斑馬魚ddx27基因?qū)p53基因的調(diào)控作用

陳改拓，周志杰，周澤斌，包林珠，邱軍強，李偉明，張慶華

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室/上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海 201306；2.密歇根州立大學(xué)農(nóng)業(yè)和自然資源學(xué)院，美國，密歇根，東蘭辛 48824

DDX 解旋酶（DEAD-box RNA helicase，DDX）屬于解旋酶超家族2（helicase superfamily 2，SF2）的成員，是真核生物、古細菌和細菌中最大的RNA 解旋酶家族之一[1］。DDX 解旋酶的特征是存在一個特定的氨基酸基序Asp-Glu-Ala-Asp（D-E-A-D），它參與RNA 代謝并發(fā)揮多種功能，如翻譯過程、轉(zhuǎn)錄過程、RNA 穩(wěn)定性、mRNA 輸出、mRNA 剪接等[2］。在人類和斑馬魚中DDX 解旋酶家族成員眾多，數(shù)量龐大，并且它們在結(jié)構(gòu)上高度保守[3］。DDX 解旋酶主要與癌癥、病毒感染和個體發(fā)育相關(guān)。例如人類DDX3在多數(shù)乳腺癌患者中過度表達，并且與乳腺癌遠端轉(zhuǎn)移相關(guān)[4］。

斑馬魚ddx27和人類DDX27一樣，作為DDX 解旋酶家族的一員，同樣也含有保守的D-E-A-D 序列。DDX27 調(diào)控核糖體RNA（rRNA）的成熟，參與調(diào)節(jié)47S 核 糖 體RNA（rRNA）的 形 成[5］。目 前 有 關(guān)DDX27 的研究主要聚焦于人類癌癥領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)DDX27 與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。例如，DDX27 通過控制細胞周期有助于胃癌細胞的集落形成，而DDX27的敲除可以抑制細胞周期進程而降低胃癌細胞的生存能力[6］。在大腸癌中DDX27的異位表達增強了大腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時也抑制了細胞凋亡[7］。斑馬魚ddx27除了調(diào)控核糖體的生物發(fā)生外，還與肌肉發(fā)生過程中特異轉(zhuǎn)錄物的翻譯有關(guān)，缺失ddx27的斑馬魚骨骼肌的生長和再生遭受了嚴重損害，這種情況被認定為一種新的核糖體疾病[8］。

TP53基因在調(diào)控癌癥發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，并且與DDX 解旋酶關(guān)系密切。例如有研究發(fā)現(xiàn)TP53與DDX3基因之間的P53-DDX3 通路的改變會導(dǎo)致P21蛋白減少，與早期人乳頭瘤病毒相關(guān)肺癌病人的無復(fù)發(fā)生存率（recurrence free survival，RSF）相關(guān)[9］。DDX5和DDX17基因在乳腺癌中高表達，蘇木酰化的DDX5 和DDX17 通過調(diào)節(jié)雌激素受體和P53 的活性對乳腺癌產(chǎn)生影響[10］。 DEADbox RNA 解旋酶家族成員之間在結(jié)構(gòu)上高度保守，并且在進化上也高度保守，均含有RNA和ATP結(jié)合位點這兩個高度保守的核心區(qū)域結(jié)構(gòu)[11］。而DDX27、DDX3、DDX5 和DDX17 同屬于DEAD-box RNA解旋酶家族，均與癌癥發(fā)生聯(lián)系密切。因此，我們猜測ddx27和tp53之間也可能存在相應(yīng)的調(diào)控關(guān)系，有必要進行詳細的研究。

