7 種生物藥劑對百香果莖基腐病菌的抑菌效果試驗

鄺瑞彬，楊 敏，周陳平，楊 護，黃炳雄，魏岳榮

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】百香果（Passif lora edulisSims）是西番蓮科西番蓮屬多年生藤本植物，果肉果汁口感酸甜，營養(yǎng)豐富，集食用、觀賞及藥用價值于一身，具有十分廣闊的市場前景［1］。在我國，近年來百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，主要集中在廣西、廣東、福建、云南、貴州等地。2019 年初百香果在各栽培區(qū)迅猛發(fā)展近3.3 萬hm2，產(chǎn)量約達100 萬t［2］。但是，我國百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展遭受著莖基腐病的重大威脅。開展百香果莖基腐病綜合防治研究，篩選安全高效低毒殺菌劑，對解決該病害問題，促進百香果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】該病病原菌為土傳真菌腐皮鐮刀菌（Fusarium sloani）和尖孢鐮刀菌（F.oxyporum），病菌以菌絲體、厚垣孢子和菌核存在于土壤中。病菌經(jīng)土壤侵入百香果根莖基部，導致主蔓莖基部產(chǎn)生褐腐病癥，木質(zhì)部有褐紅色栓狀堵塞，輕者使葉片黃化、萎蔫，嚴重時枝蔓枯萎乃至植株枯死，顆粒無收。百香果莖基腐病已逐步蔓延傳播至我國各大主產(chǎn)區(qū)，部分病重果園發(fā)病率達30%～40%，植株死亡率達40%～60%，經(jīng)濟損失巨大［3-6］。我國百香果莖基腐病防治主要采用健康無毒嫁接苗、抗病育種法、輪作間作法以及化學藥劑防治等方法。前兩者耗時長，實現(xiàn)難度較大；化學殺菌劑使用簡單見效快，但是頻繁過量使用容易增加農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和安全風險，生態(tài)環(huán)境受損，不利于百香果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［6-7］。隨著現(xiàn)代果樹可持續(xù)發(fā)展生產(chǎn)要求，應避免過度用化學農(nóng)藥，以免產(chǎn)生生態(tài)環(huán)境污染、農(nóng)藥抗性及農(nóng)藥殘留超標等問題［8-9］。利用高效、低毒、易降解的植物源抑菌劑或微生物及其代謝物的生物殺菌劑進行防治，已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向［10］。據(jù)前人研究報道，植物源生物殺菌劑如苦參堿、乙蒜素、萬壽菊殺菌素、多抗霉素、春雷霉素等在防治櫻桃莖腐病、蘋果輪紋病、西瓜枯萎病、棉花枯萎病、葡萄炭疽病等具有顯著的效果［11-15］。微生物源藥劑如寡雄腐霉菌劑、枯草芽孢桿菌、木霉菌、AM 菌等對辣椒疫病、蘋果輪紋病、人參灰霉病、橡膠炭疽病、水稻紋枯病等防治效果良好［12,16-18］?！颈狙芯壳腥朦c】廣東省百香果莖基腐病害嚴重發(fā)生，利用高效安全生物殺菌劑進行病害防治，符合人們對綠色健康食品的需求，但目前生物藥劑對百香果莖基腐病的抑菌效果尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本試驗利用室內(nèi)毒力測定和離體測試明確幾種生物藥劑對百香果莖基腐病病原菌的抑制效果，以期篩選出安全、高效的生物藥劑，作為化學殺菌劑的替代或有效補充，為安全高效綜合防治百香果莖基腐病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：百香果莖基腐病菌腐皮鐮刀菌（F.sloani）菌株FSP1 和FSP6、尖孢鐮刀菌（F.oxyporum）菌株FOP1 和FOP2，由廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究提供。

