[30]，水稻和大豆中的DnaJ家族成員均可分成3類，其中最多的是C類[9, 31]；黃瓜中的DnaJ家族只有2類，缺少A類，最多的同樣是C類[32]。條斑紫菜中的DnaJ家族可分成3類，最多的是B類，條斑紫菜與高等植物在不同類別DnaJ蛋白數(shù)量上的差異可能反映了不同物種應(yīng)對(duì)外界脅迫的差異。DnaJ蛋白的功能與其亞細(xì)胞定位有一定的關(guān)系[26]，因此本研究對(duì)條斑紫菜DnaJ蛋白家族成員進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同的成員分別定位于細(xì)胞核、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體等不同的亞細(xì)胞位置，其中有18個(gè)成員定位到高爾基體，11個(gè)定位到細(xì)胞核；而在高等植物如擬南芥[33]中，發(fā)現(xiàn)有DnaJ蛋白定位到葉綠體中，并在葉綠體的發(fā)育、抗逆等過(guò)程中起到重要作用。之前也有研究發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻中存在定位于葉綠體中的DnaJ蛋白[34]，但是在本研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)定位到葉綠體的DnaJ蛋白，具體原因需要進(jìn)一步的探索。

高等植物中研究表明，DnaJ在溫度、干旱等逆境脅迫下，可以在植物體內(nèi)大量積累，從而增強(qiáng)植物的耐受性[21,35]，本研究進(jìn)一步對(duì)條斑紫菜部分PyDnaJ基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，研究結(jié)果表明，失水、溫度脅迫均可誘導(dǎo)PyDnaJ基因作出響應(yīng)，而且不同成員在同一脅迫條件下、同一成員在不同脅迫下具有不同的表達(dá)模式，這種多樣化的應(yīng)對(duì)表達(dá)模式豐富了條斑紫菜對(duì)復(fù)雜生境的適應(yīng)機(jī)制，如PyDnaJ02在不同的失水脅迫下的相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，而在-8 ℃下表現(xiàn)出明顯上調(diào)，這可能說(shuō)明PyDnaJ02對(duì)失水脅迫不敏感，對(duì)低溫脅迫敏感；PyDnaJ12在失水80%的條件下相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，在24 ℃下明顯下調(diào)，在0和-8 ℃下明顯上調(diào)，這說(shuō)明PyDnaJ12對(duì)高度失水、低溫脅迫比較敏感；值得注意的是，PyDnaJ25在不同失水和溫度脅迫下均表現(xiàn)出了很高的敏感性，可能該基因在條斑紫菜響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中有著重要作用，該研究結(jié)果與劉嬌等[13]的研究相似。同時(shí)順式元件分析表明，PyDnaJ家族的基因上游調(diào)控區(qū)也包含脅迫響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件。如：MBS(MYB binding site，MYB結(jié)合位點(diǎn))在玉米中參與到干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程[36]，GC-motif在玉米中參與到缺氧脅迫誘導(dǎo)過(guò)程中[37]；TGACG-motif和CGTCA-motif參與到茉莉酸甲酯的響應(yīng)過(guò)程，茉莉酸甲酯可以作為植物響應(yīng)損傷、高溫等脅迫過(guò)程的信號(hào)分子[38-40]；ABRE(Abscisic acid response element，脫落酸響應(yīng)元件)參與脫落酸的響應(yīng)過(guò)程，并在擬南芥響應(yīng)干旱、高鹽等過(guò)程中發(fā)揮作用[41]。這進(jìn)一步表明，PyDnaJ家族在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平均參與了應(yīng)答環(huán)境脅迫。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)條斑紫菜DnaJ基因家族成員的組成、蛋白特性、基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特點(diǎn)等方面進(jìn)行了研究，并利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)家族成員在不同脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步解析條斑紫菜抗逆機(jī)制奠定了前期工作基礎(chǔ)。