目前斑馬魚被廣泛用于水產(chǎn)及人類疾病模型的研究，如早期發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)[12］、合成代謝[13］和癌癥等領(lǐng)域。斑馬魚在病理生理、發(fā)育和遺傳方面與人類表現(xiàn)出高度的相似性[14］。相較于線蟲和果蠅，斑馬魚與哺乳動物在進化上的關(guān)系更密切，具有更強的研究潛力。本研究通過構(gòu)建斑馬魚ddx27基因真核表達載體，并將其轉(zhuǎn)染到HEK293T 細胞中，利用亞細胞定位和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測蛋白水平的表達，最后將ddx27真核表達載體與tp53啟動子共轉(zhuǎn)，探究過表達ddx27對tp53的影響，以期為疾病及動物發(fā)育相關(guān)機制的深入研究提供良好的實驗材料，并為水生動物DDX 解旋酶家族成員的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和主要試劑

試驗用人胚腎細胞（human embryonal kidney，HEK293T）和內(nèi)參質(zhì)粒phRL-TK均由海軍軍醫(yī)大學(xué)李楠教授惠贈。tp53基因啟動子報告基因載體pGL3-p53-Luc由筆者所在實驗室自行構(gòu)建。

DH5α 感受態(tài)細胞購自北京擎科生物科技有限公司；高保真酶購自天根科技（北京）有限公司；膠回收/DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和同源重組試劑2×ClonExpress Mix 均購自南京諾唯贊科技股份有限公司；簡單培養(yǎng)基Opti-MEMTM、胰蛋白酶購自Gibco Life Technologies（美國）；Fugene?HD Trans?fection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑、Dual-Luciferase?報告基因活性檢測試劑盒均購自Promega（美國）；哺乳動物表達載體p3XFLAG-CMV-7、Bovine Serum Albumin、TritonTMx-100 購自Sigma（美國）；小鼠抗FLAG-tag單克隆抗體、β-actin、Rabbit pAb、Peroxidase-Conju?gated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Goat anti-Mouse IgG（H+L）Secondary Antibody、Alexa FluorTM488goat antimouse lgG9（H+L）購自Invitrogen（美國）。

試驗所用主要儀器：共聚焦顯微鏡（Leica，STELLARIS 5），酶標儀（BioTek，Synergy2），電泳儀（Bio-Rad，PowerPac Basic），照膠儀（Bio-Rad，Gel Doc EZ Imager）。

1.2 斑馬魚Ddx27氨基酸序列保守性分析

首先利用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl.de/）分析斑馬魚Ddx27 蛋白的結(jié)構(gòu)域。通過NCBI 網(wǎng)站得到其他物種的Ddx27 氨基酸序列之后，對斑馬魚Ddx27 氨基酸序列與人（Homo spaiens）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、蟒蛇（Python bivittatus）、大山雀（Parus major）和鴨嘴獸（Ornithorhynchus anati?nus）等物種的Ddx27 氨基酸序列進行比對。之后將各物種的Ddx27 氨基酸序列輸入MEGA7.0 軟件，利用軟件內(nèi)的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析斑馬魚Ddx27氨基酸序列的種間保守性。

1.3 斑馬魚ddx27真核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI 網(wǎng)站上登錄的斑馬魚ddx27基因（NM_001002869.1）的編碼序列（coding sequence，CDS）在兩端設(shè)計引物：利用諾唯贊官網(wǎng)的CE De?sign 引物設(shè)計程序，輸入ddx27基因CDS 區(qū)序列、載體序列并選擇好2個酶切位點，確認后得到帶同源臂的引物序列，如表1 所示。利用高保真酶與野生型（wild type，WT）斑馬魚的cDNA，進行ddx27CDS區(qū)片段的擴增，擴增程序為：98 ℃變性10 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s，進行34 個循環(huán)，最后保存在4 ℃（擴增體系同文獻[15］）。電泳檢測PCR產(chǎn)物，用割膠純化試劑盒對目標條帶進行PCR 產(chǎn)物純化回收?；厥债a(chǎn)物為帶有同源臂的片段，再利用同源重組連接酶使之與PstⅠ和BamHⅠ雙酶切后的pC?MV-3×Flag 質(zhì)粒連接。得到連接產(chǎn)物后，將產(chǎn)物加入到解凍后的DH5α 感受態(tài)細胞中，冰置30 min，通過熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物也就是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中，經(jīng)過氨芐抗性篩選出多個單菌落進行擴搖培養(yǎng)，再以擴搖的菌液為模板用通用引物（表1）進行菌液PCR，將出現(xiàn)正確片段大小的菌液全部送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與目的片段序列一致的菌液繼續(xù)擴搖，取其中部分進行保藏，剩下的菌液通過試劑盒提取重組質(zhì)粒。

