李德仁 白婷婷 李小佳 成栢吉 呂鎮(zhèn)城

基于HS-SPME-GC-MS的小羅傘根揮發(fā)性成分分析條件優(yōu)化

李德仁 白婷婷 李小佳 成栢吉 呂鎮(zhèn)城

（惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 廣東惠州 516007）

建立基于HS-SPME-GC-MS法的快速測定小羅傘根揮發(fā)性成分的方法。以總峰面積為考察指標(biāo)，在單因素（萃取頭極性、萃取溫度、萃取時(shí)間、平衡時(shí)間、解吸時(shí)間等）實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過9（34）四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示：最佳條件為萃取針CAR/DVB/PDMS，萃取溫度80℃、平衡時(shí)間20 min、萃取時(shí)間50 min、解吸時(shí)間4 min；在此條件下，從羅浮山小羅傘根部鑒定出27種揮發(fā)性成分，主要為-古巴烯（27.59%）、水楊酸甲酯（9.04%）、-姜黃烯（8.58%）、-雪松烯（8.46%）。本研究結(jié)果可為快速分析小羅傘根的揮發(fā)性成分提供科學(xué)依據(jù)。

小羅傘根；揮發(fā)性成分；頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；萃取條件優(yōu)化

小羅傘學(xué)名為山血丹（Lindl），又名血黨、活血胎，屬于紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（）灌木，具有活血調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)散瘀、消腫止痛等功效，藥用部位主要是根部[1-2]。目前，對(duì)其研究主要集中在化學(xué)成分方面[3-4]。小羅傘根部是制作羅浮山百草油的68種原料之一。羅浮山百草油是國家級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，傳承至今已有1 600多年歷史。小羅傘根揮發(fā)性成分是評(píng)價(jià)其藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)，但是，目前鮮見有關(guān)廣東羅浮山小羅傘根揮發(fā)性成分的報(bào)道。因此，有必要建立一種基于HS- SPME-GC-MS技術(shù)的快速分析小羅傘根揮發(fā)性成分的方法，以期為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)及功效挖掘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 小羅傘于2019年3月采集自廣東惠州羅浮山，標(biāo)本經(jīng)惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院呂鎮(zhèn)城博士鑒定為小羅傘（Lindl），將小羅傘根粉碎后過篩備用。

1.1.2 儀器 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890B- 5977A（Agilent公司，美國）；HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（Agilent公司，美國）；自動(dòng)頂空固相微萃取裝置（Agilent公司，美國）。萃取針型號(hào)：65 μm PDMS/DVB；50/30 μm DVB/CAR/PDMS；85 μm CAR/PDMS；85 μm PA（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察不同極性萃取針（65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/ PDMS、85 μm CAR/PDMS、85 μm PA）、萃取溫度（50、60、70、80、90℃）、萃取時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、平衡時(shí)間（10、15、20、25、30 min）和解吸時(shí)間（2、4、6、8、10 min）對(duì)小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用CAR/DVB/PDMS萃取針，以萃取溫度、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間和平衡時(shí)間為因素，進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)（表1），以總峰面積為考察指標(biāo)，優(yōu)化小羅傘根揮發(fā)性成分的最佳萃取條件。

表1 小羅傘根揮發(fā)性成分正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.2.3 GC-MS分析條件 氣相色譜（GC）升溫程序：起始溫度40℃，以8℃/min速率升溫到130℃，再以2℃/min速率升溫到150℃，最后以15℃/min速率升到250℃，保留5 min。進(jìn)樣口溫度250℃，氣質(zhì)傳輸口溫度280℃；載氣為高純度氮?dú)猓?9.999%），不分流進(jìn)樣，流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜（MS）條件：電離方式為EI，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，氣質(zhì)傳輸線溫度280℃；電子能量為70eV，掃描方式選擇Scan全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍為50～500 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 極性萃取針對(duì)小羅傘根揮發(fā)性成分影響