供試植物源藥劑為井岡霉素、苦參堿春雷霉素、乙蒜素、多抗霉素，微生物藥劑為枯草芽孢桿菌、哈茨木霉。其中8%井岡霉素水劑購自武漢科諾生物科技股份有限公司，1%苦參堿水劑購自廣東園田生物工程有限公司，2%春雷霉素可溶液劑購自山東澳得利化工有限公司，20%乙蒜素可濕性粉劑購自天津市漢邦植物保護劑有限責任公司，10%多抗霉素可濕性粉劑購自百事德生物化學科技有限公司，1×109CFU 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）粉劑和5×108CFU 哈茨木霉粉劑購自武漢科諾生物科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測定 病原菌培養(yǎng)：病原菌菌株在PDA 培養(yǎng)基中活化，用滅菌打孔器（直徑為6 mm）取菌塊繼代培養(yǎng)1 次。在超凈工作臺中用打孔器在已純化培養(yǎng)的菌落邊緣打孔，用滅菌挑種針挑取菌餅，放在PDA 培養(yǎng)基中央，用封口膜將其封好，倒置放入28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，待用。

毒力測定：采用菌絲生長速率進行室內(nèi)毒力測定。7 種生物藥劑用無菌水配制好母液，按照試驗設計稀釋成設定目標濃度10 倍的藥劑濃度備用，按比例添加到預熱到45℃的PDA 培養(yǎng)基中充分混勻，配置成不同濃度的含藥培養(yǎng)基。參考藥劑推薦劑量和前人研究結(jié)果，設置井岡霉素、春雷霉素、乙蒜素的濃度為0.5、5、50、500 mg/L，苦參堿濃度為5、50、500、1 000 mg/L，多抗霉素濃度為5、50、500、2 000 mg/L，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉?jié)舛葹?04、105、106、107CFU/g，以不添加任何殺菌劑的PDA 培養(yǎng)基作為空白對照。每個培養(yǎng)皿（直徑 9 mm）倒入20 mL 培養(yǎng)基，每個處理4 次重復。

用打孔器在菌株FSP6 菌落依次打取菌餅（直徑6 mm），將菌餅接種于上述含藥PDA 培養(yǎng)基中心位置，用封口膜密封培養(yǎng)皿防止污染，將平板倒置放于28℃恒溫條件下培養(yǎng)。6 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)，計算抑制率：抑制率(%)=(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100［19］。利用藥劑的濃度對數(shù)值與藥劑的抑制率幾率值的直線相關關系，使用EXCEL2010 進行回歸分析，求出供試藥劑的毒力回歸方程和相關系數(shù)R2、抑菌中濃度EC50值。試驗中,EC50值最低的藥劑為標準藥劑，相對毒力系數(shù)＝標準藥劑EC50/供試藥劑EC50×100［20］。

1.2.2 菌落形態(tài)觀察 培養(yǎng)后6 d，記錄菌落顏色、形態(tài)及生長情況，用光學顯微鏡觀察、記錄病原菌的菌絲、隔膜、分生孢子等形態(tài)特征。

1.2.3 不同菌株對生物藥劑的反應 另取菌株FSP1、FSP6、FOP1 和FOP2 在PDA 培養(yǎng)基中活化，根據(jù)毒力測試結(jié)果，選取適當濃度的藥劑井岡霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）、枯草芽孢桿菌（1×106CFU/g）配置PDA培養(yǎng)基藥處理。按1.2.1的方法進行培養(yǎng)，6 d 后計算相對抑制率［21］。

1.2.4 生物劑對百香果莖基腐病的防治試驗 離體試驗參考鄺瑞彬等［6］的方法，選取成熟勻稱的百香果枝條，選取適當濃度的藥劑井岡霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）、枯草桿菌（106CFU/g）設置處理，以無菌水為對照，共5 個處理，每個處理3 次重復，每個重復8 個莖段。藥劑處理枝條后風干5 min，用滅菌刀片在枝條中部劃約5 mm×5 mm 傷口，再均勻放置FSP6 菌塊在傷口處進行接種。將接種好的枝條放置在墊有濕潤吸水紙的培養(yǎng)皿中，置于植物恒溫培養(yǎng)箱（28 ℃，濕度80%），6 d 后觀察記錄處理莖段的病菌侵染情況。