表1 構(gòu)建ddx27重組質(zhì)粒所用引物以及酶切位點的選擇Table 1 Primers required for the construction of ddx27 recombinant plasmid and selection of enzyme digestion sites

1.4 Western blot驗證Ddx27蛋白的表達

使用脂質(zhì)體法將試驗組pCMV-3×Flag-ddx27真核表達載體與對照組pCMV-3×Flag 載體各自轉(zhuǎn)染至HEK293T 細胞中，在細胞裂解液中加入1∶1 000 蛋白酶抑制劑，在培養(yǎng)36 h 后向24 孔板加入細胞裂解液提取蛋白。取試驗組與對照組各20 μL和40 μL 蛋白樣品進行SDS-PAGE 聚丙烯胺凝膠電泳，加入冰盒后先80 V 電泳30 min，待樣品遷移至濃縮膠后再100 V 電泳80 min。電泳結(jié)束后用濕法轉(zhuǎn)膜器將凝膠上的條帶轉(zhuǎn)至NC 膜上，封閉液封閉1 h，棄去封閉液，以鼠源FLAG-tag 抗體為一抗（1∶3 000倍稀釋）孵育過夜，后用PBST 漂洗濾膜3 次，每次6 min，以山羊抗鼠為二抗（1∶3 000 倍稀釋）孵育5 h，再用PBST 漂洗濾膜4 次，每次6 min，加入顯影液拍照，用相同的操作得到β-actin 蛋白條帶，最后分析Western blot結(jié)果。

1.5 亞細胞定位檢測Ddx27蛋白的表達位置

將復(fù)蘇后的HEK293T 細胞培養(yǎng)至狀態(tài)穩(wěn)定后，把pCMV-3×Flag-ddx27質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中。在培養(yǎng)皿中用HD 轉(zhuǎn)染試劑將pCMV-3×Flag-ddx27和pCMV-3×Flag 各自轉(zhuǎn)染800 ng。轉(zhuǎn)染36 h 后，經(jīng)多聚甲醛固定，甲醇透化，緩沖液封閉后，添加一抗（FLAG-tag）和熒光二抗進行孵育，之后添加DAPI于黑暗中孵育，最后在共聚焦顯微鏡下觀察標本并拍照。詳細步驟參照文獻[16］。

1.6 雙熒光素酶試驗

待復(fù)蘇后的HEK293T 細胞狀態(tài)穩(wěn)定后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物（表2）添加到24 孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)36 h后使用酶標儀進行雙熒光素酶檢測并利用分析軟件計算螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）與海腎熒光素酶（Renillaluciferase）所激發(fā)的熒光強度的比值，比較對照組與試驗組之間的差異。每組設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)內(nèi)再設(shè)置3 個技術(shù)重復(fù)，共9個重復(fù)。詳細步驟參照文獻[15］。

表2 雙熒光素酶試驗轉(zhuǎn)染復(fù)合物配比Table 2 Dual-luciferase assay transfection complex proportion

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗所有原始數(shù)據(jù)用Excel 軟件進行統(tǒng)計分析，以平均值（mean）±標準誤差（SE）表示。利用Prism 8軟件進行顯著性分析，若P<0.05 則表示組間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚Ddx27氨基酸序列同源性分析