由于萃取針纖維涂層極性不同，其對(duì)樣品的揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果也各不相同。從圖1可知，不同萃取頭吸附的小羅傘根揮發(fā)性成分的總面積大小為50/30 μm DVB/CAR/PDMS>85 μm CAR/ PDMS>65 μm PDMS/DVB> 85 μm PA。在這4種不同極性萃取針涂層中，PA屬于高極性，CAR/ PDMS屬于低極性，而DVB/CAR/PDMS萃取針則介于二者之間，屬于中極性，對(duì)醇類、醛類、酸類、酮類、酯類等化合物均具有高的吸附性[5]。因此，選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS作為萃取針進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同極性萃取針下小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積

2.2 萃取溫度對(duì)小羅傘根揮發(fā)性成分影響

萃取溫度是影響揮發(fā)性成分從樣品里揮發(fā)的重要因素。從圖2可以看出，在萃取溫度50～90℃時(shí)，小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積隨著萃取溫度的升高而增大，在90℃時(shí)總峰面積最大。但是，萃取溫度過高，也可能會(huì)導(dǎo)致某些揮發(fā)性成分分解或不同的揮發(fā)性成分之間發(fā)生反應(yīng)，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真[5]。有報(bào)道指出，萃取溫度對(duì)萃取效果的影響表現(xiàn)為，升高溫度能加快待測組分的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)富集，但過高的溫度會(huì)影響待測物在氣相與涂層間的分配系數(shù)，反而不利于萃取的平衡[6]。

圖2 不同萃取溫度下小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積

2.3 平衡時(shí)間對(duì)小羅傘根揮發(fā)性成分影響

平衡時(shí)間即加熱時(shí)間，是樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)成分在氣相中達(dá)到平衡所需要的時(shí)間。如圖3所示，平衡時(shí)間從10～15 min時(shí)，揮發(fā)性成分總峰面積呈上升趨勢；而平衡時(shí)間在15～30 min時(shí)，總峰面積呈現(xiàn)降低的趨勢。表明在磁力恒溫振搖器振搖作用下，小羅傘根揮發(fā)性成分在15 min即達(dá)到平衡狀態(tài)。

圖3 不同平衡時(shí)間下小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積

2.4 萃取時(shí)間對(duì)小羅傘根揮發(fā)性成分影響

由圖4可知，在萃取時(shí)間10～40 min時(shí)，小羅傘根揮發(fā)性成分的總峰面積隨著萃取時(shí)間的增加而逐漸增加，萃取時(shí)間為40～50 min時(shí)，總峰面積變化不大。結(jié)果提示，萃取40 min后，揮發(fā)性成分在氣相與萃取針之間達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，總峰面積趨于穩(wěn)定。

圖4 不同萃取時(shí)間下小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積

2.5 解吸時(shí)間對(duì)小羅傘根部揮發(fā)性成分影響

從圖5可以看出，隨著時(shí)間從2～4 min時(shí)，揮發(fā)性成分的總峰面積隨著解吸時(shí)間的延長而增大；在4 min以后，總峰面積則隨著時(shí)間延長而降低。由于解吸溫度高達(dá)250℃，一方面，待測樣品中一些熱不穩(wěn)定成分可能因此而分解；另一方面，長時(shí)間的高溫解吸會(huì)縮短萃取針的使用壽命。結(jié)果提示，4 min左右已經(jīng)能夠?qū)⒋蟛糠謸]發(fā)性成分從萃取針中解吸出來。

圖5 不同解吸時(shí)間下小羅傘根揮發(fā)性成分總峰面積

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

通過分析各因素極差可以直觀地比較出實(shí)驗(yàn)的主次因素，從而選出最優(yōu)水平。如表2所示，以總峰面積作為考察指標(biāo)，結(jié)果顯示，R>R>R>R，表明萃取時(shí)間C是影響小羅傘根揮發(fā)性成分提取的主要因素；萃取溫度次之，第三為平衡時(shí)間，第四為解吸時(shí)間。根據(jù)各因素的極差值大小選出最大值，可以得出最優(yōu)組合2332，即最優(yōu)分析條件為：萃取溫度80℃、平衡時(shí)間20 min、萃取時(shí)間50 min、解吸時(shí)間4 min。