田間試驗設在懷集縣橋頭鎮(zhèn)百香果試驗基地，該基地已連續(xù)種植百香果4 年，果園莖基腐病發(fā)生嚴重，試驗時間為2021 年4－6 月（雨季），供試品種為臺農(nóng)1 號百香果，扦插苗源，越冬成熟植株，設置井岡霉素10 mg/L、春雷霉素50 mg/L、乙蒜素50 mg/L、枯草芽孢桿菌106CFU/g 和清水對照5 個處理，每個處理3 次重復，每個重復20株，采用淋施和涂抹莖基部方法，每2 周施藥處理1 次，結(jié)果季調(diào)查植株發(fā)病情況。根據(jù)莖稈感染程度劃分病情等級為5 級，計算病情指數(shù)和防治效果：

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用EXCEL2010 進行回歸分析，采用SPSS 19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物藥劑室內(nèi)毒力測試

將菌株FSP6 接種在不同濃度藥劑處理的培養(yǎng)基中，采用菌絲生長速率法進行室內(nèi)毒力測定?；貧w分析結(jié)果見表1，本測試的植物性藥劑和微生物藥劑處理均能抑制菌株菌落生長，藥劑濃度越大，抑制作用越強，且不同殺菌劑間的毒力差別較大。植物性藥劑中以井岡霉素的毒力最強，抑菌效果最好、EC50值為7.79 mg/L，其次為春雷霉素和乙蒜素、EC50值分別為26.35 和28.65 mg/L，苦參堿次之，多抗霉素毒力最弱、EC50值達1 150.29 mg/L。微生物藥劑中，枯草芽孢桿菌毒力比哈茨木霉更強，其EC50值為3.2×106CFU/g。

表1 不同藥劑室內(nèi)毒力測試結(jié)果比較Table 1 Indoor toxicity test results of different fungicides

2.2 生物藥劑對菌株生長與形態(tài)的影響

百香果莖基腐病菌株FSP6 分別接種到7 種含藥PDA 平板中，培養(yǎng)6 d 后，挑取孢子菌絲利用光學顯微鏡觀察其形態(tài)特征。如圖1 和表2 結(jié)果顯示，不同藥劑處理對菌株孢子生長及形態(tài)均有一定的抑制作用?？瞻讓φ罩?，F(xiàn)SP6 的分生孢子為兩端微尖鐮刀型，一般為2～4 個隔，長度約為75.1～156.4 μm，小孢子為長卵形，35.3～63.3 μm；藥劑處理后，除了多抗霉素外，其余6 種藥劑處理的孢子顯著短于對照，尤其是苦參堿、春雷霉素、乙蒜素處理的孢子多為2 隔，兩端較鈍，孢子長度極顯著小于對照?？莶菅挎邨U菌處理分生孢子多為2～3 隔，孢子兩端較鈍，部分孢子腫脹畸形，孢壁破碎，細胞質(zhì)質(zhì)體泄漏。

表2 不同藥劑對百香果莖基腐病菌株菌落及孢子形態(tài)的影響Table 2 Effects of different fungicides on the colony and spore morphology of pathogen strains from stem rot diseased passion fruits

圖1 不同藥劑對百香果莖基腐病菌株孢子生長形態(tài)的影響Fig.1 Effects of different fungicides on the growth morphology of pathogen strain from stem rot diseased passion fruit

2.3 藥劑處理對莖基腐病原菌不同菌株生長的影響

根據(jù)室內(nèi)毒力測試結(jié)果，4 種抑菌效果較好的藥劑井岡霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）和枯草芽孢桿菌（106CFU/g）被選取用于測試不同菌株反應，測試菌株為前研究中百香果莖基腐病株分離并顯示致病力較強的菌株FSP1、FSP6、FOP1 和FOP2，測試結(jié)果見圖2，4 種藥劑處理均能達到較好的抑菌效果，藥劑處理菌落直徑顯著小于無藥劑對照。在井岡霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）和乙蒜素（50 mg/L）藥劑處理中，同一藥劑處理對不同菌株的抑制效果略有差異，對FOP1 和FOP2 的抑制作用顯著大于FSP1 和FSP6；而在枯草芽孢桿菌處理中，藥劑對4 個菌株的抑制效果最好，菌株間差異不顯著。測試結(jié)果表明，這4 種生物藥劑均可抑制百香果莖基腐病菌株生長，可用于該病害防治。