SMART 網(wǎng)站結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示斑馬魚Ddx27 蛋白編碼776 個氨基酸，擁有2 個主要的結(jié)構(gòu)域：位于220~421 氨基酸位點的DEXDc 結(jié)構(gòu)域與460~541 氨基酸位點的HELICc 結(jié)構(gòu)域，這2 個結(jié)構(gòu)域符合Ddx27 蛋白作為RNA 解旋酶的這一功能。氨基酸序列比對結(jié)果顯示斑馬魚與遮目魚Ddx27 氨基酸一致性最高，為83.99%，與人DDX27 的一致性為72.39%，與小鼠的一致性為71.46%，與鴨嘴獸的一致性為70.78%，與家燕的一致性為67.85%，與鬃獅蜥的一致性為61.64%。系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果表明，哺乳動物、鳥類和爬行類DDX27 聚為一大支，硬骨魚類Ddx27 聚為另一大支，哺乳動物各自聚為一個分支（圖1）。結(jié)合上述斑馬魚Ddx27 結(jié)構(gòu)域與同源性分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚Ddx27 蛋白在進化中具有較高的保守性。

圖1 斑馬魚Ddx27系統(tǒng)進化樹構(gòu)建Fig.1 Phylogenetic tree construction of zebrafish Ddx27

2.2 斑馬魚ddx27基因CDS區(qū)真核表達載體構(gòu)建結(jié)果與驗證

為了能夠在體外表達斑馬魚Ddx27 蛋白，利用同源重組法構(gòu)建了斑馬魚ddx27真核表達載體，結(jié)果顯示，ddx27基因CDS 區(qū)PCR 擴增結(jié)果（圖2A）與菌液PCR 電泳檢測結(jié)果（圖2B）均在對應(yīng)位置顯示出與預(yù)測片段大小一致的單一明亮條帶。說明目的片段已經(jīng)成功連接到載體上。將構(gòu)建的真核表達載體命名為pCMV-3×Flag-ddx27，經(jīng)測序驗證其信息與預(yù)測信息一致，表明ddx27真核表達載體構(gòu)建成功。

圖2 ddx27基因CDS區(qū)序列克隆與真核表達載體構(gòu)建驗證Fig.2 Sequence cloning of CDS region of ddx27 gene and validation of eukaryotic expression vector construction

2.3 蛋白免疫印跡法驗證重組質(zhì)粒的表達

為了驗證重組質(zhì)粒能否在HEK293T 細胞中表達，利用Western blot 進行蛋白表達分析，結(jié)果顯示只有試驗組出現(xiàn)了明顯的條帶，大小約為100 ku，與預(yù)測蛋白大小基本一致。表明重組質(zhì)粒成功在HEK293T細胞中表達Ddx27蛋白（圖3）。

圖3 Ddx27蛋白Western blot檢測結(jié)果Fig.3 Western blot results of Ddx27 protein

2.4 重組質(zhì)粒在HEK293T細胞中的表達位置

亞細胞定位結(jié)果如圖4 所示。圖中呈現(xiàn)藍色熒光的是DAPI試劑標記的細胞核，呈現(xiàn)綠色熒光的是FLAG 標簽抗體標記的pCMV-3×Flag-ddx27，同時進行明場觀察。試驗組綠色熒光與藍色熒光重疊，而對照組沒有觀察到綠色熒光，說明pCMV-3×Flag-ddx27載體聚集于HEK293T 細胞的細胞核中進行表達，Ddx27 蛋白定位于細胞核，符合ddx27參與細胞核內(nèi)rRNA加工的功能。

圖4 pCMV-3×Flag-ddx27在HEK293T細胞中的定位Fig.4 Localization of pCMV-3×Flag-ddx27 in HEK293T cells

2.5 雙熒光素酶試驗結(jié)果

通過比較對照組與試驗組pGL3-tp53-Luc 啟動子的熒光素酶相對活性，發(fā)現(xiàn)過表達斑馬魚ddx27基因后，pGL3-tp53-Luc 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性顯著升高，約為對照組活性的1.8 倍，試驗組和對照組具有顯著差異（圖5）。說明過表達斑馬魚ddx27基因可以顯著促進tp35基因的表達。