2.7 小羅傘根揮發(fā)性成分分析

在正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的萃取條件下，對(duì)小羅傘根揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，總離子流圖TIC見圖6。通過GC-MS分析、計(jì)算機(jī)檢索和NIST譜庫比對(duì)，共鑒定出27個(gè)化合物，含量1%以上的成分見表3，主要為-古巴烯（27.59%）、水楊酸甲酯（9.04%）、-姜黃烯（8.58%）、-雪松烯（8.46%）、順-卡拉馬尼烯等（6.91%）等。而產(chǎn)自廣西地區(qū)的小羅傘根揮發(fā)性成分主要有桉葉油醇（11.95%）、龍腦（8.51%）、喇叭茶醇（5.08%）等[4]，表明不同產(chǎn)地的小羅傘根揮發(fā)性成分存在一定的差異。

圖6 小羅傘根揮發(fā)性成分總離子流圖

表2 小羅傘根揮發(fā)性成分L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析表

表3 小羅傘主要揮發(fā)性化學(xué)成分及其相對(duì)含量

3 結(jié)論

與因素輪換實(shí)驗(yàn)法相比，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法具有工作量小、數(shù)據(jù)分析直觀簡便等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素實(shí)驗(yàn)考察不同萃取頭、萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、解吸時(shí)間等對(duì)小羅傘根部揮發(fā)性成分總峰面積的影響，初步優(yōu)化萃取條件，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，得到最優(yōu)萃取條件為：CAR/DVB/PDMS萃取頭，萃取溫度80℃、平衡時(shí)間20 min、萃取時(shí)間50 min、解吸時(shí)間4 min。

在小羅傘根的主要揮發(fā)性成分中，-古巴烯具有提高細(xì)胞抗氧化能力的功效[7]。水楊酸甲酯類物質(zhì)屬于非甾體抗炎藥，在臨床上常用于解熱，鎮(zhèn)痛和抗炎[8]。-檸檬烯是精油中常見的香氣成分，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用[9]。研究表明，香檸檬烯具有抗衰老功效[10]。雪松烯主要存在于雪松葉片中，具有抗炎、調(diào)節(jié)血糖等作用[11-12]。

綜上，本研究建立了一種基于HS-SPME-GC- MS技術(shù)的快速分析小羅傘根揮發(fā)性成分的方法，明確了羅浮山小羅傘根的揮發(fā)性成分，可為小羅傘藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，同時(shí)為進(jìn)一步挖掘其藥理作用提供科學(xué)依據(jù)。

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Optimization of Extraction Conditions of Volatile Components forLindl. Roots Based on HS-SPME-GC-MS

LI Deren BAI Tingting LI Xiaojia CHENG Baiji Lü Zhencheng

(School of Life Science, Huizhou University, Huizhou, Guangdong 516007, China)

To establish a rapid method for the determination of volatile components ofLindl. roots based on HS-SPME-GC-MS. Based on the single factor (polarity of extraction fiber, extraction temperature, extraction time, balance time, desorption time, etc.) experiments, the total peak area was carried out as index,an9(34) orthogonal experiments were carried out to optimize the extraction conditions. The optimum conditions were as follows: CAR/DVB/PDMS extraction head, temperature of 80 ℃, equilibrium time of 20 min, extraction time of 50 min and desorption time of 4 min. Under these conditions, 27 volatile components were identified fromLindl. roots, they were mainly-cubanene (27.59%), methyl salicylate (9.04%),-curcumene (8.58%) and-cedarene (8.46%). The results can provide scientific basis for rapid analysis of the volatile components ofLindl. roots.

roots; volatile components; HS-SPME-GC-MS; optimization of extraction conditions

S567.19

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2022.06.016

2022-02-28；

2022-03-16

廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金項(xiàng)目（No.pdjh2020b0566）。

李德仁（1999—），男，在讀本科，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)，E-mail：hzubio@126.com。

呂鎮(zhèn)城（1982—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)，E-mail：szsky@126.com。

（責(zé)任編輯 林海妹）