圖2 生物藥劑對百香果莖基腐病不同菌株生長的影響Fig.2 Effects of biological fungicides on the growth of pathogen strains from stem rot diseased passion fruits

2.4 生物源藥劑對離體百香果莖基腐病的防治效果

根據(jù)室內(nèi)毒力測試結(jié)果，4 種抑菌效果較好的藥劑井岡霉素（10 mg/L）、春雷霉素（50 mg/L）、乙蒜素（50 mg/L）和枯草芽孢桿菌（106CFU/g）被選取用于測試百香果莖枝的莖基腐病防治效果。如表3 所示，4 個藥劑處理的離體枝條病情指數(shù)均顯著低于對照，結(jié)合防效結(jié)果看，枯草芽孢桿菌的效果最佳，防治效果達70.6%，顯著高于其他藥劑處理；井岡霉素次之；春雷霉素和乙蒜素處理略低，分別為32.4%和29.4%，兩者差異不顯著。田間試驗結(jié)果顯示，試驗園區(qū)莖基腐病害發(fā)生嚴重，病情指數(shù)達52.0%，與不噴藥對照相比，4 個藥劑處理的病情指數(shù)顯著降低，其中井岡霉素和枯草芽孢桿菌的防治效果較佳、分別為53.7%和61.3%，春雷霉素和乙蒜素處理防治效果則較低、分別為38.5%和34.2%。田間試驗的防治效果結(jié)果與室內(nèi)檢測結(jié)果較為一致，但是枯草芽孢桿菌處理的防效略低于室內(nèi)檢測結(jié)果，可能與其為微生物來源有關，其田間試驗條件受環(huán)境如水分、土壤等影響較大，但田間觀察該處理百香果植株長勢明顯優(yōu)于對照，果實的品質(zhì)有所提高，應用前景較好。

表3 生物藥劑對百香果莖基腐病的防治效果Table 3 Control effects of biological fungicides on pathogen strains from stem rot diseased passion fruits

3 討論

百香果莖基腐病危害甚廣，在南美巴西、非洲、澳大利亞及韓國等東南亞國家與我國主產(chǎn)區(qū)如廣東、廣西、福建及海南等地均有報道，發(fā)病時間集中多在春夏多雨季節(jié)，經(jīng)濟效益嚴重受損［3-5］。其防控方法以化學防治較為迅速、有效，筆者在前期研究發(fā)現(xiàn)殺菌劑30%苯甲嘧菌酯和60%霜脲嘧菌酯、咪鮮胺、春雷王銅等混用或輪用，可較好防治百香果莖基腐病害［6］。百香果現(xiàn)代生產(chǎn)要保證有效控制病害，且需兼顧果實品質(zhì)安全和生態(tài)環(huán)保，研究使用安全、低毒、不易誘發(fā)抗藥性的生物藥劑，應用前景非常廣闊。本研究開展了7 種植物源及微生物藥劑對百香果莖基腐病致病菌株的孢子生長及形態(tài)的影響試驗，經(jīng)室內(nèi)毒力測試和防治效果試驗，篩選了兩種抑菌效果較好的生物藥劑。結(jié)果表明所測藥劑中抑菌效果最佳為井岡霉素（EC50為7.79 mg/L），其次為春雷霉素和乙蒜素，苦參堿毒力較弱，多抗霉素的毒力最弱；微生物藥劑以枯草芽孢桿菌效果較好。前人研究發(fā)現(xiàn)井岡霉素對鐮刀菌引起的櫻桃莖腐病、小麥莖基腐病、黨參根腐病菌等亦具有較好防治效果［11,22-23］，本試驗中井岡霉素對百香果莖基腐病原菌具有抑制作用，防治效果良好，與前人研究結(jié)果一致。林霞等［11］測定9種生物殺菌劑對櫻桃莖腐病菌的毒力，發(fā)現(xiàn)丁子香酚抑制效果最好，其次為乙蒜素和蛇床子素，多抗霉素則沒有抑制效果。柳自清等［14］通過毒力測定和田間防病試驗測試3 種生物藥劑對棉花枯萎病的防效，其中乙蒜素乳油效果最佳，田間防效為67.27%。吳曉云等［24］研究發(fā)現(xiàn)生物殺菌劑枯草芽孢桿菌對草莓根腐病具有較好的防治效果，防效在70%以上，與化學藥劑甲基硫菌靈效果相當。本研究結(jié)果與上述研究鐮刀菌防治試驗結(jié)果近似，對百香果莖基腐病害防治具有一定的應用指導作用。