圖5 斑馬魚ddx27對tp53轉(zhuǎn)錄活性的影響Fig.5 Effect of zebrafish ddx27 on the transcriptional activity of tp53

3 討 論

DEAD-box解旋酶家族幾乎參與各種與RNA相關(guān)的生化進程，其中DDX27 參與調(diào)控核糖體的生物發(fā)生中rRNA 的成熟[17］。斑馬魚Ddx27 能夠調(diào)控特定細胞中rRNA 的成熟，具有特異性，當斑馬魚缺乏Ddx27 會導(dǎo)致肌肉細胞核的rRNA 合成缺陷，而其他DDX 解旋酶家族成員不能彌補這種缺陷，驗證了ddx27在骨骼肌中的高度特化作用[8］。我們研究發(fā)現(xiàn)ddx27在HEK293T 細胞的細胞核中表達，證實了ddx27于細胞核內(nèi)調(diào)控rRNA 的成熟的功能，但HEK293T 細胞屬于腎細胞，并且DDX27在多種癌細胞中高表達，說明DDX27的功能并不局限于此。

最新研究發(fā)現(xiàn)在人類乳腺癌中DDX27 的過度表達可增強與干細胞相關(guān)的生物標記物的表達，并促進干細胞活性，導(dǎo)致乳腺癌細胞的增殖和遷移[18］。DDX27 還能通過增強ERK 信號傳導(dǎo)，在人類肝癌中起誘導(dǎo)作用[19］。通過siRNA 技術(shù)敲除腎癌細胞中的DDX27基因后能夠有效降低腎癌細胞的遷移和侵襲能力[20］。上述研究都在人類癌細胞中發(fā)現(xiàn)DDX27高表達，暗示DDX27 在人類癌細胞中發(fā)揮癌基因作用，可以將其作為癌癥治療的靶點。斑馬魚ddx27基因作為人類DDX27基因的同源基因，參與斑馬魚肌肉的發(fā)育，而我們的研究發(fā)現(xiàn)ddx27基因可以增強tp53基因的轉(zhuǎn)錄活性，并且斑馬魚tp53基因啟動子區(qū)預(yù)測到了Sp1、c-Jun 和NF-kappaB1 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，Sp1 和c-Jun 均與凋亡相關(guān)，NF-kappaB1能夠調(diào)節(jié)翻譯水平上的P53 表達[15］。另有研究發(fā)現(xiàn)DDX10 下調(diào)后可以通過Akt/NF-κB 途徑促進卵巢癌的增殖[21］，說明斑馬魚ddx27可能通過Akt/NFκB 途徑調(diào)控tp53，而tp53在斑馬魚腦神經(jīng)嵴發(fā)育中起到了重要作用[22］，因此ddx27除了參與多種癌癥的發(fā)生，還可能參與動物不同組織器官的發(fā)育過程，這需要進一步的深入研究。斑馬魚作為新興的模式動物，作為硬骨魚類的代表，對其DDX 解旋酶家族分子功能的研究較少。我們的研究顯示斑馬魚Ddx27 蛋白氨基酸序列與人類及小鼠同源基因的一致性高達70%以上，表明斑馬魚ddx27基因與人類和小鼠中的同源基因功能存在較高的保守性，因此，斑馬魚能夠成為研究人類疾病機制的有效動物模型。

綜上所述，本研究對構(gòu)建成功的斑馬魚pCMV-3×Flag-ddx27真核表達載體進行了蛋白表達分析以及亞細胞定位，過表達斑馬魚ddx27基因載體后，能夠增強tp53基因的表達，為進一步解析動物發(fā)育疾病及人類各種癌癥發(fā)生的詳細機制奠定了理論基礎(chǔ)，也為進一步研究DDX 家族的功能和機制提供可靠的研究材料。