試驗篩選的供試生物藥劑與常規(guī)化學殺菌劑作用機理不同。井岡霉素是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次生代謝物，能抑制真菌的海藻糖酶活性及纖維素降解酶、多聚半乳糖醛酸酶和肌醇生物合成的活性，對真菌的生長、毒素合成和致病力產(chǎn)生影響，對水稻紋枯病等真菌病害的防治作用已廣泛報道［25］，本試驗中井岡霉素對百香果莖基腐病及前人報道的鐮刀菌引起的真菌病害同樣具有良好的抑制作用。苦參堿是由苦參根莖等部位有機提取制成，主要成分為生物堿和黃酮類，對黃瓜灰霉病菌、櫻桃莖腐瘸菌和蘋果樹腐爛病菌等具有抑制效果［11,26-27］，本試驗中，百香果莖基腐病菌亦受到苦參堿藥劑的抑制，但效果不如井岡霉素顯著。乙蒜素和春雷霉素屬于植物仿生農(nóng)藥，來源于安全的天然物，具有低毒、低殘留的優(yōu)點，對葡萄炭疽病、蘋果腐爛病等抑菌效果良好［15,28］。本試驗結(jié)果亦表明乙蒜素和春雷霉素藥劑處理使病菌孢子生長和形態(tài)產(chǎn)生抑制作用，其毒力僅次于井岡霉素，具有良好的防效。枯草芽孢桿菌（B.subtilis），是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，容易分離培養(yǎng)，對人畜安全,環(huán)保，研究表明對防治油菜根腫病、棉花黃萎病等病害都有良好的防治效果［28-29］。前人研究認為枯草芽孢桿菌抑菌的機理主要是與病原菌競爭空間和營養(yǎng)物質(zhì)，且通過自身代謝活動產(chǎn)生多種抗菌素和酶，誘導植物抗病性；且分泌的脂肽類化合物和抗菌蛋白使細胞膜表面張力受到影響，導致離子的滲漏，菌絲畸形且細胞壁溶解［30-31］。本研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)枯草芽孢桿菌藥劑處理的百香果莖基腐病菌群生長受到抑制、產(chǎn)生畸形分生孢子，孢壁溶解，原生質(zhì)體外溢的現(xiàn)象，與前人研究結(jié)果一致。哈茨木霉對病原菌菌絲有強大的競爭能力和強烈的寄生作用，且分泌胞外溶菌酶抑制菌的生長，達到減輕病害的效果，在本試驗中，哈茨木霉對莖基腐病原菌有較好的抑制作用，但效果不如枯草芽孢桿菌。本試驗篩選的生物源藥劑毒力較強，安全無毒，具有良好的應用前景。

4 結(jié)論

本研究對幾種生物源藥劑進行室內(nèi)毒力測試和防治效果試驗，表明抑菌效果最佳為井岡霉素，其次為春雷霉素和乙蒜素；微生物藥劑以枯草芽孢桿菌效果較好。采用井岡霉素、枯草芽孢桿菌等生物藥劑混用或輪用，可作為化學防治方法的替代或有效補充進行推廣應用，為有效治理百香果莖基腐病害及減藥增效優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)提供指導。